Изучение ДНК Looping на одиночных молекул FRET

Краткое содержание

Это исследование представляет подробный экспериментальную процедуру для измерения динамики Зацикливание двухцепочечной ДНК с использованием одиночных молекул флуоресценции резонансный перенос энергии (FRET). Протокол также описывает, как извлечь циклическую плотность вероятности называемый фактор J.

Аннотация

Гибка двухцепочечной ДНК (дцДНК) связана со многими важными биологическими процессами, такими как признание ДНК-белок и ДНК упаковки в нуклеосом. Термодинамика днДНК изгиба была изучена с помощью метода циклизации которая опирается на ДНК-лигазы ковалентно присоединиться короткие липкие концы двухцепочечной ДНК. Тем не менее, эффективность перевязки может зависеть от многих факторов, не связанных с двухцепочечной ДНК цикла, таких как структуры ДНК, окружающей присоединились липкие концы, и лигазы также может повлиять на видимую скорость перебора таких механизмов, как неспецифическое связывание. Здесь мы покажем, как измерить дцДНК LOOPING кинетики без лигазы путем обнаружения переходных образование петли ДНК по FRET (флуоресценции резонансный перенос энергии). дц-молекул ДНК построены с использованием простой ПЦР на основе протокола с парой рвать и биотин линкера. Цикла плотность вероятности известны как фактор J извлекается из перекручивания скорости и скорости отжига между двумя выключениеТед липкие концы. Тестируя два dsDNAs с различными внутренними кривизны, мы покажем, что фактор J чувствителен к внутренней форме двухцепочечной ДНК.

Введение

Понимание механических свойств двухцепочечной ДНК имеет принципиальное значение в основных инженерных приложений наук и. Структура двухцепочечной ДНК является более сложным, чем прямой винтовой лестнице, потому что углы крена, наклона и поворот между последовательными парами оснований могут варьироваться в зависимости от последовательности. Тепловые флуктуации могут привести к двухцепочечной ДНК пройти различные режимы конформационных колебаний, таких как гибка, скручивание и растяжение. Переходы, такие как плавление и изгибов может также происходить в экстремальных условиях.

Среди этих движений, двухцепочечной ДНК изгиб имеет наиболее заметное биологическое воздействие ^1. дцДНК изгиба связано с репрессии генов или активации путем приведения два отдаленных местах близко друг к другу. Он также играет важную роль в упаковке ДНК внутри ядра клеток или вирусного капсида. Гибка деформация дцДНК могут быть визуализированы экспериментально путем микроскопии высокого разрешения (АСМ ² и ³ ТЕА) и thermodynAmics и кинетика могут быть изучены с помощью цикла анализов, которые химически связывают Juxtaposed сайты в двухцепочечной ДНК.

Один из таких анализов является лигазы зависит от циклизации ^4. В этом анализе дц-молекул ДНК с "липкими" (липких) концах замыкают в цикл или димеризована ДНК-лигазы. Сравнивая показатели окружности и образование димера, можно получить эффективную молярную концентрацию одного конца ДНК в непосредственной близости от другого конца, который известен как фактор J. Этот фактор J по размерам эквивалентен плотности вероятности нахождения один конец ДНК на небольшом расстоянии с другого конца, и, таким образом, отражает гибкость ДНК. Измерение коэффициента J как функция длины ДНК показывает, многие характеристики около механики ДНК включая длину настойчивость ^4,5.

Червеобразные цепи (WLC) модель была широко рассматривается как канонического полимерной модели для двухцепочечной ДНК механики на основе его успеха в объяснениеining кривых сила-расширения, полученных в ДНК потянув экспериментов ^6, и правильно предсказывать факторы J из dsDNAs дольше, чем 200 б.п. ^7. Тем не менее, с помощью циклизации анализа на дц-молекул ДНК в виде коротких, как 100 б.п., Cloutier и Уидома измеряется факторы J быть на несколько порядков выше, чем предсказания WLC модель ^8. Через год, Du и др.. производится J факторы в согласии с моделью WLC с помощью циклизации анализа с более низкими концентрациями лигазы и отнести аномальную результат из группы Уидома высоких лигазы концентрациях используется ^9. Это противоречие является примером неизбежный влияние ДНК-лигазы на циклизации кинетики при использовании обычной анализа ^9. Кроме того, ДНК-лигазы может также повлиять на структуру ДНК и жесткость через неспецифическое связывание ^10,11.

Для устранения технических проблем белковых зависит от циклической обработки анализов, мы недавно продемонстрировали протЭйн-бесплатно петлеобразование анализ, основанный на флуоресценции резонансный перенос энергии (FRET) ^12. В этом методе петлей конформации обнаруживаются FRET между донором и акцептором прикрепленным вблизи липких концов молекулы ДНК. Объективная типа полное внутреннее отражение флуоресценции микроскоп (TIRFM) используется для записи траектории обратимого циклов и unlooping событий из поверхностных иммобилизованными одной молекулы ДНК в течение длительного периода времени. Этот метод имеет ПЦР на основе сборку молекул ДНК для создания несоответствия без молекулы ДНК, что является одним из важнейших улучшение по сравнению с аналогичным методом по Vafabakhsh и Ха ^13. Аспект одной молекулы этого протокола позволяет измерение распределений в дополнение к ансамблю в то время как сторона FRET позволяет измерять динамику Циклическое ДНК повторно с той же молекуле, даже в условиях, которые могут ухудшить лигазы активность.

Установка TIRFM показано на рисунке 1. ПользовательскийПродуманные этап образец помещают над микроскопа тела Olympus IX61. 532 нм и 640 нм лазеры введена со стороны, и отражаются от крошечных эллиптических зеркал ¹⁴ в высокой цели НС для достижения критического угла падения на поверхности раздела покровное воды. Отметим, что более широкое распространение сквозного цель TIR помощью дихроичных зеркал или призмы на основе МДП установок также могут быть использованы для этой FRET применения. Флуоресценции изображение, сформированное микроскопом разделен на донорных и акцепторных изображений по дихроичного зеркала. Затем они вновь отображены на двух половинок EMCCD. Дополнительные фильтры выбросов длинный-проход используются для уменьшения фонового сигнала.

Контроль температуры имеет важное значение для получения воспроизводимых кинетических данных. Для контроля температуры, цель отделена от носика тела микроскопа чтобы свести к минимуму передачу тепла и воды из контролируемой температурой холодильной отопителя / циркулирует через латунной воротник, который плотно облегаетвокруг внутренней металла под объективной куртки. Эта установка способна добиться надежного контроля температуры в покровное поверхности между 15 и 50 ° С (рис. 2). В этой работе, температура образца поддерживалась на уровне 24 ° С.

Следующий протокол представляет шаг за шагом процедуры для строительства ДНК, оценка формы ДНК, эксперимента одиночных молекул и определения коэффициента J.

Протокол

1. Подготовка днДНК Образец

1. Дизайн глобально изогнутые ДНК, повторяя последовательность из 10-мерный. Например, 5'-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCC X) ₇ - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 'представляет собой 186 п.н. ДНК изогнутые где X является случайной дополнительный база и последовательность фланговые повторяющуюся последовательность 10-мерный являются адаптер последовательности.
   ПРИМЕЧАНИЕ:. В этом примере два 10-меров с противоположными предпочтениями в нуклеосомной образования на основе масштабного нуклеосома размещение исследования Kaplan и др. ¹⁵ были выбраны. Поскольку винтовой повторение дцДНК близка к 10 п.о., любой чистый прогиб оси спирали от 10-мера будет накапливаться производить форму, как дуги окружности (фиг.3А). Поскольку винтовой период ближе к 10,5 п.н., дополнительный база вставляется после каждых двух повторов, чтобы сохранить изогнутую структуру, как плоских, насколько это возможно. Эти последовательности короче 200 б.п. можно заказать предприяс, что предложение ген синтеза обслуживание. Это удобно с фланга эти последовательности с общих последовательностей адаптер для последующих стадиях. Эта процедура схематически на фигуре 3В.
2. Выполните ПЦР с Primer 1 (GTGCCAGCAACAGATAGC) и Primer 2 (/ 5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG). Примечание: Праймер 2 помечен доноров Cy3 FRET на 5'-конце. Типичный ПЦР рецепт и протокол езда на велосипеде, представлены в таблицах 1 и 2.
3. Выполните ПЦР с праймером 3 (/ 5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC) и Primer 4 (CAACAACGAGCTCGAATG). Примечание: Праймер 3 помечен акцепторной Cy5 FRET через позвоночника и биотин-линкера в 5'-конце. ПЦР рецепт и протокол езда на велосипеде, как указано выше.
4. Очищают продуктов ПЦР с использованием набора для очистки ПЦР.
5. Смешайте Cy3-меченого продукта и Cy5-меченый продукт в буфер для обмена нити (100 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl рН 7,0, 1 мМ EDTA) при конечных концентрациях 0,4 и# 181, М и 0,1 мкМ соответственно. Примечание: избыток Cy3-ДНК увеличивает концентрацию дуплекса, несущей как Су3 и Cy5 в результате цепи обмена.
6. Курсы нити путем инкубации при 98,5 ° С в течение 2 мин, постепенно охлаждали до 5 ° C с градиентом скорости 0,1 ° С / сек и инкубированием при 5   ° С в течение 2 часов.

2. Геле для обнаружения двухцепочечной ДНК, кривизну

1. Налейте полиакриламидный гель смешением ^16,17 акриламид и бис-акриламида решения в соотношении 29.2:0.8, 5% (вес / объем) в 1X Трис / борат / EDTA (КЭ) буфере при рН 8,0. Примечание: 10 мл геля раствора содержит: 1,217 мл 40% акриламида, 0,667 мл 2% бис-акриламид, 1 мл TBE 10X, 100 персульфат L аммония (APS) 10%, 10 л TEMED, а остальное дН ₂ O. Полное затвердевание геля занимает около 30 мин.
2. Загрузить полиакриламидный гель с образцами ДНК и ДНК маркера в 1X загрузочным буфером (5% глицерина, 0,03% (вес / объем) бромфенола блUE) и запустить гель при 5-8 В / см при 4 ° С в течение 45 мин или до передней красителя приближается к концу геля.
3. Пятно гель с использованием 1X TBE буфер, содержащий бромистый 0,5 г / мл этидий течение 30 мин. Определить полосы ДНК при УФ-освещении. Сравните диапазона позиции с размером маркера (на 100 б.п. ДНК зачет) для расчета видимых размеров молекул ДНК. ПРИМЕЧАНИЕ: Изогнутые ДНК обычно двигаются медленнее, чем прямые ДНК.

3. Расход препарата клеточных

1. Дрель 6-7 пары отверстий вдоль двух противоположных краев предметное стекло (3'' х 1''), используя сверлильный станок и алмазные сверла. После сверления слайд в проточной воде, чтобы удалить видимые порошка стекла. ПРИМЕЧАНИЕ: Отверстия служат перфузии входов и выходов. Во время бурения, охлаждение слайд с водой важно для предотвращения растрескивания.
2. Поместите слайды вертикально в стеклянной банке и заполнить его водой. Разрушать ультразвуком в течение 15 мин и передавать их в другой стеклянной банке деdicated для очистки ацетона. Заполните его ацетоном и разрушать ультразвуком в течение 15 мин. Промыть слайды с этанолом с помощью пульверизатора, а затем водой. Поместите их в полипропиленовой банке, заполнить его с 5 М гидроксида калия и соникат в течение 15 мин. Наконец, разрушать ультразвуком слайдов в воде в течение 15 мин. Очистите покровные (№ 1, 24 х 40 мм), используя тот же протокол. ПРИМЕЧАНИЕ: Очищенные горки и покровные могут быть сохранены в дН ₂ O для долгосрочного использования.
3. Смешайте 1 мг биотин-ПЭГ-силана (MW 3400) с 80 мг MPEG-силана (МВт 2000) в 340 л 0,1 М раствора бикарбоната натрия. Хорошо перемешайте и центрифуги смеси кратко, чтобы избавиться от пузырьков. ВНИМАНИЕ: функционализации поверхности с полиэтиленгликолем (ПЭГ) помогает уменьшить неспецифического связывания ДНК на поверхность.
4. Положите 80 л раствора ПЭГ на каждом слайде и осторожно опустите покровное над ним. Подождите в течение 45 мин. Отделите покровное со слайда с помощью пинцета, промойте их обильным количеством дН ₂ O, и пусть тподол сухой на открытом воздухе.
5. Наведите тонких полосок дважды скотча по слайду, чтобы сформировать каналы. Совместите покровное над ним и плотно прижмите покровное против скольжения для формирования непроницаемого для жидкости каналов. Используйте 5 минутах эпоксидную смолу, чтобы запечатать края каналов.

4. Подготовка Trolox решения

1. Поместите ~ 30 мг Trolox и 10 мл дН ₂ O в колбу и использовать магнит мешалки перемешивают раствор в открытом воздухе в течение 18 часов.
2. Раствор фильтруют с помощью 0,2 мкм фильтр и доведения рН до 7 путем добавления ~ 6 мкл 1 М Трис-основание (рН 11). Примечание: Trolox является анти-мигает реагент, который обычно используется в одиночных молекул изучает ^18. Antifading действие Trolox исходит от его окисленного производного, которое присутствует в частично деградированной раствора Trolox ^19. Быстро растворения Trolox в метаноле или высокой раствора с рН Трис следует избегать из-за неэффективного окисления.

5. Одно-мольecule изображений

1. Введите 15 мкл раствора NeutrAvidin (0,5 мг / мл) в канал и ждать в течение 2 мин до промывки 100 мкл T50 буфера (10 мМ Трис-HCl, 50 мМ NaCl, рН 7,0).
2. Введите 50 мкл образца ДНК (50-100 пМ) в канал. Подождите 5 минут и промойте несвязанного ДНК от 100 л T50 буфера. Примечание: молекулы ДНК, специфически связываются с поверхности через NeutrAvidin-биотин взаимодействия.
3. Заполните канал с буфером изображения, который содержит систему поглощения кислорода ²⁰ (100 мМ PCD, 5 мМ PCA, 1 мМ Trolox, и 500 мм NaCl).
4. Установите EMCCD в режиме кадров передачи, чтобы поток 2 х 2 Binned изображений (256 х 256) к компьютеру при частоте 25 кадров в секунду.
5. Положите иммерсионное масло на объектив микроскопа, и исправить проточную ячейку на столик микроскопа с помощью образцы клипов. Грубый настроить фокус, глядя на лазер отражения картины на стене. Точно отрегулируйте фокус с помощью живой вид флуоресценции имвозраст на мониторе.
6. Начать сбор данных с 532 нм лазера на. Проверьте живой вид и настроить фокус, если необходимо. Остановить сбор данных, когда большинство молекулы photobleached.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом объекте, лаборатория написанная программа C контролировать микроскоп и отображать изображения в реальном времени на мониторе, как они сохраняются на жесткий диск используется.

6. Обработка изображений и анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: время серия 256 х 256 изображений обрабатываются кода MATLAB для создания одной молекулы времени следы Cy3 и Cy5 интенсивности. Для сопряжения пикселей между канала донором и акцептором канала сплит-просмотра изображения, 6-7 пары Cy3 и Cy5 пятен, каждая пара из той же молекулы равномерно рассредоточены по поле зрения, вручную выбрал, и аффинное преобразование рассчитывается с использованием координаты этих точек в качестве опорных точек.

1. Использование сценария MATLAB, просматривать все время одиночных молекул следы тшляпа шоу несколько переходы между низкими и высокими сигналов волнуйтесь. Определить петлей и unlooped государства.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сигнал FRET определяется как интенсивностью Cy5 (Я) делится на сумму Cy3 и Cy5 интенсивности (я + я _D). Изогнутая государство имеет высокое значение FRET а unlooped государство имеет низкое значение волнуйтесь. Гистограмма сигналов FRET из одной молекулы в бимодально распространяется из-за обратимой циклов и unlooping.
2. Найти порог, разделяющий два распределения путем определения пересечения между двумя встроенными кривых Гаусса.
3. Расчет эффективности волнуйтесь, как и назначить петлю государства с высокими значениями FRET и unlooped государств с низкими значениями волнуйтесь.
4. Использование сценария MATLAB, анализировать совокупное число молекул (N (T)), что петлю (илидостигли высокого состояния FRET) на различных упущений времени с момента начала сбора данных. ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку молекула двухцепочечной ДНК может начаться в любой конформации unlooped государства в начале сбора данных, темпы роста в зацикленной населения отражает скорость цикла среднее усредненное по начальным конформации. Извлеките циклическую тариф K _цикл по установке N (T) с экспоненциальной функцией: Если увеличивается biphasically, она может быть оснащена двойной экспоненциальной функции: В этом случае к _петля получается из: ПРИМЕЧАНИЕ: Теоретически, вероятность выживания, что полимер не передаются в момент времени т не одинарной или двойной экспоненциальной функцией ^12. Экспоненциальная ПригоночнаяIng используется в качестве практического средства для извлечения среднее время захвата петли.

7. Определение J-фактор

Примечание: Коэффициент J представляет, как концентрированный один конец дцДНК вокруг другого конца. Она может быть определена путем интерполяции концентрацию одной концевой сегмент ДНК, который будет производить ту же скорость реакции с другом сегменте как измеренной скорости перекручивания. Экспериментально один конец сегмента иммобилизуют на поверхности, а другой конец сегмента вводят в определенной концентрации с. Если измеренная скорость отжига между двумя концами является к _отжиг, то коэффициент ²¹ J дается . Константа скорости отжига (к = к _{отжига отжига} / C) не зависит от концентрации зонда.

1. Расход 20 мкл 30-50 пМ биотин-Cy5 олиго (Primer 3) яНТО канала в NeutrAvidin покрытием. Промойте канал с 100 мкл T50, чтобы смыть несвязанных олигонуклеотидов.
2. Готовят буфер визуализации, как описано в части 5 с добавлением Cy3 олиго (праймер 2) в конечной концентрации 50 нМ. Поток этот буфер изображений в канал.
3. Сохраняя 532 нм лазер на на, на короткое время выключить 640 нм лазер на на для определения мест поверхностных переплете Cy5 олигонуклеотидов. Выключите 640 нм лазер на и начать мониторинг сигнала волнуйтесь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При гибридизации олиго Cy3 к поверхности с привязкой Cy5 олиго, флуоресценция Су5 будут связаны с ладу.
4. Использование сценария MATLAB, проанализировать количество молекул, которые начинаются в свободном состоянии (низкой интенсивности Су5), но позже превращаются в отожженном состоянии (высокой интенсивности Cy5) как функция времени от следов интенсивности Cy5.
5. Участок этот ряд отожженных молекул в зависимости от времени. Установите эту кривую с одной экспонентой ( (к _{отжига).}
6. Повторите этот эксперимент в различных концентрациях Cy3 олиго (60, 100 и 180 нм), чтобы подтвердить линейность между скоростью отжига и концентрации реагентов. Выписка константу скорости отжига второго порядка (к _отжига ) Со склона.
7. Рассчитайте коэффициент J от , Где к _цикл цикл скорость измеряется в том же состоянии буфера.

Результаты

Молекулы ДНК, используемые для перекручивания исследования состоит из дуплексной области переменной последовательности и длины и одноцепочечных выступами, которые дополняют друг друга. Выступы, которые 7-основа долго, может отжига друг с другом, чтобы захватить петлю состояния. Каждый выступ содержит либо Су3 или Cy5, который связан в основной цепи ДНК через амидита химии. Су5-свес также связано с биотин-ТЭГ (15-атом Тетра-этиленгликоля спейсера) для поверхностной иммобилизации (см. рисунок 4А). Все эти...

Обсуждение

Простой анализ одиночных молекул на основе FRET был использован для изучения LOOPING кинетики ДНК различных внутренних форм. Изогнутые ДНК могут быть получены путем повторения последовательности 10-мерный в фазе с винтовой периода 10,5 п.н., и их кривизны можно оценить с помощью PAGE. Эти dsDNAs разработаны с липкими концами, чтобы обеспечить стабилизацию переходный цикл. Мы извлекли циклическую скорость от экспоненциального роста числа закольцованных молекул с течением времени. Константа скорости отжига между отключенн...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Small DNA FRAG Extract Kit-100PR	VWR	97060-558
Акриламид 40% раствор 500 мл	VWR	97064-522
Бис-акриламид 2% (w/v) раствор 500 мл	VWR	97063-948
GeneRuler 100.н. Лестница ДНК, 100-1 000.н.	Ферментас	SM0241
Мини вертикальная система PAGE	VWR	89032-300
Шприцевой фильтр 0,2 m CS50	VWR	A2666
Trolox	Sigma-Aldrich	238813-1G	Подавитель триплетного состояния
Протокатеховая кислота (PCA)	Sigma-Aldrich	08992-50MG	система поглощения кислорода
Протокатехуат 3,4-диоксигеназа (PCD)	Sigma-Aldrich	P8279-25UN	система поглощения кислорода
mPEG-силан, MW 2,000 1 г	Laysan Bio	MPEG-SIL-2000-1g
Biotin-PEG-Silane, MW 3,400	Laysan Bio	Biotin-PEG-SIL-3400-1g
Avidin, NeutrAvidin Biotin-связывающий белок	Invitrogen	A2666
Phusion Hot Start Высокоточная ДНК-полимераза	New England Biolabs	F-540L
Гель/ПЦР Набор для экстракции фрагментов ДНК	IBI Scientific	IB47020
Предметные стекла для микроскопа премиум-класса	Fisher Scientific	12-544-1
VWR микрозащитное стекло, прямоугольное, No 1	VWR	48404-456
Fisher Scientific Isotemp 1006S Рециркуляционный чиллер/нагреватель	Fisher Scientific		контроль температуры
Объективный охлаждающий воротник	Bioptechs	150303	контроль температуры
KMI53 Biological Микрометрический измерительный столик	Semprex	KMI53
Высокопроизводительный DPSS лазер 532 нм 50 мВт	Edmund оптика	NT66-968	Cy3 возбуждение
CUBE Fiber Pigtailed 640 нм, 30 мВт, волокно, FC/APC Connector	Coherent	1139604	Cy5 возбуждение
650 нм BrightLine Dichroic Beamsplitter	Semrock	FF650-Di01-25x36	расщепление дихроичный
Сумматор луча LaserMUX, отражает 514,5, 532 и 543,5 нм лазеры, 25 мм	Semrock	LM01-552-25	комбинированный дихроичный
Brightline Флуоресцентный фильтр 593/40	Semrock	FF01-593/40-25	Cy3 эмиссионный фильтр
635 нм EdgeBasic LWP длинночастотный фильтр, 25 мм	Semrock	BLP01-635R-25	Cy5 эмиссионный фильтр
EMCCD iXon+	Andor Technology	DU-897E-CS0-#BV
IX51 инвертированная рамка микроскопа	Olympus
Objective UApo N 100X/1.49 Масло TIRF	Olympus
Иммерсионное масло type-F для флуоресцентной микроскопии	Olympus	IMMOIL-F30CC
2 мм Диаметр 45° Стержневая линза с алюминиевым покрытием	Edmund optics	54-092	миниатюрное зеркало
1/4" Travel Одноосный трансляционный столик	Thorlabs	MS-1	перевод миниатюрного зеркала
Ø 1" Ахроматический дублет, ARC: 400-700 нм, f=200 мм	Фокусирующая линза	Thorlabs	AC254-200-A
Регулируемая механическая щель	Thorlabs	VA100
Диэлектрическое зеркало	Thorlabs	BB1-E02
Ø 1" Ахроматический дублет, f = 100 мм	Реле объектива Thorlabs	AC254-100-A
Крепление объектива для & Oslash; 1-дюймовая оптика	Thorlabs	LMR1
Крепление для дихроичного фильтра	Thorlabs	FFM1
Платформа с фиксированной клеткой Кубическая платформа	Thorlabs	B3C
Кинематическое крепление для ø 1" оптика	Thorlabs	KM100
N-BK7 плоско-выпуклый объектив, & Oslash; 1", f = 40 мм	Thorlabs	LA1422-A	коллимационная линза
N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø 6,0 мм, f = 15 мм	Thorlabs	LA1222-A	Telescope lens
N-BK7 Plano-Convex Lense, & Oslash; 6,0 мм, f = 150 мм	Объектив для телескопа	Thorlabs	LA1433-A