Здесь мы описываем метод визуализации на основе волоконной конфокальной флуоресцентной микроскопии (FCFM), который обеспечивает инновационный способ понимания физиологических явлений на клеточном и субклеточном уровнях у животных.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Химиотерапия индуцированных Сосудистая токсичность - в режиме реального времени
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Некоторые классы химиотерапии могут оказывать острые сосудистые изменения, которые могут прогрессировать в долгосрочных условий, которые могут предрасполагают пациента с повышенным риском сосудистых заболеваний. Тем не менее, хотя монтажной клинических данных, есть недостаток четких исследований сосудистой токсичности и, следовательно, этиологии гетерогенной группе сердечно-сосудистых заболеваний сосудов / еще предстоит выяснить. Кроме того, механизм, который может лежать в основе сосудистой токсичности может полностью отличаться от принципов, вызванной химиотерапией кардиотоксичности, которая связана с прямым ущербом миоцитов. Мы создали в режиме реального времени, в естественных условиях платформы молекулярной визуализации для оценки потенциального острая сосудистая токсичность противоопухолевых препаратов.
Мы создали платформу в естественных условиях, молекулярной визуализации высокого разрешения у мышей, подходит для визуализации сосудистую сеть в труднодоступных органов и справочных БлоOD судах, находящихся в одних и тех же лиц в то время как каждый человек служить ее собственным контролем. Кровь стенки сосудов отмечались нарушения после введения доксорубицина, представляющая собой уникальный механизм сосудистой токсичности, которые могут быть ранним событием травмы органов-мишеней. При этом метод расслаивается конфокальной флуоресцентной микроскопии (FCFM) на основе визуализации описано, которая обеспечивает новаторский режим, чтобы понять физиологические явления на клеточном и субклеточном уровнях в субъектах животных.
Введение
Клинические данные показывают, что несколько классов химиотерапии вызывают различные сосудистых патологий, проявляющихся в болезнь Рейно, гипертония, инфаркта миокарда, цереброваскулярные атаки, и печеночной вено-occlusivedisease 1,2. "« Случайных »антиангиогенные наркотики" является довольно новый термин, который описывает обычные химиотерапевтические средства, которые действуют в качестве возможных ингибиторов ангиогенеза, хотя они не первоначально разработана для этой цели 3-5, но предназначен для устранения опухолевых клеток путем введения всего "обеспечение ущерб "в нормальных клетках, как это возможно 3. Несколько химиотерапии были подразумеваемых, сосудисто-токсикантов, как отмечено в клинических исследованиях с использованием сыворотки биомаркеров. Среди них являются алкилирующие агенты (например, циклофосфамид), соединения платины (например, цисплатин) и антрациклинов 1,2,5-7.
Острые сердечно-сосудистые осложнения могут возникнуть в РЕЗУЛЬТАТОВт сосудистой токсичности, вызванной химиотерапией. Они могут прогрессировать в хронических заболеваний, как атеросклероз и учета повышенного риска поздних сосудистых осложнений. Тем не менее, несмотря на растущее клинических доказательств, есть нехватка назначенных исследований, подчеркивающих механизм сосудистой токсичности и поэтому далее в выяснение точного патогенезе они причиняют является оправданным.
Основная задача в выявлении механизма, вызванной химиотерапией сосудистой токсичности происходит от сложности исследования сосудистой функции в естественных условиях. Мы описываем здесь платформу с высоким разрешением в молекулярной визуализации естественных мышей, что позволяет захватить поток крови и характеристики судов. Эта платформа облегчает обнаружение прямых вызванных лечением сосудистых эффектов: в режиме реального времени, а также после них в течение периода времени в пределах одних и тех же лиц.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Заявление по этике: Все эксперименты были одобрены Комитетом по уходу и использованию Институциональная животного. Уход за животными было в соответствии с ведомственным руководящим принципам. ICR самок мышей (7 - 8 недель; 25 - 30 г) были размещены в кондиционерами, легких под контролем объектов животного в Sackler медицинского факультета в Тель-Авивском университете. В перспективе, животные были умерщвлены с анестезией передозировки.
1. расслоенных конфокальной флуоресцентной микроскопии (FCFM) Калибровка
- Включение и выключение устройства.
- Подключите микрозонд (mini0 / 30).
- Калибровка устройства в соответствии с инструкциями изготовителя.
2. Мыши Подготовка для работы с изображениями
- Обезболить путем подкожной инъекции, так Ketaset (100 мг / кг) и Xyl-M2 (6 мг / кг). Подтвердите надлежащего обезболивания по останову до пят-пинча.
- Надрезать кожу ниже паховой области с целью выявить бедренных артериальных сосудов. Держите место разреза влажная солевым раствором следующий разрез.
- Нагрейте хвост с помощью мешка (или перчатки), наполненную теплой водой (не слишком жарко, чтобы коснуться) в течение примерно 30 сек. Подготовка внутривенного (IV) шунт для введения декстрана (FITC контрастного вещества) и физиологического раствора или химиотерапевтическим агентом, путем вставки иглы (30 г, 1/2 дюйма) в хвостовую вену и присоединение 1 мл шприц с ним , Убедитесь, вены работает по инъекционного введения физиологического раствора.
Примечание: ВВ введение декстрана (FITC высокой молекулярной массой; 100 мкл; 10 мг / мл; 2000 кДа) облегчает визуализации бедренной микроциркуляторного русла по FCFM. Доксорубицин (100 мкл; 8 мг / кг, адриамицин) или физиологический раствор также будет позже вводили внутривенно в предварительно нагретой хвостовую вену. - Наведите указатель мыши безвольно на сцене полистирола. Безопасный мыши на площадку и поддерживать положение с помощью хирургической клейкой лентой.
ПРИМЕЧАНИЕ: расслоенных конфокальной микроскопии используется в данном исследовании состоит из двух блоков: (1) микрозонде (mini0 / 30). (2) Узел лазерного сканирования (LSU-488; 488 нм длина волны).
- Выполните все временные кругов анализ с использованием длины волны нм лазер ЛГУ 488.
ПРИМЕЧАНИЕ: главная детектор обнаруживает отфильтрованный (500 - 650 нм), излучаемый флуоресценции. Полученные изображения восстанавливаются после этого и отображается со скоростью 12 кадров / сек. - Отключите тщательно шприц с иглы и закрепите новый шприц, содержащий FITC декстран. Администрирование (IV) 100 мкл FITC декстрана.
- Сдвиг микрозонда (mini0 / 30) для подходящего поля зрения и зафиксировать его, после корректировки оси, с тем чтобы получить соответствующее изображение. Подождите исходного сигнала, чтобы исчезнуть, пока четкой и целенаправленной сигнал не VisiBLE.
- Запись исходных кровоток в течение короткого периода стабилизации (~ 30 секунд). Затем подсоединить к игле другой шприц, содержащий либо доксорубицин или физиологический раствор. IV управлять 100 мкл доксорубицин или физиологический раствор.
- Монитор потока впрыскиваемого FITC-декстрана непрерывно в течение 20 мин. На программное обеспечение FCFM ассоциированный с помощью кнопки диаметр на верхней линейке, чтобы измерить кровеносные сосуды и классифицировать их как малые (<15 мкм) или большие (> 15 мкм).
- Эвтаназии животное с анестезией передозировки.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В естественных условиях непрерывного отображения и в режиме реального времени
Устройство формирования изображения используется здесь, является высокой четкости, расслаивается конфокальный микроскоп, оснащенный зондом, который позволяет визуализировать сосудистую и его ответ на различные стимулы, как химиотерапии. Этот метод минимально инвазивной так, хотя это может облегчить визуализацию глубоких сосудов или органов, он требует небольшой разрез на зонде. Зонд пучки состоят из десятков ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Оценка вызванной химиотерапией сосудистой токсичности является сложной задачей из-за трудности в визуализации динамики сосудистой в ответ на раздражители в режиме реального времени. Многочисленные клинические исследования указывают на, что несколько химиотерапии привести к прямому повреждения сосудов, но механизм и характеристики этого токсичности еще предстоит выяснить. Мы установили в режиме реального времени, в естественных платформы молекулярной визуализации для оценки потенциальной токсичности сосудов хими...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| общая анестезия | Fort Dodge Animal Health, IA, США и Biove Laboratories, Франция | 100 мг/кг кетазет и 6 мг/кг крем для депиляции XYL-M2 | |
| (Veet) | ReckittBenckiser, Бристоль, Великобритания | ||
| 30 г, игла 1/2 дюйма, прикрепленная к шприцу | |||
| FITC декстран (10 мг/мл; МВт 2,000 кДа) | Sigma | FD2000S | 100 μ л объем |
| Доксорубицин | Тева, Израиль | 8 мг/кг, Адриамицин | |
| паклитаксел | Таро, Израиль | 1,2 мг/кг, Медексель | |
| физиологический раствор |
Ссылки
- Chow, A. Y., et al. Anthracyclines cause endothelial injury in pediatric cancer patients: a pilot study. J Clin Oncol. 24 (6), 925-928 (2006).
- Nuver, J., et al. Acute chemotherapy-induced cardiovascular changes in patients with testicular cancer. J Clin Oncol. 23 (36), 9130-9137 (2005).
- Vos, F. Y., et al. Endothelial cell effects of cytotoxics: balance between desired and unwanted effects. Cancer Treat Rev. 30 (6), 495-513 (2004).
- Kerbel, R. S., et al. 'Accidental' anti-angiogenic drugs. anti-oncogene directed signal transduction inhibitors and conventional chemotherapeutic agents as examples.Eur. J Cancer. 36 (10), 1248-1257 (2000).
- Soultati, A., et al. Endothelial vascular toxicity from chemotherapeutic agents: preclinical evidence and clinical implications. Cancer Treat Rev. 38 (5), 473-483 (2012).
- Tempelhoff, G. F., et al. Blood coagulation during adjuvant epirubicin/cyclophosphamide chemotherapy in patients with primary operable breast cancer. J Clin Oncol. 14 (9), 2560-2568 (1996).
- Ben Aharon, I., et al. Doxorubicin-induced vascular toxicity--targeting potential pathways may reduce procoagulant activity. PLoS One. 8 (9), e7515(2013).
- Laemmel, E., et al. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
- Al-Gubory, K. H., Houdebine, L. M. In vivo imaging of green fluorescent protein-expressing cells in transgenic animals using fibred confocal fluorescence microscopy. Eur J Cell Biol. 85 (8), 837-845 (2006).
- Bar-Joseph, H., et al. In vivo bioimaging as a novel strategy to detect doxorubicin-induced damage to gonadal blood vessels. PLoS One. 6 (9), e23492(2011).
- Kaushal, V., Kaushal, G. P., Mehta, P. Differential toxicity of anthracyclines on cultured endothelial cells. Endothelium. 11 (5-6), 253-258 (2004).
- Kim, E. J., et al. Doxorubicin-induced platelet cytotoxicity: a new contributory factor for doxorubicin-mediated thrombocytopenia. J Thromb Haemost. 7 (7), 1172-1183 (2009).
- Walsh, J., Wheeler, H. R., Geczy, C. L. Modulation of tissue factor on human monocytes by cisplatin and adriamycin. Br J Haematol. 81 (4), 480-488 (1992).
- Kotamraju, S., et al. Doxorubicin-induced apoptosis in endothelial cells and cardiomyocytes is ameliorated by nitrone spin traps and ebselen. Role of reactive oxygen and nitrogen species. J Biol Chem. 275 (43), 33585-33592 (2000).
- Vasquez-Vivar, J., et al. Endothelial nitric oxide synthase-dependent superoxide generation from adriamycin. Biochemistry. 36 (38), 11293-11297 (1997).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
