Method Article

Сбор и Добыча слюны ДНК к следующей последовательности поколения

DOI:

10.3791/51697

⸱

August 27th, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Battelle Center for Mathematical Medicine, The Research Institute at Nationwide Children's Hospital, 2The Interdisciplinary Graduate Program in Biophysics, The Ohio State University, 3Department of Pediatrics, The Ohio State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Извлечение ДНК из слюны может обеспечить легкодоступный источник высокомолекулярной ДНК, практически без деградации/фрагментации. Этот протокол обеспечивает оптимизированные параметры для сбора/хранения слюны и экстракции ДНК, чтобы они были достаточного качества и количества для последующих анализов ДНК с высокими требованиями к качеству.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Предпочтительным источником ДНК в исследованиях генетики человека является кровь или клеточные линии, полученные из крови, поскольку эти источники дают большое количество высококачественной ДНК. Тем не менее, экстракция ДНК из слюны может дать высококачественную ДНК с минимальной деградацией или без фрагментации, которая подходит для различных анализов ДНК без затрат на флеботомиста и даже может быть приобретена по почте. Однако в настоящее время в литературе не представлены протоколы сбора/экстракции ДНК слюны для секвенирования следующего поколения. Этот протокол оптимизирует параметры сбора/хранения слюны и экстракции ДНК для обеспечения достаточного качества и количества для проведения анализов ДНК в соответствии с самыми высокими стандартами, включая генотипирование микрочипов и секвенирование нового поколения.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Получение высокого качества ДНК для генетических исследований человека имеет важнейшее значение в процессе обнаружения гена болезни. Кровь, при том, что требует инвазивных процедур, а также быть более дорогим, чем сбора слюны, способствует для создания линии иммортализованных клеток в виде бесконечного источника ДНК, или токов для функциональных исследований, а иногда и ДНК в крови используется, когда клеточные линии не доступны. Однако получение кровь требует квалифицированного Phlebotomist и кровь имеет короткий период полураспада, чем слюны 1. ДНК из слюны дешевле и легче получить, так как он может быть собран и отправлен по почте без необходимости Phle....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем предоставить образцы слюны все пациенты подписали информированное согласие, соответствующую принципов для лечения человека предметов в Национальной детской больницы.

1 Слюна Сбор и хранение

  1. До сбора слюны, убедитесь, что рот субъекта свободен от пищи или других посторонних веществ, имея предметом промыть рот водой и избегая еды или питья в течение 30 мин перед сбором.
  2. Откройте 15 мл центрифужную пробирку с 2,5 мл ДНК стабилизации буфера 2, убедившись, чтобы не касаться внутренней части крышки или трубки, и есть предметом плевать 2,5 мл слюны в буферный раствор. Примечание: Сбор более 2,5 мл слюны может пр....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для определения оптимальных параметров для ДНК экстракцию серия парных извлечения ДНК. Один образец слюны был разделен, и каждая часть проверены с одним из двух возможных значений для данной переменной. Проводились по меньшей мере восемь повторов каждого парного теста (например, один образец слюны на аликвоты для проверки добычу, так и без первоначального 50 ° C инкубации). Оптимизация была основана на четырех стандартных метрик: Общий выход ДНК, стоимостью 260/280, 260/230 стоимости, и визуальный осмотр электр.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящая процедура оптимизирована протокол выделения ДНК, что значительно улучшилась урожайность высокомолекулярной ДНК веса по сравнению со стандартными методами, без ущерба для качества ДНК. Решающим шагом с самым большим влиянием на выход большей была шагом 5.2, которая включает в себя более длительный этап центрифугирования при осаждением этанолом, чем любой опубликованной протокола в данном обзоре, за исключением одного, который не был широко распространен 11. Никаких изменений в качестве ДНК, связанные.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была профинансирована Национальным институтом здравоохранения R01 (DC009453 поддержку CWB).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Центрифужные пробирки 15 млFisher12-565-268
Раствор для лизиса клетокQiagen158908
протеиназа KSigmaP6556
Раствор для осаждения белкаQiagen158912
изопропанолFisherA416-4
гликогенEZ-BioResearchS1003
70% этанолFisher04-355-305
Tris-EDTA (TE)FisherBP2473-1
NaClFisherAC194090010
Tris HClFisherBP1757-100
EDTA (0,5 M) РастворFisher03-500-506
Додецилсульфат натрияFisherBP166-100 
Аналоговый вихревой смесительFisher02-215-365
Центрифуга 5810REppendorf5811 000.010

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M., Nasidze, I. Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies. Analytical Biochemistry. 353, 272-277 (2006).
  2. Min, J. L., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Saliva DNA ExtractionGenomic DNA IsolationCell Lysis SolutionRNA Removal StepProtein PrecipitationDNA PrecipitationEthanol WashSpectrophotometry AnalysisGel ElectrophoresisNext Generation Sequencing

Related Articles