Методическая статья

В Ситу обнаружения Аутореактивных CD4 Т-клеток в мозг и сердце Использование главного комплекса гистосовместимости Dextramers комплекс класса II

10.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51679

⸱

1 августа 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, University of Nebraska, Lincoln, 2Center for Biotechnology, University of Nebraska, Lincoln, 3Nebraska Center for Virology and School of Biological Sciences, University of Nebraska, Lincoln

В этой статье

Краткое содержание

Протокол обнаружить самореактивные лимфоциты CD4 в мозг и сердце путем прямого окрашивания главного комплекса гистосовместимости dextramers класс II был описан в настоящем докладе. Для всестороннего анализа, надежный способ перечислить частоты антиген-специфических CD4 + Т-клеток в месте также предназначен.

Аннотация

В этом отчете демонстрируется использование больших декстранеров комплекса гистосовместимости (MHC) класса II для обнаружения аутореактивных CD4 Т-клеток in situ в миелине, индуцированном протеолипидным белком (PLP), 139-151-индуцированным экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом (EAE) у мышей SJL и индуцированным сердечным миозином тяжелой цепью α (Myhc) 334-352-индуцированным экспериментальным аутоиммунным миокардитом (EAM) у мышей A/J. Использовали два набора коктейлей декстранмерных реагентов, в которых с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа (LSCM) анализировали клетки декстранеров+: EAE, ias/PLP 139-151 декстранеры (специфические)/анти-CD4 и IAs/вирус мышиного энцефаломиелита Тейлера (TMEV) 70-86 декстранеров (контроль)/анти-CD4; и EAM, IAk/Myhc 334-352 декстраны/анти-CD4 и IAk/бычья рибонуклеаза (РНКаза) 43-56 декстранеры (контроль)/анти-CD4. Анализ срезов мозга, полученных от мышей EAE, показал наличие клеток, положительных на CD4 и декстранеры PLP 139-151, но не на декстранеры TMEV 70-86, что позволяет предположить, что окрашивание, полученное с помощью декстранеров PLP 139-151, было специфичным. Аналогичным образом, срезы сердца, полученные у мышей с ЭАМ, также показали присутствие Myhc 334-352, но не РНКазы 43-56-декстрамер+ клеток, как ожидалось. Кроме того, был разработан комплексный метод количественного анализа частот антиген-специфичных CD4 Т-клеток на серийных изображениях «Z».

Введение

Использование главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса II тетрамерами обнаружения антиген-специфических CD4 Т-клеток был вызов 1-7. Для повышения чувствительности обнаружения тетрамеров МНС класса II, исследовательская группа создала тетрамеров нового поколения, предназначенные "dextramers" 8. Dextramers содержать декстран магистралей, в которой множество стрептавидином флуорофор фрагменты конъюгируют таким образом, что несколько пептидов привязи, биотинилированные мономеры МНС могут быть присоединены к одной молекуле декстрана 9. Таким образом, крупные агрегаты МНС dextramers, которые содержат несколько комплексов МНС-пептид может взаимодействовать с несколькими рецепторами Т-клеток (TCR).

Эта группа недавно генерируется dextramers для различных аутоантигены и показали, что чувствительность обнаружения dextramers был примерно в пять раз больше, чем тетрамеры 8. Экспериментальные системы включают экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAЕ) индуцируют протеолипидного белка (PLP) 139-151 у мышей SJL; EAE индуцировали миелина олигодендроцитов (MOG гликопротеина) 35-55 в C57BL / 6 мышей; и экспериментальный аутоиммунный миокардит (EAM), индуцированный с сердечной миозина тяжелой цепи-α (MyHC) 334-352 в / J мышей. Это исследование демонстрирует использование PLP 139-151 - и MyHC 334-352 dextramers обнаружить антиген-специфических CD4 Т-клеток в месте со спецификой путем разработки прямое протокол окрашивания, тем самым устраняя необходимость усиливать сигналы от использования флуорофорные антитела, подход обычно используют с использованием тетрамеров. Кроме того, комплексный метод оценки тканей также был разработан, чтобы надежно перечислить частоты антиген-специфических Т-клеток CD4 на месте 10. Обнаружение антиген-специфических Т-клеток в месте допускает разграничение событий, вызванных конкретных антигенных стимулов от тех, которые вызваны активацией наблюдателем. Аналогичным образом, в технику Ситу также ProvidES возможности отслеживать кинетику антиген-специфических Т-клеток инфильтратов в целевых органах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Заявление по этике:

Все животные процедуры были проведены в соответствии с руководящими принципами для уходу и использованию лабораторных животных и одобрены Университета Небраска-Линкольн, Lincoln, NE.

1. Индукция EAE

  1. Для индукции ЕАЕ, подготовить пептид / полном адъюванте Фрейнда (CFA) эмульсии, как описано в 11 со следующими изменениями: Шаг 1.1:. Подготовить PLP 139-151 в концентрации 1 мг / мл в 1X фосфатно-солевом буфере (PBS) Шаг 1.4:. использовать 200 мкл CFA эмульсии, содержащей 100 мкг PLP 139-151 на одно животное Шаг 1.4.1: иммунизировать десять животных, готовить 2 мл эмульсии путем смешивания 1 мл PLP 139-151 (1 мг / мл в 1X . PBS) и равный объем CFA Шаг 1,5: вводить 200 мкл эмульсии в Сплите дозах подкожно в двух паховых областях (~ 75 мкл каждой) и грудины области (~ 50 мкл) пять-шесть-недельных FEMAле SJL / J мышей. Шаги 1.7 и 1.8, не применяются для индукции ЭАЭ.

2. Клиническая Подсчет EAE мышах и заготовке Cerebrums

  1. Монитор животных для появления клинических признаков, и оценка болезненного тяжести ежедневно с днем ​​9 после иммунизации следующим образом: 0 - здоровый; 1 - хромота хвоста или задних конечностей слабости, но не то и другое; 2 - хромота хвоста и задних конечностей слабость; 3 - частичный паралич задних конечностей; 4 - полный паралич задних конечностей; 5 - агония или мертвым 12.
  2. Усыпить мышей, когда они достигают неврологическое оценку 3 или 4 с помощью CO 2. Чтобы усыпить мышей, сначала предварительно заполнить эвтаназии камеру с CO 2, поворачивая регулятор СО 2 танка не более 6 фунтов на квадратный дюйм и позволяют животным остаться в камере в течение примерно 5 минут, чтобы достичь полного асфиксии. Замочите эвтаназии животных в 70% спирте. Сразу разместить животных на абсорбирующей прокладки и с использованием пары стерильный длябелые грибы и ножницы разоблачить сердца, проходящем через грудной полости. Прокол правильные ушные раковины и заливать путем введения 10 мл холодной 1x PBS в левые желудочки сердца.
  3. Выкопать череп на отрезая череп по кругу с помощью пары изогнутых ножниц и осторожно, флип костей черепа щипцами. Урожай мозг, тупым и с помощью чистой скальпель, отдельный головной мозг от мозжечка. Поместите головной мозг в пробирку, содержащую холодной 1X PBS и не оставляют пробирку на льду до обработки.

3. В Ситу Окрашивание головного разделах с МНС класса II (И.А. ов) / PLP 139-151 Dextramers

  1. Получение 4% PBS буфером с низкой температурой плавления агарозы, расплав при нагревании при 50 ° С и оставить его в водяной бане при 40 ° С до использования.
  2. Поместите головной мозг в одноразовом глубоко база формы гистологии кассеты удерживается на льду, и залить расплавленный (40 ° C) агарозы. Сразу нажмите головной мозг мягкос щипцы, чтобы погрузить ткань. Оставьте кассету на льду в течение 15-20 мин, пока отверждение не будет завершена.
  3. Заполните Vibratome ванну с охлажденным 1x PBS. Заполните пространство вокруг Vibratome бане со льдом, чтобы поддерживать температуру PBS между 0 и 2 ° C. Fix чистую лезвие в Vibratome и установить угол лезвия 15 °.
  4. Размещение ткани в Vibratome. Обрежьте излишки агарозы от всех сторон встроенном ткани и немного разоблачить брюшной поверхности головного мозга.
    1. Намажьте Vibratome тканей блок с супер клей и передачи агарозном встраиваемый ткани над клееной поверхности, помещая подвергается вентральной поверхности головного мозга над клей для поперечной срезов. Не перемещайте ткань, как только ткань установлен на блоке.
    2. Поместите Vibratome блок, содержащий агарозы встраиваемый ткани на льду, и позвольте клею высохнуть в течение 15 мин.
  5. В то же время, поместите ткань ChamБерс один на лунку в 24-луночный планшет. Заполните лунки, содержащие ткани камер с 1 мл холодного PBS 1x, и оставить пластину на льду.
    1. Подготовка ткани камеры путем присоединения тонкий нейлон сетка с вырезом конце 25 мл полипропиленовой пипетки с использованием супер клей; после обрезки избытка сетку вокруг пипетки, разрезать пипеткой длиной 1 см от сетки.
  6. Опустить Vibratome лезвие до уровня верхней поверхности ткани; установить скорость Vibratome 0,22 мм / сек и начать секционирования с движением вперед, чтобы сделать толщиной 200 мкм разделы. Трансфер один мозговой раздел на лунку, используя акварель мягкой щеткой в ​​тканевые камер, помещенных внутри лунки 24-луночного планшета. Держите тарелку на льду до секционирования не обходится для предотвращения деградации тканей. Примечание: Выполните следующие действия, чтобы получить в общей сложности, три парных секций из трех различных регионах мозга спинной до брюшной поверхности (рис. 2). Один из разделов откаждая пара (в общей сложности три секции) размещены в трех отдельных камер ткани предназначены для окрашивания конкретных dextramers (IA с / PLP 139-151) и анти-CD4. Кроме того, еще один набор из трех секций, которые размещаются в трех отдельных камер ткани предназначены для окрашивания управления dextramers (И.А. с / TMEV 70-86) и анти-CD4.
  7. Передача три камеры ткани, содержащие участки, предназначенные для окрашивания конкретных dextramers на три лунки в 24-луночный планшет с одной камеры на лунку, в котором, 300 мкл коктейля, содержащего аллофикоцианин (АРС)-конъюгированные PLP 139-151 dextramers (2.5 мкг / мл) и анти-CD4-фикоэритрин (РЕ; ранее добавляли 5 мкг / мл) в блокирующем растворе (1X PBS с 2% нормальной козьей сывороткой). Покройте скважин с крышкой.
  8. Аналогичным образом, передавать три камеры ткани, содержащие участки, предназначенные для окрашивания с контрольными dextramers на три лунки в 24-луночный планшет с одной камеры на мыLL, в котором, 300 мкл коктейля, содержащего APC-конъюгированного TMEV 70-86 dextramers (2,5 мкг / мл) и анти-CD4-PE (5 мкг / мл) в блокирующем растворе добавленный. Покройте скважин с крышкой. Примечание: Обратитесь к Massilamany и др., 8 для подготовки dextramers, и молекул декстрана по подготовке dextramers были любезно предоставлены Immudex, Копенгаген, Дания..
  9. Этикетка скважин, и оберните тарелку с алюминиевой фольгой и поместите пластину на качающейся платформе, установленной в нежных вращений в течение 1,5 часа в темноте при комнатной температуре.
  10. После периода инкубации, мыть срезах тканей на качающейся платформе, путем переноса ткани камеры для свежих хорошо, содержащий 1 мл холодного PBS 1x, и избежать ведением содержимое одного хорошо в другой. Повторите промывку трижды, позволяя по крайней мере, 10 мин на промывку. Убедитесь, что срезы ткани не получают сушат, как они могут прилипнуть к стенкам камеры.
  11. Fix разделы путем переноса ткани ChamBers в свежую лунку в 24-луночный планшет, содержащий 1 мл отфильтрованной 4% PBS-буферном параформальдегида (рН 7,4) на платформе-качалке в течение 2 часов с нежным вращений.
  12. Повторите промывку трижды, как описано в шаге 3.10.
  13. Поместите окрашенных и фиксированные разделы, посвященные чистой предметное стекло с использованием акварели мягкую кисть. Протрите излишки воды, не касаясь раздел и смонтировать раздел, используя монтажную среду. Обложка с микроскопическим покровного и позволяют слайды высохнуть при комнатной температуре O / N в темной комнате.
  14. Храните слайды в ящике для хранения слайд светонепроницаемый при 4 ° С.

4. Индукция EAM и сбора сердец

  1. Вызвать EAM, как описано в ссылке 11.
  2. Усыпить мышей на день 21 после иммунизации с использованием чистой камеру, снабженную CO 2 газового баллона, и замочить животных в 70% спирте. Сразу разместить животных на абсорбирующей прокладки и с использованием пары щипцов и ножниц подвергать сердцес разрезанием через грудной полости. Прокол правильные ушные раковины и заливать путем введения 10 мл холодной 1x PBS в левые желудочки сердца. Сбор сердца и место в пробирки, содержащие холодной 1X PBS.

5. В Ситу Окрашивание сердца разделах с МНС класса II (И.А. к) / MyHC 334-352 Dextramers

  1. Подготовка 4% PBS буфером с низкой температурой плавления агарозы, расплав при нагревании при 50 ° С и оставить его в 40   не ° C водяной бане до использования.
  2. Поместите сердце в одноразовом глубокой база формы гистологии кассеты выдерживали на льду, и залить расплавленный 40 ° C агароза, пока ткани не будут полностью погружены как описано на стадии 3.2.
  3. Выполните шаг 3,3.
  4. Обрежьте излишки агарозы от всех сторон вложенного ткани и слегка подвергать основание сердца. Намажьте Vibratome тканей блок с супер клей и передачи агарозном встраиваемый ткани над клееной поверхности, помещая открытую поверхностьсердце на клей. Не перемещайте ткань, как только ткань установлен на блоке.
    1. Поместите Vibratome блок, содержащий агарозы встраиваемый ткани на льду, и позвольте клею высохнуть в течение 15 мин.
  5. Выполните шаги 3,5 и 3,6.
  6. Передача отделов сердца с использованием акварель мягкой кистью в тканевых камерах, расположенных в лунки 24-луночного планшета. Хранить пластину на льду до секционирования не завершится, чтобы предотвратить деградацию ткани. Примечание: Выполните следующие действия, чтобы получить в общей сложности, восемь парных секций от вершины до основания сердца (рис. 2). Поместите все разделы в ткани камер, выделяя до 3-х секций в камере. Один из разделов из каждой пары (в общем объеме восьми разделов) предназначен для окрашивания конкретных dextramers (И.А. к / MyHC 334-352) и анти-CD4. Кроме того, еще один набор из восьми разделов предназначен для окрашивания управления dextramers (И.А. к / РНКазных 43-56) и анти-CD4.
  7. Трансфертри камеры ткани, содержащие участки, предназначенные для окрашивания конкретных dextramers на три лунки в 24-луночный планшет с одной камеры на лунку в котором, 300 мкл коктейля, содержащего APC-конъюгированные MyHC 334-352 dextramers (2,5 мкг / мл) и анти-CD4-PE (5 мкг / мл) в блокирующем растворе добавленный. Покройте скважин с крышкой.
    1. Аналогичным образом, передавать три камеры ткани, содержащие участки, предназначенные для окрашивания с контрольными dextramers на три лунки в 24-луночный планшет с одной камеры на лунку, в котором, 300 мкл коктейля, содержащего APC-конъюгированного РНКазы 43-56 dextramers (2,5 мкг / мл) и анти-CD4-PE (5 мкг / мл) в блокирующем растворе добавленный. Покройте скважин с крышкой.
  8. Этикетка скважин, и оберните тарелку с алюминиевой фольгой и поместите пластину на качающейся платформе, установленной в нежных вращений в течение 1,5 часа в темноте при комнатной температуре.
  9. Выполните шаги, 3.10 в 3.11
  10. Повторите промывание Четлед, как описано в шаге 3.10.
  11. Поместите окрашенных и фиксированные разделы (до трех разделах / слайд) на чистую предметное стекло с помощью акварели мягкую кисть. Протрите излишки воды, не касаясь секции и монтировать разделы с помощью монтажной среды. Обложка с микроскопическим покровного и позволяют слайды высохнуть при комнатной температуре O / N в темной комнате.
  12. Храните слайды в ящике для хранения слайд светонепроницаемый на 4 ° C.

6. Анализ Dextramer + (Dext +) CD4 + Т-клетки с помощью лазера сканирующей конфокальной микроскопии (LSCM) (общий для обоих мозга и сердца разделах)

  1. Используйте Nikon A1-Eclipse-90i конфокальной системы микроскоп для рутинных сканирования и приобретения изображений. Для начала Нажмите открытым, программное обеспечение NIS Elements AR (версия 4.13).
    1. Выберите "TRITC" и "Cy5" каналы с панели. Длины волн возбуждения / испускания соответственно для TRITC и Cy5 каналов, 561,5 нм / 553-618 нм и 640,7 нм / 663-738 нм отображается по умолчанию.
    2. Назначьте pseudocolors "зеленых" и "красный" для TRITC (CD4-PE) и Cy5 (dextramer-APC) каналов, соответственно.
    3. Поместите слайд быть осмотренным на микроскопическом стадии и выполните фокусировку вручную под 100-кратном увеличении. Установите "HV" до 110 и смещение на "0". Нажмите "Фокус" и настроить "напряжение" для оптимизации лазеров.
    4. Нажмите "Фокус"; сканировать раздел сверху донизу, и установить уровень 'Z' для получения изображения. Нажмите кнопку "CH серию" и приобрести изображения последовательно. Определить Dext + CD4 + Т-клетки появляются как желтые точечные элементы на основе совместной локализации сигналов, генерируемых как от красного (dextramers) и зеленый (CD4) каналов.
  2. Используйте Olympus FV500-BX60 конфокальной микроскопии для легкого количественного подсчета Dext + CD4 + Т-клеток. Для началанажмите открытым, программное обеспечение FluoView (версия 4.3).
    1. Выберите красителей "Су3" и "Cy5" из выпадающего меню, и нажмите кнопку "Применить", чтобы загрузить соответствующие лазеры. Примечание: длины волн возбуждения / эмиссии для Cy3 (543 нм / псевдоцветной "зеленый"; CD4-PE) и Cy5 (633 нм / псевдоцветной "красный"; dextramer-APC) каналов.
    2. Поместите слайд быть осмотренным на предметное стекло, и сфокусировать его вручную под малом увеличении (4X или 10X). Нажмите "Фокус" в то время как лазер Су3 включен, и сосредоточиться на очаг воспаления.
    3. Измените задачу 100-кратном увеличении. Установить размер файла "512/512" от выпадающем меню. Нажмите "Фокус" и отрегулируйте значения для "ПМТ", "усиления" и "Смещение" параметры для оптимизации лазеров отдельно для Cy3 и Cy5.
    4. Нажмите "Z этап" и нажмите кнопку "Фокус" в то время как оба лазеры на. Набортолщина "Z этапе", нажав кнопку "вверх" и "вниз" стрелки. Установите "Z" интервал до 2 мкм.
    5. Нажмите кнопку "Стоп", и выберите "Seq123". Затем нажмите "XYZ" и начать получения изображений серии «Z» для выбранной области в очаг воспаления. Сохраните "Z серийные изображения" как AVI файлов. Чтобы сохранить файлы изображений, выберите изображение из "Z последовательного образа", а затем сохранить в формате "TIFF".
  3. Изучите три парных разделы из головного мозга, где один набор из трех разделов окрашивали И.А. с / PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 и другой набор из трех секций с И.А. с / TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4 выполнять Количественный анализ.
    1. Точно так же, проанализировать восемь парных разделы для сердца, в котором, один набор из восьми разделов окрашивали И.А. к / MyHC 334-352 dextramers/anti-CD4 и другой себет из восьми разделов с РНКазы 43-56 dextramers/anti-CD4.
  4. Изучите 10 до 15 воспалительные очаги за раздел в головном мозге, и в каждом фокусе, приобрести набор 15 до 25 последовательных изображений последовательно.
    1. Изучите в общей сложности 20 очагов воспаления из всех восьми секций сердца и от каждого фокуса приобрести от 10 до 15 последовательных изображений последовательно. Возьмите 'Z' серийные изображения путем сканирования слайдов в "до-горизонтально-вертикального сверху вниз горизонтально-вертикальный« движения так, чтобы повторение 'Я' серии в том же фокусе избежать.
    2. После того, как последовательные изображения 'Z' в плен, назвать файлы путем выявления номеров слайдов, имя секциях, и ряд 'Z' серийных снимков, сделанных.
      1. С помощью программного обеспечения ImageJ '' считать Dext + CD4 + Т-клеток по отношению к общему количеству CD4 + Т-клеток. Выберите "тип счетчика" в "ImageJ, проверьте &# 8216; показать все »и начать отсчет, нажав на центр каждой ячейки и продолжает отсчет в различных 'Z' серийных изображений с помощью боковых стрелок. После подсчета всех лимфоциты CD4, выберите другой тип счетчика и подсчитать CD4 + Dext + Т-клеток. Перейдите на вкладку результаты, чтобы получить общее количество подсчитанных клеток с двух различных счетчиков.
      2. Чтобы получить общее количество, добавить количество клеток во всех 'Z' серийных изображений, представляющих все три мозговых разделы или все разделы сердечные восемь.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом докладе, в обнаружении месте антигенспецифических, аутореактивных лимфоцитов CD4 путем прямого окрашивания dextramers МНС класса II описан. Свежесрезанных мозговые участки были получены от мышей EAE и окрашивали коктейлей, содержащих PLP 139-151 (специфические) или TMEV 70-86 (управление) dextramers и анти-CD4. Верхние панели на рисунке 1 показывает LSCM анализ мозга секций costained с PLP 139-151 dextramers (красный) и CD4 антитела (зеленый), где двойные-позитивные клетки появи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В отличие от I тетрамеров МНС класса, использование тетрамеров МНС класса II для обычных приложений продолжает оставаться сложной, особенно для перечисления частоты предшественники низкоаффинных аутореактивных лимфоцитов CD4, отчасти из-за их активации зависимости 6,15-17. В последнее время эта проблема была обойдена путем создания следующего поколения тетрамеров, под названием "dextramers," позволяя нам обнаружить антиген-специфических CD4 Т-клеток в течение ряда аутоантигенам, таких как PLP 139-15...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов не объявлялись.

Благодарности

Эта работа была поддержана Американской ассоциации сердца и Детского кардиомиопатии Foundation (SDG2462390204001) и Национальных Институтов Здоровья (HL114669). CM является получателем докторской исследования стипендий гранта, предоставленного Миокардит фонда, Нью-Джерси.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
CFASigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури5881Магазин в 4 ° C
MTB  Экстракт H37Rv Difco Laboratories, Детройт, Мичиган231141магазин по адресу 4 ° C
PTList Biologicals Laboratories, Campbell, CA181Магазин at 4 ° C
1x PBS Corning, Манассас, Вирджиния21-040-CVМагазин по адресу 4 ° C
Самка мышей A/J Jackson Laboratories, Бар Харбор, ME646
Самки мышей SJL/JJackson Laboratories, Бар Харбор, ME686
Leur-lok стерильный 1 мл сиррингBD, Франклин Лейкс, Нью-Джерси309628
Leur-lok стерильный 3 мл сиррингBD, Франклин Лейкс, Нью-Джерси309657
Стерильная игла, 18 г BD, Франклин Лейкс, Нью-Джерси305195
Игла стерильная, 27 1/2 гBD, Франклин Лейкс, Нью-Джерси305109
3-ходовой запорный кран Smiths Medical ASD, Inc. Дублин, ОгайоMX5311L
рулоны марлевой повязки Kerlix Ковидиен, Мэнсфилд, Массачусетс6720
КимвайпсКимберли-Кларк Professional, Розуэлл, Джорджия34155
Агароза, Низкая Температура плавления, Аналитический КлассКорпорация Промега, Мэдисон, ВисконсинV2111
Иммуночистая нормальная козья сывороткаThermo Scientific, Уолтем, Массачусетс31873Хранить в -20 ° C
Антимышиный CD4 конъюгирован с полиэтиленовым красителемeBioscience, Сан-Диего, Калифорния;12004185Магазин по адресу 4 ° C
Параформальдегиднаяэлектронная микроскопия наук, Хатфилд, Пенсильвания19202Магазин в 4 ° C
Faramount Aqueous Mounting MediumDako, Карпинтерия, Калифорния10073021
Коническая трубка (15 мл)BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния352099
Коническая трубка (50 мл)BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния352070
24-луночные планшеты для культуры тканей с плоским дномBD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния356775
Акварель #2 кистиCharles Leonard, Inc. Hauppauge, NY73502
Простые предметные стекла для микроскопа, размер: 3" x 1" x 1,2 ммFisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания1255010
Премиальное защитное стекло, 22 x 22-1Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания12548B
Одноразовые гистологические кассеты с глубоким основаниемЛабораторное производство, Рочестер, Нью-ЙоркM-475-10
Суперклей LoctiteКорпорация Хенкель, Уэстлейк, Огайо1471879
Бритвенные лезвияGillette SuperSilver
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK)Неопептид, Кембридж, МассачусетсМагазин на 4 ° C
PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF)Неопептид, Кембридж, МассачусетсМагазин на 4 ° C
MHC класс II/IAs PLP 139-151 или TMEV 70-86 декстранеры, сопряженные с красителемХранить при 4 ° C
MHC класс II/IAk Myhc 334-352 или РНКаза 40-56 декстранеров, сопряженных с APC красителемхранить при 4 ° C
Декстран сопряженный SA-APCImmundex, Копенгаген, DemarkStore at 4 ° C
Стерильные хирургические ножницы и щипцыINOX tool Корпорация
МикропечьGE Healthcare, Питтсбург, Пенсильвания
Leica VT 1200 VibratomeLeica Microsystems, Inc. Буффало Гроув, Иллинойс
Olympus BX 60  Лазерный сканирующий конфокальный микроскопOlympus America, Inc. Center Valley, PA
Конфокальный микроскоп Nikon A1-Eclipse 90iNikon Inc. Мелвилл, штат Нью-Йорк
APC ,

Ссылки

  1. Cecconi, V., Moro, M., Del Mare,, Dellabona, S., P,, Casorati, G. Use of MHC class II tetramers to investigate CD4+ T cell responses: problems and solutions. Cytometry A. 73 (11), 1010-1018 (2008).
  2. Ferlin, W., Glaichenhaus, N., Mougneau, E. Present difficulties and future promise of MHC multimers in autoimmune exploration. Curr Opin Immunol. 12, 670-675 (2000).
  3. Kwok, W. W., Ptacek, N. A., Liu, A. W., Buckner, J. H. Use of class II tetramers for identification of CD4+ T cells. J Immunol Methods. 268, 71-81 (2002).
  4. Landais, E., et al. New design of MHC class II tetramers to accommodate fundamental principles of antigen presentation. J Immunol. 183, 7949-7957 (2009).
  5. Nepom, G. T. MHC class II tetramers. J Immunol. 188, 2477-2482 (2012).
  6. Vollers, S. S., Stern, L. J. Class II major histocompatibility complex tetramer staining: progress, problems, and prospects. Immunology. 123, 305-313 (2008).
  7. Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
  8. Massilamany, C., Upadhyaya, B., Gangaplara, A., Kuszynski, C., Reddy, J. Detection of autoreactive CD4 T cells using major histocompatibility complex class II dextramers. BMC Immunol. 12, 1471-2172 (2011).
  9. Batard, P., et al. Dextramers: new generation of fluorescent MHC class I/peptide multimers for visualization of antigen-specific CD8+ T cells. J Immunol Methods. 310 (1-2), 136-148 (2006).
  10. Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS One. 9 (1), (2014).
  11. Massilamany, C., Khalilzad-Sharghi, V., Gangaplara, A., Steffen, D., Othman, S. F., Reddy, J. Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse. J Vis Exp. (88), e51654(2014).
  12. Massilamany, C., Steffen, D., Reddy, J. An epitope from Acanthamoeba castellanii that cross-react with proteolipid protein 139-151-reactive T cells induces autoimmune encephalomyelitis in SJL mice. J Neuroimmunol. 219 (1-2), 17-24 (2010).
  13. Donermeyer, D. L., Beisel, K. W., Allen, P. M., Smith, S. C. Myocarditis-inducing epitope of myosin binds constitutively and stably to I-Ak on antigen-presenting cells in the heart. J Exp Med. 182 (5), 1291-1300 (1995).
  14. Liao, L., Sindhwani, R., Leinwand, L., Diamond, B., Factor, S. Cardiac alpha-myosin heavy chains differ in their induction of myocarditis. Identification of pathogenic epitopes. J Clin Invest. 92 (6), 2877-2882 (1993).
  15. Cameron, T. O., Cochran, J. R., Yassine-Diab, B., Sekaly, R. P., Stern, L. J. Cutting edge: detection of antigen-specific CD4+ T cells by HLA-DR1 oligomers is dependent on the T cell activation state. J Immunol. 166 (2), 741-745 (2001).
  16. Novak, E. J., et al. Activated human epitope-specific T cells identified by class II tetramers reside within a CD4high, proliferating subset. Int Immunol. 13 (6), 799-806 (2001).
  17. Reddy, J., et al. Detection of autoreactive myelin proteolipid protein 139-151-specific T cells by using MHC II (IAs) tetramers. J Immunol. 170 (2), 870-877 (2003).
  18. Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
  19. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
  20. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. Chapter 17, Unit 17.14.11(2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

IIZ

Похожие статьи