Метод проницаемости от Дрозофилы Эмбрионы для анализов малых молекул деятельности

Drosophila эмбрион продолжает оставаться одним из ведущих модель для исследования фундаментальных механизмов развития ^2. Это мощная модель поддерживается широкий спектр молекулярно-генетических инструментов, которые позволяют манипуляции практически любого гена в любой момент времени и в любой развивающейся органа. Небольшой размер, быстрое развитие, а также обширные характеристика морфогенеза эмбриона дрозофилы сделать его модель выбора для генетических экранов, многие из которых раскрыты фундаментальные онтогенетических путей ^3,4. Многочисленные фенотипы в зародыше дрозофилы были охарактеризованы и легко интерпретируемых, часто предоставляя средства идентификации основные молекулярные генетические механизмы, ответственные за ненормального признака.

Исторически сложилось так, недостатком модели эмбриона мухи была трудность введения небольших молекул для эмбриональных тканей. Это препятствие поставил ограничения на: 1) насING известные биологически активные малые молекулы в качестве зондов допросить механизмы развития и 2) с помощью этой сложившейся модели для оценки тератогенным или фармакологическую активность неохарактеризованных малых молекул. Как следствие, скрининг потенциал летучей эмбриона было недостаточно в характеристике активности малой молекулы.

Доставка малых молекул в летучей эмбриона может быть достигнуто с двумя способами: 1) проницаемости яичной скорлупы и 2) микроинъекции. В данной статье представлены авансы методом проницаемости, которые легко выполнить в условиях обычного Drosophila лаборатории. Следует отметить, что последние достижения в методах микроинъекций с микрофлюидики технологии также способствует способов введения соединений в эмбриона ^5,6. Введение в молекулы эмбриона предотвращается восковым слоем скорлупы ^7. Drosophila яичной скорлупы состоит из пяти слоев. Отнаизнанку они: желточной оболочки, восковой слой, внутренняя хорионический слой, endochorion и exochorion ^8. Три внешних хориона слои могут быть удалены путем краткого всплытии эмбриона в разбавленной хлорной извести, шаг называют dechorionation. Подвергается восковой слой может затем быть нарушена под воздействием органических растворителей, таких как гептан и октан ^7,9, что делает dechorionated эмбрион проницаемой, пока он остается заключен в основной желточной оболочки. Тем не менее, использование этих растворителей вводит осложнения из-за их токсичности и трудности в регулировании их решительные меры permeabilizing, оба из которых имеют сильнейшие негативные последствия для жизнеспособности эмбриона ^9,10.

Способ проницаемости с использованием композиции называют эмбриона пермеабилизации растворитель (EPS) был описан ранее ^1. Этот растворитель состоит из D-лимонен и растительного происхождения, поверхностно-активные вещества, которые позволяют растворитель быть misciblе с водных буферах. Низкая токсичность д-лимонен и способности разбавить растворителем в требуемой концентрации дала эффективный способ для генерации проницаемые эмбрионов с высокой жизнеспособности ^1. Однако два эндогенные факторы по-прежнему приводить ограничения к применению. Во-первых, эмбрионы продемонстрировать неоднородность проницаемости после EPS лечения, даже когда осторожность, чтобы поддерживать тесные постановку развития. Во-вторых, эмбрионов старше примерно восьми часов доказали, трудно проницаемыми, в соответствии с упрочнения яичной скорлупы, которое происходит после откладки яиц ^11.

Описанный здесь достижения в методе EPS, что: 1) содействие в выявлении и анализе почти одинаково проницаемыми эмбрионов, даже после фиксации и Иммуноокрашивание шаги были выполнены и 2) позволяют пермеабилизации эмбрионов на поздних развития временных точках (> 8 ч, этап 12 лет и старше). В частности, применение дальним красным красителем,Cy5 карбоновой кислоты, описано, что служит индикатором проницаемости, который сохраняется в эмбрионе во время разработки и после формальдегида фиксации. Кроме того, показано, что выращивание эмбрионов при 18 ° С сохраняет яичную скорлупу в чувствительной государства EPS, позволяя пермеабилизации поздних эмбрионов на стадии (стадий 12-16).

Эти достижения преодолеть ранее упомянутые ограничения в методологии EPS. Таким образом, эта программа будет оказывать следователям с помощью ввести небольшие молекулы, представляющие интерес для эмбриона на отдельные развития временных точках, сохраняя жизнеспособность.

1. Подготовка Fly культур, решений и эмбрионов обрабатывающих устройств

1. Подготовить клетку культуру дрозофилы. Поместите 500 + спаривания мух желаемого напряжения в популяции клетку, снабженную 10 см винограда-агар пластины и пятно дрожжевого теста. Поддерживать культуру в 25 ° C Влажность контролируемой инкубатора. ПРИМЕЧАНИЕ:   Кейдж культуры требуют день или два кондиционирования получить последовательные эмбриона укладки узоры. Виноградные пластины с дрожжевой пастой меняются один раз утром и один раз вечером во время выдержки.
2. Подготовка EPS. Теплые решения ПАВ (кокамид DEA и этоксилированный спирт) при 37 ° С. Внесите 18 мл д-лимонен в стеклянной сцинтилляционный флакон, снабженный небольшим мешалкой. Внесите 1 мл каждый из двух поверхностно-активных веществ (5% конечная концентрация каждого) до Д-лимонен. Тщательно перемешать и снять мешалку. ПРИМЕЧАНИЕ: Это исходный раствор EPS хорошо в течение приблизительно 2 месяцев при комнатной температуре. РешениеСледует нагревали при 37 ° С и вращают, чтобы полностью растворить поверхностно-активных веществ перед использованием. EPS и D-лимонен следует хранить в стеклянной емкости, поскольку они растворится некоторые пластмассы с течением времени.
3. Подготовка эмбрион dechorionation решение, инкубационных сред, краситель и решения наркотиков. Смешайте 25 мл отбеливателя с 25 мл H ₂ O и место в неглубокую посуду. Подготовка модифицированный основной инкубационный среды (MBIM) и MBIM-T в соответствии с предварительного рецепта ^1,12. Подготовка Шилдс и Sang M3 клеточной среде культуры и PBS в соответствии с протоколом производителя (см. список материалов). Подготовка исходного раствора пермеабилизации красителя в 10 мМ концентрации в ДМСО.
4. Соберите эмбрион-обрабатывающие устройства и материалы:
   1. Подготовка dechorionation и корзину EPS лечения (см. рис 1А). Отрежьте 3 см раздел одноразового 50 мл полипропиленовой центрифуги / пробирку с мелкими зубьями пилы. Сделать сварочного поверхности флеш потерев раздел трубки на наждачную бумагу, приклеенныйк настольной поверхности. Weld сечение трубы, чтобы NITEX нейлоновой сетке путем расплавления край отрезка трубки над пламенем и нажав на сетке на стеклянную пластину. Дайте остыть и обрезать дополнительную сетку. ПРИМЕЧАНИЕ: отвесные бортов и днища позволяют быстрого и полного промывания от остаточного отбеливателя и EPS на соответствующих этапах. Шаги сварочные следует проводить под вытяжкой.
   2. Подготовка корзинку развития. Отрежьте верхнюю часть 50 мл центрифуги / пробирку заподлицо с ободом крышки. Удалить и изменить крышку путем вырезания центральное отверстие и пазы по окружности, как показано на рисунке 1b. Прикрутите крышку над сеткой и на резьбу отрезать сечению трубы и отделка дополнительный сетку. ПРИМЕЧАНИЕ: крышка содержит выемки в ободе, что разрешить диффузии с объемной среде, когда они расположены в 60 мм водохранилища блюдо (рис. 1В ').
   3. Подготовьте компоненты слайд камеры. Вырежьте квадрат DO мембраны, размер которых превышаетслайд камера открытие. Нанесите очень тонкий слой вакуумной смазки к внутренней кромке отверстия. Прикрепите мембрану DO в отверстие уплотнительного его против жира с фиксирующим кольцом. Обрежьте излишки DO мембрану за счет сокращения его обратно близко к фиксирующим кольцом. ПРИМЕЧАНИЕ:. Технические требования к слайд-камеры можно найти в Kiehart др. ¹³ Эта камера не является коммерчески доступных и требует специального изготовления с помощью механического цеха.

2. Постановка, Dechorionation и EPS Лечение эмбрионов

1. Постановка эмбрионов путем приурочен коллекции. Установите свежий виноград / дрожжей пластину к лету культуры клетке в AM. Разрешить эмбрионов, которые будут установлены в течение 1 часа при 25 ° С. Сбросьте эту пластину и заменить свежим винограда / дрожжей пластины для последующего эмбриона прокладке 2 ч при 25 ° С Соберите эту пластинку и место в 18 ° С инкубатор для дальнейшей постановки развития. Примечание: 1 час развития при 25 ° С равна 2 ч. развитияпри 18 ° C. Эффект старения при 18 ° С против 25 ° С на поддержание EPS пермеабилизации в конце эмбрионов на стадии можно видеть на рисунке 2.
2. Dechorionation. Аккуратно промойте эмбрионов от виноградного пластины в сетчатую корзину, используя 25 ° C водопроводной воды и кисть. Промыть избыток дрожжей от эмбрионов в корзине под слабой струей водопроводной воды. Погрузите корзину в 50% гипохлоритом натрия в течение 2 мин. Вымойте эмбрионов тщательно под струей воды из-под крана. ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно шприц раствор отбеливателя на зародышах периодически с помощью пластиковой пипетки. В то время как 2 мин, как правило, достаточно для полной dechorionation, на этот раз инкубации должны быть проверены прямого допроса и соответствующим образом скорректированы. Поддержание dechorionated эмбрионов в корзине, погруженной в водопроводной воде и немедленно перейти к шагу EPS.
3. EPS Лечение
   1. Подготовка шесть 60-мм чашки с примерно 10 мл ФБС в каждом. Подготовить разведение EPS путем растворения 75 мкл EPS в 2,925 мл MBIM (1:40) в 50 мл стеклянном стакане с закрученной. Примечание: белая эмульсия формы из этой смеси.
   2. Блот избыток воды из нижней части корзины сетки с лаборатории салфеткой. Погружают корзины в разбавленных EPS в химический стакан и сразу вихревой разойтись эмбрионы в растворе EPS в нижней части корзины. Продолжить закрученного движение в течение 30 сек. ПРИМЕЧАНИЕ: EPS разведения и время экспозиции может изменяться контролировать проницаемость. Рекомендуется, чтобы оптимальные EPS разведения и время обработки быть установлено эмпирически с штаммов мух используются. Увеличение времени экспозиции 60-90 сек благоприятен для стадии 12 и более старых эмбрионов.
   3. Удалить корзины, промокните нейтрализуют избыточные EPS с лабораторией уничтожить. Продолжайте шести последовательных промываний в 10 мл PBS в 60 мм чашки. С помощью пластиковой пипетки осторожно шприц эмбрионов с PBS в каждую из шести стирок. Продолжать красить и шаги наркологические. ПРИМЕЧАНИЕ: EPS могут быть утилизированы в раковину.

3. Краска и лекарствами Лечение проницаемыми эмбрионов

1. Краска Лечение
   1. Добавьте 5 мкл 10 мМ Cy5 краситель кислота * карбоновой в 1 мл MBIM-T (50 мкМ конечная концентрация) в 1,5 мл пробирке и вихревые перемешать. ПРИМЕЧАНИЕ: * Выбор красителя зависит от нисходящего анализа. Cy5 карбоновой кислоты является эффективным для последующего анализа с помощью фиксации и иммуноокрашивания. Родамина B полезен для анализа живых эмбрионов. Красный излучение родамина В, а зеленый выброс его метаболитов ^1, может представлять определенные трудности с последующих применений с использованием флуоресценции. Наркотиков или токсин может быть добавлен в раствор краски, чтобы начать лечение на этой стадии, или ограничить обращение наркотиков / токсина в импульс на данном этапе. Следует проявлять осторожность в обращении и утилизации лекарств и токсинов в соответствии с MSDS и стандартов экологической безопасности.
   2. Трансфер эмбрионов из корзины сетки к решению красителя помощью кисти. Закройте пробирку крышкой и инвертировать несколько раз, чтобы убедиться,эмбрионы в свободное плавание, взвешенная в раствор краски. Поместите трубку на нутационное качалке в течение 15 мин при комнатной температуре.
   3. Удалить трубку от nutator и пусть эмбрионы урегулировать. Удалить раствор красителя с тонкой пипетки и заменить 1 мл MBIM-T для мытья. Обратить трубки повторно приостанавливать эмбрионов полностью. Пусть эмбрионы решить и повторить еще три MBIM-Т стирок. Удалите все MBIM-T от окончательного полоскания и перейти к стадии инкубации.
2. Инкубационный для развития эмбриона
   1. Трансфер эмбрионов к одному из двух палат: Корзина развитие или слайд камеры. ПРИМЕЧАНИЕ: Корзина развитие является предпочтительным для более длительных периодов развития, и не требуется, если последующие фиксации и Иммуноокрашивание шаги должны быть выполнены. Слайд камера является оптимальным для покадровой съемки с большим разрешением и является наиболее эффективным для коротких периодов развития (например, ранних эмбриональных событий). Drug или токсин может быть добавлен в среду в различных концентрациях и эмбриона DАЗВИТИЕ можно отслеживать в режиме реального времени с живыми эмбрионами или в конечной точке с помощью стандартного фиксацию и иммуноокрашивания протоколы.
   2. Развитие в корзины
      1. Очистите корзины развития, впрыскивая с 70% этанола, тщательно промыть деионизированной водой и промокните насухо протрите лаборатории. Подготовка 6 мл инкубационной среды с требуемой концентрации препарата или токсина. Поместите корзины развития в среде, в 60 мм блюдо заботясь, чтобы не пузырьки воздуха ловушку под основанием сетки. ПРИМЕЧАНИЕ: Два СМИ широко используются: в одиночку MBIM или MBIM/M3 в 50:50, причем последний более эффективен в течение более длительных периодов развития.
      2. Трансфер проницаемыми эмбрионов сетка поверхность в базе корзины с кистью. Аккуратно шприц эмбрионов со средствами массовой информации из окружающего пласта. Дисперсные эмбрионов с помощью кисти, чтобы они были в монослое на сетке. ПРИМЕЧАНИЕ: Перейдите к визуализации микроскопии и оценивать пермеабилизации и жизнеспособности характеристики пр.eparation (см. шаг 4).
   3. Развитие в Slide палаты
      1. Инверсия слайд камеру и применить небольшую полоску вакуумной смазки по периметру отверстия. Поместите 150 мкл среды с желаемым количеством препарата или токсина на поверхности DO мембраны в открытии. ПРИМЕЧАНИЕ: Два СМИ широко используются: в одиночку MBIM или MBIM/M3 в 50:50, причем последний более эффективен в течение более длительных периодов развития.
      2. Трансфер проницаемыми эмбрионов к падению СМИ с кистью. Дисперсные эмбрионов делает их поселиться на мембраны внутри капли.
      3. Осторожно применять 25 мм круговой покровное над отверстием таким образом уплощения среды. Нажмите вниз осторожно по периметру покровное для формирования уплотнения с жиром. ПРИМЕЧАНИЕ: Перейдите к микроскопии изображений для оценки проницаемости и жизнеспособности характеристики подготовке (см. шаг 4).

4. Identiкация проницаемыми жизнеспособных эмбрионов

1. Определить проницаемыми эмбрионов. Соблюдайте эмбрионов под эпифлуоресцентной с микроскопа, снабженного цифровой камеры. Получение изображений (в синей волны для определения профиля желток аутофлюоресценция) нескольких полей с помощью фиксированного микроскоп и настройки камеры.
2. Определите пермеабилизации эмбрионов на основе относительной интенсивности флуоресценции. Используйте стереомикроскопа с большим рабочим расстоянием для размещения корзинку и позволить манипуляции эмбрионов. Микроскоп должен быть оснащен программируемым стадии XYZ, эпифлуоресцентной освещения и цифровой камеры. Изображение эмбрионы, заботящиеся записывать экспозиции и параметры положения этап каждого эмбриона изображение, чтобы позволить переоценку тех же эмбрионов на более позднем этапе (см. представительный результат на рисунке 3). ПРИМЕЧАНИЕ: Модели поглощени красител будет варьироваться в зависимости от используемого красителя, продолжительности воздействия и эмбриона возраста. Широкий спектрпоглощения красителя через одном препарате характерно и отражает изменение в степени проницаемости.
3. Определить жизнеспособных эмбрионов. После маркировки положение пермеабилизированных эмбрионов, продолжить развитие эмбриона при комнатной температуре или 25 ° С. Вернуться корзины или слайд-камеру с микроскопом. Соблюдайте под синей флуоресценции канала и приобрести имидж желтка автофлуоресценции в ранее выявленных пермеабилизированных эмбрионов. Оценка жизнеспособности в соответствии с нормальным развитием распределения желтка (см. Рэнд и др.. ¹ и характерный результат, на рисунке 3). ПРИМЕЧАНИЕ: Другие морфологические особенности эмбриона, наблюдаемой с светлого микроскопии может быть использован для оценки жизнеспособности. Рекомендуется, чтобы установить уровень проницаемости, который совместим с жизнеспособностью быть определены эмпирически с каждым красителем и штамма, используемого лету.
4. Оцените наркотиков или токсинов эффекты в пермеабилизированных жизнеспособных эмбрионов.
5. Эмбрионы процеSSED с выше протокол готовы для ряда обычных анализов после препарата или токсина воздействия. Некоторые из различных видов анализа рассматриваются в обсуждение ниже и включают непосредственное наблюдение формообразования в живых эмбрионов, а также пост-фиксация иммуноокрашивание анализов. Оба этих подхода усиливаются использованием витальных красителей (например, GFP), которые показывают генные паттерны экспрессии и клеточной линии и профили морфологии.

Обработки эмбрионов устройства изображены на рисунке 1 для оказания помощи в визуализации "самодельные" устройства для манипулирования в вышеуказанных протоколов. Результаты видно на рисунке 2 иллюстрируют надежную эффект воспитания эмбрионов при 18 ° С от их способности быть проницаемыми по EPS на поздних стадиях развития. Это условие применяется на стадии протокола 2.1. Эффективность красителя Cy5 карбоновой кислоты, чтобы выявить различные уровни проницаемости обычно видели в EPS обработанные эмбрионов видно на рисунке 3. Динамика развития распределения красителя в желтке также видно на рисунке 3, открывая критерий, используемый для оценки жизнеспособности , как описано в Протоколе шагу 4.2. Полезность Cy5 красителя в определении эмбриона пермеабилизации последующей обработки для токсина, формальдегида фиксации и иммунным окрашиванием иллюстрируется результате на рисунке 4.

Рисунок 2. Влияние старения при 18 ° С в EPS эффективности в конце эмбрионов на стадии. Эмбрионы были собраны в течение двух часов с последующим старением при 18 ° С в течение 20 часов (Панели AA ", (Панель CC"). Эмбрионы при 18 ° С были затем dechorionated и разделен на два образца. Первый образец обрабатывают непосредственно 1 мМ родамина B красителя в MBIM-T в течение 5 мин, промывали и визуализировали под светлое и синий и красный флуоресцентные каналов (Панель AA "). Второй образец обрабатывали EPS (1:10 в MBIM в течение 1 мин), промывают, а затем обрабатывают 1 мМ родамина B в течение 5 мин и промывают перед визуализацией (Панель BB »). Эмбрионы, поднятые при 25 ° С были dechorionated и обрабатывают непосредственно EPS (1:10 в MBIM в течение 1 мин), промывают, а затем обрабатывают 1 мМ родамина B в течение 5 мин перед визуализацией (Панель CC "). Эмбрионы были определены как на этапе 14 на сгибах в кишечнике, обнаруженные на желтка флуоресценции в синей канала (Панель A ', B', C '). Эмбрионы, поднятые при 18 ° С непроницаемы до EPS ЛЕЧЕНИИт, как видно по отсутствию Родамин B поглощения (Панель А "). EPS лечение 18 ° С эмбрионов дает высокую степень проницаемости, как видно по поглощению родамина В (Панель В »). Эмбрионы, поднятые при 25 ° С оставаться непроницаемой даже с EPS обработки, как показано на исключении родамина В (Панель С ").

Рисунок 3. Включение Cy5 в проницаемых и жизнеспособных эмбрионов. Эмбрионы собирали при 25 ° С в течение 2 ч и выдерживали в течение 14 ч при 18 ° С (эквивалент 7-9 час эмбрионов при 25 ° С, стадии 12). После dechorination, EPS лечение было сделано (1:40 в MBIM в течение 1 мин) с последующей инкубацией в Cy5 красителя (50 мкм MBIM-T в течение 15 мин). Эмбрионы промывали три раза в MBIM-T и переданы в корзину развития с MBIM в резервуаре. Разработка давали рroceed в течение 8 часов при комнатной температуре. Поглощение Cy5 (красный) изображается в дальней красной канала сразу после лечения красителя и промывки (Панель А) и после 8 развития ч (панель В). Распределение желтка рассматривается автофлуоресценции в синем канале. Краска поглощение, следовательно, проницаемость, видно, чтобы отличаться от эмбриона до эмбриона. Cy5 краситель (красный) видно, чтобы локализовать желтка (синий), который становится концентрируют в просвете кишечника на этапе 16 (фиолетовый, панель B).

Рисунок 4. Определение проницаемости и метилртути эффектов в фиксированных и иммуноокрашиванию эмбрионов. Эмбрионы были собраны при 25 ° С в течение 2 ч и выдерживали в течение 14 ч при 18 ° С (эквивалент 7-9 час эмбрионов при 25 ° С, стадии 12). После dechorination, EPS лечение было сделано (1:40 в MBIM в течение 1 мин) с последующей инкубацией вCy5 краситель (50 мкМ в MBIM-T в течение 15 мин) вместе с метилртути (50 мкМ MeHg, панель В) или управления (0,1% конечная концентрация, панель А) ДМСО растворителя. Эмбрионы промывали MBIM-T и помещают в корзину развития с MBIM: M3 среда в резервуаре и выдерживали в течение дополнительных 8 часов при комнатной температуре. Эмбрионы затем фиксировали в двухфазной 4% параформальдегида-гептан подготовки по стандартному протоколу 14. Окрашивание проводили с анти-Fasciclin II (зеленый в A, B и белой в А ', В') для обозначения моторных нейронов и анти-Elav антитела (красные в A, B), чтобы маркировать все нейрон клеточных тел. Cy5 краситель раскрывается путем прямого флуоресценции, которая требует длительного воздействия в связи со снижением интенсивности флуоресценции из-за фиксации (Cy5 является псевдо-синего цвета на всех панелях). Последствия MeHg видны в неправильной паттерна и clusteкольцо из боковых органов хордотональные нейрон клеток (Elav-положительных, маркированные красным и обозначается с белыми стрелками на B по сравнению с А). Кроме того, характерной разветвление сегментарной (SN) (сплошные зеленые стрелки в А ') Видно, что сильно варьирует с MeHg воздействия (сплошные зеленые стрелки в B ") в соответствии с ранее описанной последствий MeHg на эмбриона 15. Проекция межсегментных и сегментарной нервы на их корнях видны смещаться кзади с MeHg экспозиции (открыта зеленая стрелка в В '). Примечание: Метилртуть является мощный нейротоксин. Следует проявлять осторожность, чтобы носить перчатки и защиту для глаз при работе. Утилизация должна осуществляться через институциональной объекта экологической безопасности и сервиса.

Авторам нечего раскрывать.