Извлечение ДНК из слюны может обеспечить легкодоступный источник высокомолекулярной ДНК, практически без деградации/фрагментации. Этот протокол обеспечивает оптимизированные параметры для сбора/хранения слюны и экстракции ДНК, чтобы они были достаточного качества и количества для последующих анализов ДНК с высокими требованиями к качеству.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Сбор и Добыча слюны ДНК к следующей последовательности поколения
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Предпочтительным источником ДНК в исследованиях генетики человека является кровь или клеточные линии, полученные из крови, поскольку эти источники дают большое количество высококачественной ДНК. Тем не менее, экстракция ДНК из слюны может дать высококачественную ДНК с минимальной деградацией или без фрагментации, которая подходит для различных анализов ДНК без затрат на флеботомиста и даже может быть приобретена по почте. Однако в настоящее время в литературе не представлены протоколы сбора/экстракции ДНК слюны для секвенирования следующего поколения. Этот протокол оптимизирует параметры сбора/хранения слюны и экстракции ДНК для обеспечения достаточного качества и количества для проведения анализов ДНК в соответствии с самыми высокими стандартами, включая генотипирование микрочипов и секвенирование нового поколения.
Введение
Получение высокого качества ДНК для генетических исследований человека имеет важнейшее значение в процессе обнаружения гена болезни. Кровь, при том, что требует инвазивных процедур, а также быть более дорогим, чем сбора слюны, способствует для создания линии иммортализованных клеток в виде бесконечного источника ДНК, или токов для функциональных исследований, а иногда и ДНК в крови используется, когда клеточные линии не доступны. Однако получение кровь требует квалифицированного Phlebotomist и кровь имеет короткий период полураспада, чем слюны 1. ДНК из слюны дешевле и легче получить, так как он может быть собран и отправлен по почте без необходимости Phlebotomist, тем самым увеличивая потенциальные бассейны, подлежащих далеко за пределы водосборного бассейна больниц и лабораторий 2. Исследование учащихся может быть улучшена, если объекты имеют возможность давать образец слюны вместо крови 3, 4. Опасения по поводу количества и качества ДНК из слюны, возможно, ограничивается его широкое насэ несмотря на многочисленные исследования последних исследований, показывающих, пригодность всей слюны, в среднем 4,3 х 10 5 клеток на миллилитр, для анализа ДНК за старые методы буккальные тампоны, которые не получить значительное количество слюны 2, 3, 4, 5, 6. Пока скромный литература существует показывая пригодность всей слюны, полученной ДНК для генотипирования приложений, включая микрочипов на основе методов 8, 9, 10, никакие исследования не рассматриваются следующего поколения секвенирования (NGS). Цель оптимизации всю эту протокола экстракции слюны ДНК была максимально количество и качество для генетики приложений в экономически эффективным образом, что легко реализуется в лабораториях с обычных реагентов и расходных материалов.
Выделение ДНК из слюны требуется несколько процедур: 1) сбор и хранение, 2) лизис клеток, 3) лечение РНКазы, 4) осаждение белка, 5) осаждение этанолом, 6) регидратации ДНК. Раствор ДНК стабилизации буфера, описанныеранее 2, функции адекватно без изменения. Не было сделано никаких попыток оптимизировать лечение РНКазы и шаги ДНК регидратации. Для каждого из оставшихся шагов, были выявлены несколько переменных, которые могут повлиять выход. Каждая переменная манипулировали индивидуально и улучшение урожайности и качества оценивали статистически. Для переменных, которые были показаны для повышения урожайности и / или качество ДНК, оптимальные значения были включены в итоговый протокол.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем предоставить образцы слюны все пациенты подписали информированное согласие, соответствующую принципов для лечения человека предметов в Национальной детской больницы.
1 Слюна Сбор и хранение
- До сбора слюны, убедитесь, что рот субъекта свободен от пищи или других посторонних веществ, имея предметом промыть рот водой и избегая еды или питья в течение 30 мин перед сбором.
- Откройте 15 мл центрифужную пробирку с 2,5 мл ДНК стабилизации буфера 2, убедившись, чтобы не касаться внутренней части крышки или трубки, и есть предметом плевать 2,5 мл слюны в буферный раствор. Примечание: Сбор более 2,5 мл слюны может привести к деградации образца от недостаточного соотношения образца буфера стабилизации ДНК. Сбор слишком мало слюны уменьшит ожидаемые урожаи из протокола. Для оценки объемов сбора, используйте цифровые градиенты на стороне тон трубку.
- Замените крышку и перемешать с помощью инверсии, пока смесь не гомогенизируют. Энергичные сотрясения нет необходимости. Храните образцы при комнатной температуре в течение кратковременного хранения или 4 ° С в течение длительного хранения (> 3 месяцев).
2. Исходные Препараты и лизиса клеток
- Перед началом добычи, нагреть на водяной бане до 37 ° С, и подготовить ведро со льдом. Три 15 мл конические центрифуги трубы будут необходимы для каждого извлеченного образца. Три трубки будет использоваться для хранения клеток и белка гранул, окончательный извлеченный гДНК, и изопропанол и этанол супернатантов.
- Получить образцы из хранилища, и образцы инвертировать несколько раз затем вихрь на средней скорости в течение 15 сек.
- Разлить 2,5 мл образца в чистую 15 мл центрифужную пробирку и добавьте 5 мл клеточного лизиса решения. Смешайте образца 50 раз по инверсии, и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин.
3 РНК удаления
- Добавить 40 мкл РНКазы А-Сольution при 100 мг / мл, и инкубируют при 37 ° С в течение 15 мин.
- Извлеките образец из С на водяной бане в 37 ° и охладили на льду в течение 3 мин.
- После инкубации РНКазы А, увеличить температуру в водяной бане до 65 ° С для регидратации ДНК шага протокола.
4 белков и липидов удаления
- Добавить 50 мкл протеиназы К раствору при 20 мг / мл, смешивают несколько раз путем инверсии, и инкубируют при комнатной температуре в течение как минимум 30 мин. Примечание: Это возможно точка паузы для протокола. После добавления раствора протеиназы К, образец можно хранить при температуре 4 ° С до тех пор, извлечение не может быть завершен. Хранение при 4 ° С в течение до 24 часов не было показано, что значительное влияние на доходность добычи или качеством ДНК. Длительное хранение на данном этапе не была оценена.
- Добавить 1,7 мл Белок осадков решения, вихрь энергично в течение 20 сек на высокой скорости, и место на льду в течение 10 мин.
- После того, как образцы были охлаждали на льду в течение 10 мин, центрифугируют в течение 10 мин при 3000 х г и 4 ° C. Осажденные белки должны составлять плотный осадок, чтобы продолжить. Если гранулы не плотно, или раствор все еще Ясно, образцы могут быть охлаждали на льду в течение 5 мин и более центрифугирования повторили. Образцы должны храниться на льду, убедившись в надежности осадок.
5 Выделение и очистка гДНК
- В чистую 15 мл центрифужную пробирку, пипетки 5 мл изопропанола и 8 мкл гликогена чистого раствора при 20 мг / мл.
- Налейте супернатант, содержащий гДНК с шага 4,3 в пробирку, содержащую изопропанол и гликогена решение, оставив осажденного белка гранул. После того, как супернатант был добавлен, осторожно перемешать образца в 50 раз от инверсии и центрифуги в течение 30 мин при 3000 х г и 4 ° C.
- Налейте супернатант медленно в чистую пробирку на 15 мл. После удаления надосадочной жидкости, добавляют 1 мл 70% этанола, чтобыВымойте гранул, медленно покачиваясь и нежно перемещая этанола над осажденной гранул несколько раз. Сохранить этанола в трубке.
- После начальной промывки образец центрифугировать в течение 1 мин при 2000 х г и 20 ° С. Этот шаг центрифугирования может быть сделано в любом 4 ° С или 20 ° С. Никакого значительного влияния температуры не было показано на этом шаге.
- После первоначального стирки и центрифугирования осадка, постепенно влить этанола мыть из трубки и выбросить, а затем выполните вторую мытье, повторяя шаги 5,3 и 5,4.
- После удаления надосадочной жидкости от второго мытья, чтобы осадок высохнуть на воздухе в течение 15 мин.
- Если образец не полностью высушивают, сухой воздух еще 15 мин.
6 Регидратация гДНК
- После того, как образец сушат, добавляют 300 мкл Трис-ЭДТА увлажняет высушенного осадка гДНК.
- Vortex образец в течение 5 сек при средней скорости и места в65 ° С горячей водяной бане в течение 1 часа.
- Удалить образцы из водяной бани и инкубировать O / N при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все продукты и реагенты, используемые перечислены в таблице материалов, а также Таблица 4.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для определения оптимальных параметров для ДНК экстракцию серия парных извлечения ДНК. Один образец слюны был разделен, и каждая часть проверены с одним из двух возможных значений для данной переменной. Проводились по меньшей мере восемь повторов каждого парного теста (например, один образец слюны на аликвоты для проверки добычу, так и без первоначального 50 ° C инкубации). Оптимизация была основана на четырех стандартных метрик: Общий выход ДНК, стоимостью 260/280, 260/230 стоимости, и визуальный осмотр электр...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Настоящая процедура оптимизирована протокол выделения ДНК, что значительно улучшилась урожайность высокомолекулярной ДНК веса по сравнению со стандартными методами, без ущерба для качества ДНК. Решающим шагом с самым большим влиянием на выход большей была шагом 5.2, которая включает в себя более длительный этап центрифугирования при осаждением этанолом, чем любой опубликованной протокола в данном обзоре, за исключением одного, который не был широко распространен 11. Никаких изменений в качестве ДНК, связанные...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была профинансирована Национальным институтом здравоохранения R01 (DC009453 поддержку CWB).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Центрифужные пробирки 15 мл | Fisher | 12-565-268 | |
| Раствор для лизиса клеток | Qiagen | 158908 | |
| протеиназа K | Sigma | P6556 | |
| Раствор для осаждения белка | Qiagen | 158912 | |
| изопропанол | Fisher | A416-4 | |
| гликоген | EZ-BioResearch | S1003 | |
| 70% этанол | Fisher | 04-355-305 | |
| Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 | |
| NaCl | Fisher | AC194090010 | |
| Tris HCl | Fisher | BP1757-100 | |
| EDTA (0,5 M) Раствор | Fisher | 03-500-506 | |
| Додецилсульфат натрия | Fisher | BP166-100 | |
| Аналоговый вихревой смеситель | Fisher | 02-215-365 | |
| Центрифуга 5810R | Eppendorf | 5811 000.010 |
Ссылки
- Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M., Nasidze, I. Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies. Analytical Biochemistry. 353, 272-277 (2006).
- Min, J. L., et al. High mircosatellite and SNP genotyping success rates established in a large number of genomic DNA samples extracted from mouth swabs and genotypes. Twin Research and Human Genetics. 9, 501-506 (2006).
- Dlugos, D. J., Scattergood, T. M., Ferraro, T. N., Berrettinni, W. H., Buono, R. J. Recruitment rates and fear of phlebotomy in pediatric patients in a genetic study of epilepsy. Epilepsy & Behavior. 6, 444-446 (2005).
- Etter, J. F., Neidhart, E., Bertand, S., Malafosse, A., Bertrand, D. Collecting saliva by mail for genetic and cotinine analyses in participants recruited through the internet. European Journal of Epidemiology. 20, 833-838 (2005).
- Hansen, T. V., Simonsen, M. K., Nielsen, F. C., Hundrup, Y. A. Collection of blood, saliva, and buccal cell samples in a pilot study on the danish nurse cohort: Comparison of the response rate and quality of genomic DNA. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 16, 2072-2076 (2007).
- Van Schie, R. C. A. A., Wilson, M. E. Saliva: A convenient source of DNA for analysis of bi-allelic polymorphisms of fcγ receptor iia (cd32) and fcγ receptor iiib (cd16). Journal of Immunological Methods. 208, 91-101 (1997).
- Dawes, C. Estimates, from salivary analyses, of the turnover time of oral mucosal epithelium in humans and the number of bacteria in an edentulous mouth. Archives of Oral Biology. 48, 329-336 (2003).
- Bahlo, M., et al. Saliva-derived DNA performs well in large-scale, high-density single-nucleotide polymorphism microarray studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 19, 794-798 (2010).
- Hu, Y., et al. Genotyping performance between saliva and blood-derived genomic dnas on the dmet array: A comparison. PLoS ONE. 7 (3), e33968(2012).
- Simmons, T. R., et al. Increasing genotype-phenotype model determinism: Application to bivariate reading/language traits and epistatic interactions in language-impaired families. Human Heredity. 70, 232-244 (2010).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol precipitation of DNA. Focus. 7, 1-2 (1985).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).
- DePristo, M., et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nature Genetics. 43, 491-498 (2011).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
