Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Разработка IFN-γ ELISPOT Пробирной для оценки вирусом ветряной оспы конкретных клеточный иммунитет Вслед пуповинной крови трансплантации

14.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51643

⸱

9 июля 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Unité d'Immunopathologie Virale, Centre de Recherche du CHU Sainte-Justine, Department of Microbiology, Infectiology & Immunology, Faculty of Medicine, Université de Montréal, 2Infectious Diseases Service, CHU Sainte-Justine, Faculty of Medicine, Université de Montréal, 3Department of Paediatrics, Université de Montréal

В этой статье

Краткое содержание

Новые поколения функциональных анализов, таких как гамма-интерферона (IFN-γ) ELISpot, которые обнаруживают продукцию цитокинов на уровне одной клетки и обеспечить как количественную и качественную характеристику Т-клеточные ответы могут быть использованы для оценки клеточно-опосредованные иммунные реакции, направленные против ветряной оспы вирус (VZV).

Аннотация

Вирус ветряной оспы (ВВО) является одной из основных причин заболеваемости и смертности следующей пупочной трансплантации пуповинной крови (UCBT). По этой причине, противогерпетической профилактика администрируется систематически педиатрических получателей UCBT для предотвращения осложнений, связанных с VZV инфекции, но нет сильного и основанных на доказательствах мнение, что определяет его оптимальную продолжительность. Поскольку T клеточный иммунитет отвечает за контроль VZV-инфекции, оценка VZV воссоздание конкретных ответов Т-клеток следующее UCBT может обеспечить индикацию относительно того, профилактика должна быть сохранена или может быть прекращено. С этой целью VZV специфический гамма-интерферон (IFN-γ) фермент-связанный ImmunoSpot (ELISpot) был разработан анализ для характеристики производства IFN-γ Т-лимфоцитами в ответ на стимуляцию в пробирке с облучаемой живой аттенуированной вакцины VZV. Этот препарат обеспечивает быстрое, воспроизводимое и чувствительное измерение VZV конкретного слокоть иммунитет подходящий для мониторинга воссоздание VZV специфического иммунитета в клинических условиях и оценки иммунологическую реактивность к ВВЗ антигенов.

Введение

Сначала выполненный в 1989 году, UCBT все шире используется как часть лечении различных опухолевых и неопухолевых заболеваний крови у детей 1. ВВО является цитопатический человеком alphaherpesvirus который вызывает два различных заболеваний, ветряной оспой (после первичного инфицирования) и опоясывающий лишай (после реактивации). После первичной инфекции, ВВО сохраняется в течение всей жизни хозяина защищенном пределах чувствительных нервов ганглиях задних корешков. Одним из наиболее опасных инфекционных осложнений после UCBT связан с VZV 2-4. В нашем клиническом центре, в отсутствии VZV профилактики, кумулятивное падение заболевания VZV болезни VZV на 3 года postUCBT составила 46% 2. У этих больных, заново инфекция или реактивация ВВЗ часто ассоциируется с висцеральной распространения в центральной нервной системе, легких и печени 5-7. В результате, ацикловир, валацикловир или фамцикловир профилактика обычно управляются с UBПолучатели CT 8,9. Однако, эта стратегия лечение не принимать во внимание защитный потенциал VZV специфических Т-лимфоциты или кинетики воссоздания VZV конкретных ответов Т-клеток. Потенциальные проблемы, связанные с расширением использования долгосрочных противогерпетических профилактики включают) избыточного лечения пациентов; б) развитие устойчивость к противовирусным препаратам 10,11; и в) нарушение VZV специфического иммунного восстановления 12,13. Поскольку обнаружение функциональных VZV специфических Т-лимфоцитов коррелирует с наличием долгосрочного защиты от VZV-инфекции и улучшению клинического исхода 4,14,15, мониторинг клеточно-опосредованный иммунный ответ, направленные против VZV в течение периода после трансплантации может привести к более рациональному использованию противовирусных лечение, позволяя практикующих врачей, чтобы отличить пациентов, которые больше всего выигрывают от ВВЗ профилактика от тех, чья иммунная система способна контролировать VZV репликации 4,13.

ИФН-γ ELISpot анализ широко используется для мониторинга клеточных опосредованных иммунных реакций в различных экспериментальных систем и клинических условиях. Пятна образуются после расщепления хромогенного субстрата, создавая видимый осадок и стабильной в месте реакции. Каждый человек место, таким образом, представляет собой след отдельного цитокинов производящих клетки. IFN-γ ELISpot не только измеряет способность отдельных клеток экс виво для получения IFN-γ в ответ на стимуляцию в пробирке с антигеном, но она также обеспечивает оценку частоты реагирует клетки в данной популяции клеток 16,17. В дополнение к своей высокой чувствительности, IFN-γ ELISpot проста для выполнения, что делает возможным его использование в контексте персональной клинических протоколов, направленных на руководящих инициирование или прекращение противовирусного лечения. Процедура подробно описаны ниже описания тогоэс анализ ELISpot, которая специально предназначена для обнаружения и измерения производство IFN-γ на мононуклеарных клеток периферической крови после стимуляции в пробирке с ВВО, полученных антигенов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол исследования был одобрен Советом по Институциональная Этика рассмотрению CHU Sainte-Justine, Монреаль, Квебек, Канада, где проводилось исследование. Информированное согласие было запрошено и получено от всех участников исследования, их родителей или законных опекунов. Все процедуры выполняются в дни 1 и 2 должны выполняться в стерильных условиях (т.е. при ламинарном боксе). Стандартные процедуры безопасности при работе человеческой крови должны строго соблюдаться.

1. Покрытие пластин

  1. Проницаемыми поливинилидендифторид (ПВДФ) мембраны в нижней части 96-луночных MultiScreen IP белый ELISPOT пластин путем добавления в каждую лунку по 20 мкл 35%-ного этанола в течение 1 мин. Мембраны должны стать слегка прозрачным.
  2. Немедленно промыть лунки три раза 200 мкл 1х забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS; 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na 2 HPO 4, 2 мМ KH 2 PO 4, рН 7,4) с использованием MULtichannel пипетки или подобное устройство. Этот шаг имеет решающее значение, учитывая, что этанол остатки могут повлиять на жизнеспособность клеток и связывание захвата антитела. ELISpot плиты хрупки и следует обращаться осторожно: использование автоматизированной пластины шайбой не рекомендуется.
  3. Покрытия лунок с 10 мкл очищенного мышиного антитела против человеческого захвата IFN-γ антитела, разведенного в 1х PBS до конечной концентрации 10 мкг / мл. Обложка пластин с регулярной полиэтиленовой пленкой и инкубировать в течение ночи при 4 ° С.

2. Блокировка плиты

  1. Слейте скважин, нажав им высохнуть, и мыть пластины 5 раз с 200 мкл 1x PBS.
  2. Заполните лунки 200 мкл полной среды RPMI 1640 и инкубируют пластинки в течение 2 часов при 37 ° С (блокирование шаг).
  3. Вымойте планшеты 5x 200 мкл 1x PBS и держать скважин полон 1x PBS, пока клетки готовы быть покрыты.

3. Сотовый Покрытие и стимулирование

  1. Подготовьте рeripheral мононуклеарные клетки крови (РВМС) из проб венозной крови человека центрифугированием на Ficoll-Paque градиентов использованием стандартных методик. Кроме того, с использованием стандартных методов, оттаивать аликвоты РВМС замороженных в жидком азоте. После того, как последние центрифугирования, ресуспендирования клеток в конечной концентрации 2 х 10 6 клеток / мл и инкубировать в течение ночи при 37 ° С в 5% CO 2 атмосфере в водяной рубашке инкубатора.
  2. Удалить РВМС из инкубатора и ресуспендируют их в конечном объеме 5 мл полной среды RPMI 1640.
  3. Выдержите РВМС в присутствии 10 мкл генной инженерии эндонуклеазы из Serratia marcescens в течение 5 мин при комнатной температуре.
  4. Удаление 50 мкл аликвоты РВМС и смешать с 50 мкл трипанового синего красителя. Граф клеток и оценить% жизнеспособность помощью гемоцитометра и микроскопическое исследование (метод исключения красителя). Различные автоматизированные методы подсчета и оценки жизнеспособности клеток всегда может клетоктак быть использованы. РВМС должно быть> 95% жизнеспособны. Отменить образец когда жизнеспособность ниже, чем 95%.
  5. Центрифуга РВМС при 700 х г в течение 5 мин, отбросить супернатант и ресуспендируют клеток в AIM-V среде, дополненной 2% (об / об) инактивированной сыворотки крови человека (его) в конечной концентрации 2 × 10 6 клеток / мл. Хранить при температуре 37 ° С до стимуляции смеси не будут добавлены к пластине.
  6. Добавить в лунки, одну каплю за один раз, 100 мкл соответствующей стимуляции смеси. Три стимуляции смеси следует использовать, как описано ниже:
    1. Использование AIM-V среде, дополненной 2% (об / об) инактивированной сыворотки крови человека (IHS) в качестве отрицательного контроля.
    2. Использование анти-CD3 моноклональные антитела (клон ОКТ3), разведенного в AIM-V среде, дополненной 2% (об / об) IHS в конечной концентрации 0,5 мкг / мл в качестве положительного контроля).
    3. Используйте VZV антиген, в форме либо γ-облучении (10000 Гр; 30 мин время экспозиции) живая ослабленная VZV вакцины (1350 бляшкообразующих единиц [PFU] / мл) DiluTed 1:200 в AIM-V среде, дополненной 2% (об / об) IHS) или 1 мкг эквимолярной смеси 67 пептидов (15 аминокислотных остатков), синтезированного на основе последовательности VZV немедленно раннего (IE63) фосфопротеин . Контроль облучения эффективность путем мониторинга отсутствие видимых признаков цитопатических эффектов после 4 дней в РВМС культур.
    4. Подготовьте все лунки в двух экземплярах.
  7. Добавить в лунках, по одной капле за раз 100 мкл клеток, полученных на шаге 5,4 в соответствующие лунки. Две скважины должны быть оставлены без клеток (отрицательный контроль). Выдержите в течение 20 часов при температуре 37 ° С в 5% CO 2 атмосфере в водяной рубашке инкубатора. Не трясите, двигаться, или стек пластин на верхней части друг с другом во время инкубации.

4. Спот Разработка и обнаружения

  1. Отменить клетки и промывают пластины 10 раз с 1x PBS с добавлением 0,05% (объем / объем) Твин 20 (PBST). Твин 20 помогает отделить клетки, которые, прилипшие к PVDF меняmbrane следующие инкубации в течение ночи.
  2. Использование многоканальную пипетку, добавьте 100 мкл 0,5 мг / мл биотин сопряженных анти-IFN-γ моноклональное антитело (клон 4S.B3) разводили в 1 × PBS, содержащим 0,5% (вес / объем) бычьим сывороточным альбумином (BSA). Инкубируют планшеты в течение 2 ч при комнатной температуре.
  3. Промыть лунки 6x с PBST и добавить каждую лунку по 100 мкл стрептавидин conjugatd щелочной фосфатазой разбавленного 1:1000 в 1 × PBS, содержащим 0,5% (вес / объем) БСА. Крышка пластины и инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре.
  4. Вымойте планшеты 3x ЗФРТ и 3x с 1x PBS. Добавьте 100 мкл 5-бром-4-хлор-3-индолил фосфат (BCIP) / нитро синий тетразол хлорид (NBT) раствора субстрата и инкубировать 5 мин при комнатной температуре.
  5. Вымойте тарелки под проточной дистиллированной воды. Извлеките нижнюю секцию ELISpot пластины и промыть обе стороны мембраны с дистиллированной водой. Воздух сухой тарелки.
  6. Изучите скважин и перечислить пятна с помощью стереоскопического дissection микроскоп или сканировать тарелки с использованием автоматического пятно счетчик. Держите пластины от света, если они не могут быть рассмотрены в тот же день.
    1. Среднее значение на основании количества пятен, подсчитанных в соответствующих дублирующих лунках и вычесть количество пятен, подсчитанных в отрицательных контрольных лунок (без клеток) из числа подсчитанных пятен в тестовых скважин.
    2. Экспресс IFN-γ производства как количество спот-единиц (СФУ) на 10 6 РВМС.
    3. Рассмотрим, что тестовые образцы положительны, если количество SFU составляет> 50 10 6 РВМС и 2 стандартных отклонений (SD) выше отрицательного контроля (клетки + AIM-V среде, дополненной 2% (об / об) IHS).
    4. Используйте значение 400 ЮФУ на лунку, когда пятна слишком много, чтобы пересчитать.
  7. Проверьте, работают ли данные ELISpot нормально распределены или нет, используя тест Колмогорова-Смирнова. Когда данные распределены по нормальному закону, выполнять статистические сравнения с помощью т Tes Стьюдентат (2 группы) или ANOVA и пост-тест Бонферрони (множественные сравнения). Если данные не являются нормально распределенными, использовать тест Манна-Уитни U (2 группы) или тест Крускала-Уоллиса и пост-тест Данна (множественные сравнения).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

IFN-γ ELISpot протокол описано выше был разработан и оптимизирован в нашей лаборатории, чтобы измерить величину и качество клеток, опосредованных иммунных ответов, направленных против VZV 4. Различные источники VZV антигена может быть использован на стадии стимуляции. К ним относятся: а) в продаже моющие инактивированные выдержки из ВВЗ инфицированных клетках Веро 18; б) бассейны перекрывающихся синтетических пептидов от конкретных ВВО кодируемых белков, в том числе IE63 15 и ORF4 1...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Изменения и устранение неисправностей: ИФН-γ ELISPOT анализы были использованы для изучения клеточно-опосредованные иммунные реакции, направленные против различных патогенных микроорганизмов, в том числе вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) 24,25, вирус гепатита С (HCV) 26, 27 и микобактерии туберкулеза 28,29, просто назвать несколько. Здесь мы описали разработку IFN-γ ELISpot анализа для измерения клеточный иммунитет против, с надеждой на определении корреляты VZV спец...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить участников исследования и их родителей. Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Режан Lapointe (CHUM Notre-Dame, Монреаль, Канада) для доступа к его ELISpot читателя, д-р Любо Александрова для статистического анализа, и Денис Blais, Сандра Кэрон, Сильвия Валуа и Мартин Caty для экспертно-техническое помощь. При поддержке грантов от ле Fonds d'операции налить ле PROJETS по исследованиям Clinique др. d'Evalution DES технологий (ЧУ Sainte-Justine) для HS и ПО, по-ла Fondation Centre де cancérologie Charles-Бруно, а к лейкемии и лимфомы общества Канада. МФС была поддержана стипендии от ла Fondation CHU Sainte-Justine и ле Fonds де-ла-Recherche Квебека-Здоровье (FRQS). AJG был удостоен стипендии от кафедры микробиологии, инфектологии и иммунологии, Университета Монреаля (Gabriel-Маркиз стипендий), FRQS, и канадские институты здравоохранения Rсследования (CIHR). Н.М. поддержали ла Fondation CHU Sainte-Justine, Коула Foundation, и FRQS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Пробирка с лейкоцепомVWR89048-936/89048-932В зависимости от объема крови можно использовать пробирки объемом 12 мл или 50 мл.
Ficoll-PaqueGE Healthcare17-1440-02Защита от света.
Бензоназа нуклеазаNovagen70746-3держится на уровне -20 °C.
MultiScreenHTS-IP Фильтрующая пластинаMilliporeMSIPS4W10стерильная с размером пор 0,45 мкм.
Мышиный антитело к человеческому ИФН- и гамма-захватуBD Biosciences551221клон NIB42.
Pepmix VZV IE63 JPT Peptide TechnologiesPM-VZV-IE63Растворить содержимое одного флакона в 40 μ л ДМСО. Использовать в течение 6 месяцев.
Биотин-конъюгированное анти-ИФН-&гамма-моноклональное антителоклон BD Biosciences5545504SB3.
Стрептавидин конъюгирован со щелочной фосфатазой Bio-Rad Life Science170-3554Разбавить для использования в тот же день.
BCIP/NBT Bio-Rad Life Science170-6432Защита от света.

Ссылки

  1. Ballen, K. K., et al. Umbilical cord blood transplantation: the first 25 years and beyond. Blood. 122 (4), 491-498 (2013).
  2. Vandenbosch, K., et al. Varicella-zoster virus disease is more frequent after cord blood than after bone marrow transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (8), 867-871 (2008).
  3. Barker, J. N., et al. Serious infections after unrelated donor transplantation in 136 children: impact of stem cell source. Biol. Blood Marrow Transplant. 11 (5), 362-370 (2005).
  4. Merindol, N., et al. Reconstitution of protective immune responses against cytomegalovirus and varicella zoster virus does not require disease development in pediatric recipients of umbilical cord blood transplantation. J. Immunol. 189 (10), 5016-5028 (2012).
  5. Feldman, S., et al. Varicella in children with cancer: Seventy-seven cases. Pediatrics. 56 (3), 388-397 (1975).
  6. Arvin, A. M. Varicella-Zoster virus: pathogenesis, immunity, and clinical management in hematopoietic cell transplant recipients. Biol. Blood Marrow Transplant. 6 (3), 219-230 (2000).
  7. Wiegering, V., et al. Varicella-zoster virus infections in immunocompromised patients - a single centre 6-years analysis. BMC Pediatr. 11, 31 (2011).
  8. Boeckh, M., et al. Long-term acyclovir for prevention of varicella zoster virus disease after allogeneic hematopoietic cell transplantation--a randomized double-blind placebo-controlled study. Blood. 107 (5), 1800-1805 (2006).
  9. Boeckh, M. Prevention of VZV infection in immunosuppressed patients using antiviral agents. Herpes. 13 (3), 60-65 (2006).
  10. Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: a global perspective. Biol. Blood Marrow Transplant. 15 (10), 1143-1238 (2009).
  11. Ljungman, P., et al. Long-term acyclovir prophylaxis in bone marrow transplant recipients and lymphocyte proliferation responses to herpes virus antigens in vitro. Bone Marrow Transplant. 1 (2), 185-192 (1986).
  12. Selby, P. J., et al. The prophylactic role of intravenous and long-term oral acyclovir after allogeneic bone marrow transplantation. Br. J. Cancer. 59 (3), 434-438 (1989).
  13. Distler, E., et al. Recovery of varicella-zoster virus-specific T cell immunity after T cell-depleted allogeneic transplantation requires symptomatic virus reactivation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (12), 1417-1424 (2008).
  14. Levin, M. J., et al. Decline in varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity with increasing age and boosting with a high-dose VZV vaccine. J. Infect. Dis. 188 (9), 1336-1344 (2003).
  15. Jones, L., et al. Phenotypic analysis of human CD4+ T cells specific for immediate-early 63 protein of varicella-zoster virus. Eur. J. Immunol. 37 (12), 3393-3403 (2007).
  16. Czerkinsky, C., et al. Reverse ELISPOT assay for clonal analysis of cytokine production. I. Enumeration of gamma-interferon-secreting cells. J. Immunol. Methods. 110 (1), 29-36 (1988).
  17. Hutchings, P. R., et al. The detection and enumeration of cytokine-secreting cells in mice and man and the clinical application of these assays. J. Immunol. Methods. 120 (1), 1-8 (1989).
  18. De Castro, N., et al. Varicella-zoster virus-specific cell-mediated immune responses in HIV-infected adults. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 27 (10), 1089-1097 (2011).
  19. Jones, L., et al. Persistent high frequencies of varicella-zoster virus ORF4 protein-specific CD4+ T cells after primary infection. J. Virol. 80 (19), 9772-9778 (2006).
  20. Malavige, G. N., et al. Viral load, clinical disease severity and cellular immune responses in primary varicella zoster virus infection in Sri Lanka. PLoS One. 3 (11), (2008).
  21. Sadaoka, K., et al. Measurement of varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity: comparison between VZV skin test and interferon-gamma enzyme-linked immunospot assay. J. Infect. Dis. 198 (9), 1327-1333 (2008).
  22. Smith, J. G., et al. Development and validation of a gamma interferon ELISPOT assay for quantitation of cellular immune responses to varicella-zoster virus. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8 (5), 871-879 (2001).
  23. Ouwendijk, W. J., et al. T-cell immunity to human alphaherpesviruses. Curr. Opin. Virol. 3 (4), 452-460 (2013).
  24. Rowland-Jones, S. L., et al. Cytotoxic T cell responses to multiple conserved HIV epitopes in HIV-resistant prostitutes in Nairobi. J. Clin. Invest. 102 (9), 1758-1765 (1998).
  25. Alter, G., et al. Human immunodeficiency virus (HIV)-specific effector CD8 T cell activity in patients with primary HIV infection. J. Infect. Dis. 185 (6), 755-765 (2002).
  26. Lechner, F., et al. Analysis of successful immune responses in persons infected with hepatitis C virus. J. Exp. Med. 191 (9), 1499-1512 (2000).
  27. Fournillier, A., et al. A heterologous prime/boost vaccination strategy enhances the immunogenicity of therapeutic vaccines for hepatitis C virus. J. Infect. Dis. 208 (6), 1008-1019 (2013).
  28. Adetifa, I. M., et al. Interferon-γ ELISPOT as a biomarker of treatment efficacy in latent tuberculosis infection: a clinical trial. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187 (4), 439-445 (2013).
  29. Lalvani, A., Pareek, M. A 100 year update on diagnosis of tuberculosis infection. Br. Med. Bull. 93, 69-84 (2010).
  30. Berger, R., et al. A dose-response study of a live attenuated varicella-zoster virus (Oka strain) vaccine administered to adults 55 years of age and older. J. Infect. Dis. 178 Suppl. 1, (1998).
  31. Trannoy, E., et al. Vaccination of immunocompetent elderly subjects with a live attenuated Oka strain of varicella zoster virus: a randomized, controlled, dose-response trial. Vaccine. 18 (16), 1700-1706 (2000).
  32. Brunner, K. T., et al. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
  33. Moretta, A., et al. Quantitative assessment of the pool size and subset distribution of cytolytic T lymphocytes within human resting or alloactivated peripheral blood T cell populations. J. Exp. Med. 158 (2), 571-585 (1983).
  34. Jung, T., et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 159 (1-2), 197-207 (1993).
  35. Maecker, H. T., et al. Standardization of cytokine flow cytometry assays. BMC Immunol. 6, 13 (2005).
  36. Nomura, L., et al. Standardization and optimization of multiparameter intracellular cytokine staining. Cytometry A. 73 (11), 984-991 (2008).
  37. Letsch, A., Scheibenbogen, C. Quantification and characterization of specific T-cells by antigen-specific cytokine production using ELISPOT assay or intracellular cytokine staining. Methods. 31 (2), 143-149 (2003).
  38. Merindol, N., et al. Umbilical cord blood T cells respond against the Melan-A/MART-1 tumor antigen and exhibit reduced alloreactivity as compared with adult blood-derived T cells. J. Immunol. 185 (2), 856-866 (2010).
  39. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  40. Scriba, T. J., et al. Ultrasensitive detection and phenotyping of CD4+ T cells with optimized HLA class II tetramer staining. J. Immunol. 175 (10), 6334-6343 (2005).
  41. Stone, J. D., et al. Interaction of streptavidin-based peptide-MHC oligomers (tetramers) with cell-surface TCRs. J. Immunol. 187 (12), 6281-6290 (2011).
  42. Pantaleo, G., et al. Evidence for rapid disappearance of initially expanded HIV-specific CD8+ T cell clones during primary HIV infection. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94 (18), 9848-9853 (1997).
  43. Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat. Immunol. 12 (6), 492-499 (2011).
  44. Boulet, S., et al. A dual color ELISPOT method for the simultaneous detection of IL-2 and IFN-gamma HIV-specific immune responses. J. Immunol. Methods. 320 (1-2), 18-29 (2007).
  45. Ahlborg, N., Axelsson, B. Dual- and triple-color fluorospot. Methods Mol. Biol. 792, 77-85 (2012).
  46. Precopio, M. L., et al. Immunization with vaccinia virus induces polyfunctional and phenotypically distinctive CD8(+) T cell responses. J. Exp. Med. 204 (6), 405-1416 (2007).
  47. Sadzot-Delvaux, C., et al. Recognition of the latency-associated immediate early protein IE63 of varicella-zoster virus by human memory T lymphocytes. J. Immunol. 159 (6), 2802-2806 (1997).
  48. Malavige, G. N., et al. IE63-specific T-cell responses associate with control of subclinical varicella zoster virus reactivation in individuals with malignancies. Br. J. Cancer. 102 (4), 727-730 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Анализ ELISpot на ИФН-гаммаответ Т-лимфоцитовстимуляция антигеном VZVдетекция ИФН-гаммавыделение PBMCподсчет пятенCD4+ Т-клетки
Разработка IFN-γ ELISPOT Пробирной для оценки вирусом ветряной оспы конкретных клеточный иммунитет Вслед пуповинной крови трансплантации
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.