Методическая статья

Новый Разъяснение Метод визуализировать Желчная дегенерации Во печени Метаморфозы в море Минога ( Petromyzon Маринус)

DOI:

10.3791/51648

⸱

6 июня 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Fisheries & Wildlife, Michigan State University, 2Hammond Bay Biological Station, Great Lakes Science Center, U.S. Geological Survey

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Море минога потерять желчный пузырь и желчные протоки во время метаморфоза, процесс, аналогичный атрезия желчных путей человека. Новый фиксация и метод разъяснения (ясность) был изменен, чтобы визуализировать весь желчевыводящих путей с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Этот метод представляет собой мощный инструмент для изучения желчных вырождение.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Атрезия желчевыводящих путей является редким заболеванием младенчества, по оценкам, 1 в 15 000 частоты в юго-восточной США, но чаще встречается у стран Восточной Азии, с отчетным частотой 1 на 5000 в Тайване. Хотя многое известно об управлении атрезия желчных путей, его патогенез до сих пор не удается. Море минога (Petromyzon Маринус) предоставляет уникальную возможность изучить механизм и прогрессирование желчных дегенерации. Море минога развивать через три различных стадиях жизни: личинок, паразитарных и взрослых. Во время перехода от личинок паразитических несовершеннолетнего, море минога претерпевают метаморфоз с драматическим реорганизации и реконструкции в внешней морфологии и внутренних органов. В печени, весь билиарной системы теряется, в том числе желчного пузыря и желчных протоков. Недавно разработанный метод называется "Clarity" был изменен, чтобы уточнить всю печень и слияния с кишечника в метаморфических моря миноги.Процесс желчных дегенерации визуализировали и различить во моря миноги метаморфозы с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Этот метод представляет собой мощный инструмент для изучения атрезия желчных путей в уникальном животной модели.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Море минога развивать через три различных этапам жизни 1,2. Личинок морского минога (L) проводят больше всего времени в норах, как донных фильтраторов. Пройдя через семь метаморфических этапов драматических изменений во внешней морфологии и реорганизации в внутренних органов 3, в результате несовершеннолетние (СП) введите паразитический этап, в течение которого они питаются кровью и тканевой жидкости из рыбы-хозяина, увеличивая массы тела более чем в 100 раз . После 1,0 до 1,5 лет, питающихся рыбы-хозяина в океане или крупных озер, взрослые перестают кормление во время ранней весной и мигрируют в реки на нерест, а потом умирают 1,2.

Во время метаморфоза, море минога печени теряет желчный пузырь и весь желчных дерево, эволюционный мутантный фенотип, который имитирует человеческие болезни младенец атрезия желчных путей. Младенческая атрезия желчных путей является редким детской болезнью печени с тяжелыми осложнениями 4,5,6,7, 8,9,10, однако патогенез и этиология атрезия желчных путей в значительной степени неизвестны 4. Пациенты с атрезия желчных путей умирают в течение двух лет после рождения, если хирургическое вмешательство (процедура Касаи) не выполняется 5. Впоследствии, эти пациенты требуют обширного клинического ведения и часто трансплантации печени 6. Многие теории атрезия желчных путей этиопатогенезе были предложены, например, вирусной инфекции, врожденных пороков развития, аутоиммунного заболевания, и токсичных оскорбление. Тем не менее, вклад каждого в развитие атрезия желчных путей остаются неубедительными 7,8,9,10.

В отличие от детей, которые страдают патологической атрезия желчных путей, море минога подвергаются умственно запрограммирован атрезия желчных путей без обширного некротического воспаления, фиброза или цирроза 10. Животные могут страдать переходных холестаз во время этого процесса 10, но адаптироваться к этому условию развитияDe Novo через синтез и секрецию солей желчных кислот в кишечнике после развития желчных атрезии, в дополнение к известных механизмов, таких как снижение синтеза желчных солей в печени 11. Это развития процесса в морской миноги предоставляет единственный известный возможность изучить прогрессирование атрезия желчных путей.

Недавно разработанный метод называется "Clarity" позволяет с высоким разрешением изображения в сложных млекопитающих нервной системы путем трансформации неповрежденной ткани в оптически прозрачной нанопористой гидрогеля 12. Использование море печень миноги и модифицированный протокол ясности нетронутыми тканей визуализации желчевыводящих дегенерации может быть документированы в течение метаморфоза печени.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка решения

  1. Сделать 1 л 10x 0,1 М фосфатный буфер солевой раствор (PBS, рН 7,4): Взвешивают 26,2 г фосфата натрия (одноосновного), 115 г фосфата натрия (двухосновный) и 87,66 г NaCl. Растворите в около 800 мл дистиллированной H 2 O, отрегулировать рН и довести объем до 1 л дистиллированной H 2 O.
    1. Сделать 1 л 0,1 М фосфатного буфера растворе (рН 7,4): Возьмите 100 мл 10x PBS и добавьте 900 мл дистиллированной H 2 O.
    2. Сделать 1 л 0,1 М фосфатного буфера растворе (рН 7,4) с 0,1% Тритон Х-100: Возьмите 100 мл 10x PBS, добавить 1 мл Тритон Х-100, и довести объем до 1 л дистиллированной H 2 O.
  2. Сделать 1 L 10x 0,1 М фосфатного буфера (PB, рН 7,4): Взвесить 26,2 фосфат г натрия (одноосновный) и 115 фосфат г натрия (двухосновный). Растворите в около 800 мл дистиллированной H 2 O, отрегулировать рН и довести объем до 1 л дистиллированной H 2 O.
    1. Сделать 1 L 0,1 М фосфатный буфер (рН 7,4): Возьмите 100 мл 10x PB,и добавить 900 мл дистиллированной H 2 O.
    2. Сделать 1 L 0,1 М фосфатный буфер (рН 7,4) с 0,1% Triton X-100: Возьмите 100 мл 10x PB, добавить 1 мл Тритон Х-100, и довести объем до 1 л дистиллированной H 2 O.
  3. Сделать 400 мл гидрогель мономерного раствора (4% акриламида, 0,25% бис-акриламида, 4% параформальдегид, 0,0075% персульфат аммония, 0,0005% сапонина в 0,1 М PBS): Взвешивают 0,3 г персульфата аммония и 0,2 г сапонин. Добавить 210 мл дистиллированной H 2 O, 40 мл 40% акриламида, 10 мл 2% бис-акриламида, 40 мл 10x PBS (рН 7,4), 100 мл 16% параформальдегид, и хорошо перемешать.
  4. Сделать 4 L клиринговой решение (4% SDS в 0,2 М борной кислоты): Взвесить 49,464 г борной кислоты и 160 г SDS. Растворите в 3,5 л дистиллированной H 2 O, отрегулировать рН до 8,5 с помощью NaOH, и довести объем до 4 L.
  5. Сделать 1 л 80%-ного раствора глицерина: Измерьте 800 мл глицерина, добавить 200 мл дистиллированной H 2 O, и хорошо перемешать.

2. Подготовка ткани

  1. Подготовка гидрогеля раствор мономера и аликвоты 10 мл к каждому 15 мл центрифужную пробирку.
  2. Проанализируйте всю ткань и закрепить в гидрогеля в течение 2 дней при 4 ° С. Убедитесь, что гидрогель решение, по крайней мере в 10 раз объем ткани.
  3. Принесите гидрогеля фиксированную ткани (в 15 мл трубки центрифуги), чтобы вытяжной шкаф.
  4. Полимеризации гидрогеля фиксированную ткань, добавив 5 мкл TEMED, хорошо перемешать, и пусть сидят в вытяжной шкаф при комнатной температуре в течение 2-3 часов.
  5. Снимите лишний гель тщательно. Примечание: Очень гель будет препятствовать процесса клиринга и проникновение антител во время окрашивания.
  6. Инкубируйте фиксированную ткани в 10 мл очистке раствора в инкубаторе шейкере при 70 оборотах в минуту и ​​50 ° С в течение нескольких дней, пока ткань не станет прозрачным. Изменение координационного решение, по крайней мере один раз в день и удалить избыток гель из ткани при изменении клиринговой решение.
  7. Промыть ткань в 10 мл 0,1 М PB с 0,1% Triton X-100 в 70 гм. и 37 ° С в течение ночи. Повторите этот шаг 3 раза и удалить избыток гель из ткани при изменении буферный раствор.
  8. Инкубируйте осветленной ткани в первичном раствора антител в ПК с 0,1% Triton X-100 при 70 оборотах в минуту и ​​37 ° С в течение 2 дней. Примечание: Оставьте достаточно решение первичного антитела, чтобы погрузить весь ткани.
  9. Промыть ткань в 10 мл PB с 0,1% Triton X-100 при 70 оборотах в минуту и ​​температуре 37 ° С в течение ночи. Повторите этот шаг 3 раза и удалить избыток гель из ткани при изменении буферный раствор.
  10. Выполните следующие действия в темной комнате или при слабом освещении. Обложка образцов с фольгой, чтобы предотвратить просмотром отбеливание.
  11. Инкубируйте осветленной ткани с флуоресцентным вторичного раствора антител в ПК с 0,1% тритона Х-100 и блокирующего сыворотки при 70 оборотах в минуту и ​​37 ° С в течение 1 дня.
  12. Промыть ткань в 10 мл PB с 0,1% Triton X-100 при 70 оборотах в минуту и ​​температуре 37 ° С в течение ночи. Повторите этот шаг 3 раза и удалить избыток геля еПЗУ ткани при изменении буферный раствор.
  13. Промыть ткань в 10 мл PBS при 70 оборотах в минуту и ​​температуре 37 ° С в течение ночи. Повторите этот шаг 3 раза и удалить избыток гель из ткани при изменении буферный раствор.
  14. Инкубируйте осветленной ткани в 80% глицерине при 70 оборотах в минуту и ​​температуре 37 ° С в течение ночи.
  15. Хранить флуоресцентный окрашенных тканей при 4 ° С до конфокальной микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несколько важных событий развития происходят в гепатобилиарной системы во время морской миноги метаморфозы. Желчных протоков и желчного пузыря подвергаются апоптозу и вырождаются (рис. 1). Объединение модифицированный метод осветления и окрашивания с печени клеточных маркеров цитокератина 19 (CK19, присутствующих в обеих холангиоцитах и гепатоцитов до и после метаморфозы 13) и антиапоптотического маркера Bcl2 помощью конфокальной микроскопии, весь желчной системы был захвачен по Z-оси (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол изменение от нового метода, называемого "ясности" 12, который сшивает интактной ткани с полиакриламида с образованием гидрогеля нанопористого, а затем убирает плазматическую мембрану ткани для достижения оптической прозрачности и макромолекул проницаемость. "Ясность" позволяет нетронутыми тканей визуализации проекции на большие расстояния и местного проводки цепи в нервной системе. Этот новый метод может быть использован для визуализации всей желчной системы в море миноги печ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы признают вклад Хаммонд Bay биологической станции, Научный центр Great Lakes, Геологическая служба США. Мы также благодарим д-р Мелинда кадр в Центре перспективных микроскопии Мичиганского университета за ее техническую поддержку в лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Это исследование поддержано грантами от Великих озер комиссии по рыболовству в YWCD и WML.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
40% акриламидаBio-Rad161-0140
2% бис-акриламид Bio-Rad161-0142
TEMEDBio-Rad161-0800
персульфат аммония СигмаА3678-25Г
борная кислотаСигмаВ7901-1КГ
сапонин;Sigma47036
додецилсульфат натрия SigmaL337-500G
фосфат натрия (одноосновный)Sigma04269-1KG
фосфат натрия (двухосновный)SigmaS5136-1KG
Triton X-100SigmaX100-500ML
глицерин SigmaG9012-500ML
16% параформальдегид Электронная микроскопия науки15710-S
Гранулы NaOH EMDSX0590-3
Центрифужные пробирки 15 мллюбой марки
 Любой бренд
Инструменты для препарирования

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Applegate, V. C. Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan. US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).
  2. Hardisty, M. W., Potter, I. C. The general biology of adult lampreys. The biology of lampreys. Hardisty, M. W., Potter, I. C. 1, New York Academic Press. 127-206 (1971).
  3. Youson, J. H., Potter, I. C. A description of the stages in the metamorphosis of the anadromous sea lamprey, Petromyzon marinus L. Can. J. Zool. 57, 1808-1817 (1979).
  4. Boomer, L. A., et al. Cholangiocyte apoptosis is an early event during induced metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L. J. Pediatr. Surg. 45, 114-120 (2010).
  5. Kasai, M., Suzuki, H., Ohashi, E., Ohi, R., Chiba, T., Okamoto, A. Technique and results of operative management of biliary atresia. World J. Surg. 2, 571-580 (1978).
  6. Suzuki, T., Hashimoto, T., Kondo, S., Sato, Y., Hussein, M. H. Evaluating patients’ outcome post-Kasai operation: a 19-year experience with modification of the hepatic portoenterostomy and applying a novel steroid therapy regimen. Pediatr. Surg. Int. 26, 825-830 (2010).
  7. Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. Biliary atresia. Lancet. 374, 1704-1713 (2009).
  8. Morecki, R., Glaser, J. H., Cho, S., Balistreri, W. F., Horwitz, M. S. Biliary atresia and reovirus type 3 infection. New Engl. J. Med. 307, 481-484 (1982).
  9. Shimadera, S., Iwai, N., Deguchi, E., Kimura, O., Fumino, S., Yokoyama, T. The inv mouse as an experimental model of biliary atresia. J. Pediatr. Surg. 42, 1555-1560 (2007).
  10. Sidon, E. W., Youson, J. H. Morphological changes in the liver of the sea lamprey, Petromyzon marinus L., during metamorphosis: I. Atresia of the bile ducts. J. Morphol. 177, 109-124 (1983).
  11. Yeh, C. -Y., Chung-Davidson, Y. -W., Wang, H., Li, K., Li, W. Intestinal synthesis and secretion of bile salts as an adaptation to developmental biliary atresia in the sea lamprey. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109, 11419-11424 (2012).
  12. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  13. Alarcón, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis. Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).
  14. Youson, J. H., Ogilvie, D. R. Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia. Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).
  15. Morii, M., et al. Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri. Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CLARITY MethodLaser Scanning Confocal MicroscopyImmunofluorescent StainingTissue ClearingHydrogel PolymerizationCytokeratin 19BCL TwoMetamorphic Stages

Похожие статьи