Методическая статья
Протокол обнаружить самореактивные лимфоциты CD4 в мозг и сердце путем прямого окрашивания главного комплекса гистосовместимости dextramers класс II был описан в настоящем докладе. Для всестороннего анализа, надежный способ перечислить частоты антиген-специфических CD4 + Т-клеток в месте также предназначен.
В этом отчете демонстрируется использование больших декстранеров комплекса гистосовместимости (MHC) класса II для обнаружения аутореактивных CD4 Т-клеток in situ в миелине, индуцированном протеолипидным белком (PLP), 139-151-индуцированным экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом (EAE) у мышей SJL и индуцированным сердечным миозином тяжелой цепью α (Myhc) 334-352-индуцированным экспериментальным аутоиммунным миокардитом (EAM) у мышей A/J. Использовали два набора коктейлей декстранмерных реагентов, в которых с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа (LSCM) анализировали клетки декстранеров+: EAE, ias/PLP 139-151 декстранеры (специфические)/анти-CD4 и IAs/вирус мышиного энцефаломиелита Тейлера (TMEV) 70-86 декстранеров (контроль)/анти-CD4; и EAM, IAk/Myhc 334-352 декстраны/анти-CD4 и IAk/бычья рибонуклеаза (РНКаза) 43-56 декстранеры (контроль)/анти-CD4. Анализ срезов мозга, полученных от мышей EAE, показал наличие клеток, положительных на CD4 и декстранеры PLP 139-151, но не на декстранеры TMEV 70-86, что позволяет предположить, что окрашивание, полученное с помощью декстранеров PLP 139-151, было специфичным. Аналогичным образом, срезы сердца, полученные у мышей с ЭАМ, также показали присутствие Myhc 334-352, но не РНКазы 43-56-декстрамер+ клеток, как ожидалось. Кроме того, был разработан комплексный метод количественного анализа частот антиген-специфичных CD4 Т-клеток на серийных изображениях «Z».
Использование главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса II тетрамерами обнаружения антиген-специфических CD4 Т-клеток был вызов 1-7. Для повышения чувствительности обнаружения тетрамеров МНС класса II, исследовательская группа создала тетрамеров нового поколения, предназначенные "dextramers" 8. Dextramers содержать декстран магистралей, в которой множество стрептавидином флуорофор фрагменты конъюгируют таким образом, что несколько пептидов привязи, биотинилированные мономеры МНС могут быть присоединены к одной молекуле декстрана 9. Таким образом, крупные агрегаты МНС dextramers, которые содержат несколько комплексов МНС-пепти....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Заявление по этике:
Все животные процедуры были проведены в соответствии с руководящими принципами для уходу и использованию лабораторных животных и одобрены Университета Небраска-Линкольн, Lincoln, NE.
1. Индукция EAE
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
В этом докладе, в обнаружении месте антигенспецифических, аутореактивных лимфоцитов CD4 путем прямого окрашивания dextramers МНС класса II описан. Свежесрезанных мозговые участки были получены от мышей EAE и окрашивали коктейлей, содержащих PLP 139-151 (специфические) или TMEV 70-86 (управление) dextramers и анти-CD4. Верхние панели на рисунке 1 показывает LSCM анализ мозга секций costained с PLP 139-151 dextramers (красный) и CD4 антитела (зеленый), где двойные-позитивные клетки появи.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
В отличие от I тетрамеров МНС класса, использование тетрамеров МНС класса II для обычных приложений продолжает оставаться сложной, особенно для перечисления частоты предшественники низкоаффинных аутореактивных лимфоцитов CD4, отчасти из-за их активации зависимости 6,15-17. В последнее время эта проблема была обойдена путем создания следующего поколения тетрамеров, под названием "dextramers," позволяя нам обнаружить антиген-специфических CD4 Т-клеток в течение ряда аутоантигенам, таких как PLP 139-15.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Нет конфликта интересов не объявлялись.
Эта работа была поддержана Американской ассоциации сердца и Детского кардиомиопатии Foundation (SDG2462390204001) и Национальных Институтов Здоровья (HL114669). CM является получателем докторской исследования стипендий гранта, предоставленного Миокардит фонда, Нью-Джерси.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| CFA | Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури | 5881 | Магазин в 4 ° C |
| MTB Экстракт H37Rv | Difco Laboratories, Детройт, Мичиган | 231141 | магазин по адресу 4 ° C |
| PT | List Biologicals Laboratories, Campbell, CA | 181 | Магазин at 4 ° C |
| 1x PBS | Corning, Манассас, Вирджиния | 21-040-CV | Магазин по адресу 4 ° C |
| Самка мышей A/J | Jackson Laboratories, Бар Харбор, ME | 646 | |
| Самки мышей SJL/J | Jackson Laboratories, Бар Харбор, ME | 686 | |
| Leur-lok стерильный 1 мл сирринг | BD, Франклин Лейкс, Нью-Джерси | 309628 | |
| Leur-lok стерильный 3 мл сирринг | BD, Франклин Лейкс, Нью-Джерси | 309657 | |
| Стерильная игла, 18 г BD | , Франклин Лейкс, Нью-Джерси | 305195 | |
| Игла стерильная, 27 1/2 г | BD, Франклин Лейкс, Нью-Джерси | 305109 | |
| 3-ходовой запорный кран | Smiths Medical ASD, Inc. Дублин, Огайо | MX5311L | |
| рулоны марлевой повязки Kerlix | Ковидиен, Мэнсфилд, Массачусетс | 6720 | |
| Кимвайпс | Кимберли-Кларк Professional, Розуэлл, Джорджия | 34155 | |
| Агароза, Низкая Температура плавления, Аналитический Класс | Корпорация Промега, Мэдисон, Висконсин | V2111 | |
| Иммуночистая нормальная козья сыворотка | Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс | 31873 | Хранить в -20 ° C |
| Антимышиный CD4 конъюгирован с полиэтиленовым красителем | eBioscience, Сан-Диего, Калифорния; | 12004185 | Магазин по адресу 4 ° C |
| Параформальдегидная | электронная микроскопия наук, Хатфилд, Пенсильвания | 19202 | Магазин в 4 ° C |
| Faramount Aqueous Mounting Medium | Dako, Карпинтерия, Калифорния | 10073021 | |
| Коническая трубка (15 мл) | BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния | 352099 | |
| Коническая трубка (50 мл) | BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния | 352070 | |
| 24-луночные планшеты для культуры тканей с плоским дном | BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния | 356775 | |
| Акварель #2 кисти | Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY | 73502 | |
| Простые предметные стекла для микроскопа, размер: 3" x 1" x 1,2 мм | Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания | 1255010 | |
| Премиальное защитное стекло, 22 x 22-1 | Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания | 12548B | |
| Одноразовые гистологические кассеты с глубоким основанием | Лабораторное производство, Рочестер, Нью-Йорк | M-475-10 | |
| Суперклей Loctite | Корпорация Хенкель, Уэстлейк, Огайо | 1471879 | |
| Бритвенные лезвия | Gillette SuperSilver | ||
| Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) | Неопептид, Кембридж, Массачусетс | Магазин на 4 ° C | |
| PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) | Неопептид, Кембридж, Массачусетс | Магазин на 4 ° C | |
| MHC класс II/IAs PLP 139-151 или TMEV 70-86 декстранеры, сопряженные с красителем | Хранить при 4 ° C | ||
| MHC класс II/IAk Myhc 334-352 или РНКаза 40-56 декстранеров, сопряженных с APC красителем | хранить при 4 ° C | ||
| Декстран сопряженный SA-APC | Immundex, Копенгаген, Demark | Store at 4 ° C | |
| Стерильные хирургические ножницы и щипцы | INOX tool Корпорация | ||
| Микропечь | GE Healthcare, Питтсбург, Пенсильвания | ||
| Leica VT 1200 Vibratome | Leica Microsystems, Inc. Буффало Гроув, Иллинойс | ||
| Olympus BX 60 Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп | Olympus America, Inc. Center Valley, PA | ||
| Конфокальный микроскоп Nikon A1-Eclipse 90i | Nikon Inc. Мелвилл, штат Нью-Йорк |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешение