Микромасштабные Vortex-помощь электропоратора для последовательного молекулярной Доставка

Summary

Микрожидкостных вихрь помощь электропорации платформа была разработана для последовательного осуществления различных молекул в одинаковых клеточных популяций с точным и независимой лекарственной контроля. Размер основе стадия очистки клетки-мишени, предшествующий электропорации системы автоматизированного чтобы добавлять на молекулярную эффективность доставки и обработанную жизнеспособность клеток.

Abstract

Электропорация уделяется все больше внимания в последние годы, потому что это очень мощная техника для физически введения не-проникающего экзогенных молекулярных зондов в клетках. Эта работа сообщает микрофлюидном электропорации платформу, способную творить доставку несколько молекул в клетках млекопитающих с точным и молекулярно-зависимого управления параметрами. Способность системы изолировать клетки с равномерным распределением по размерам позволяет за меньшие изменения в эффективности электропорации в данной напряженности электрического поля; следовательно усиливается жизнеспособность образца. Кроме того, его функция визуализации процесса позволяет для наблюдения флуоресцентного молекулярного процесса поглощения в режиме реального времени, что позволяет оперативно коррективы молекулярных параметров поставки на месте для повышения эффективности. Чтобы показать обширные возможности отчетном платформы, макромолекулы с различными размерами и электрических зарядов (например, декстран с молекулярной массой 3000 и 70000 Da) былидоставлены в метастатических клеток рака молочной железы с КПД высокий доставки (> 70%) для всех тестируемых молекул. Разработанная платформа доказала свой потенциал для использования в разложении областях исследований, где на чипе методы электропорации может быть выгодно.

Introduction

В последние годы использование электрических импульсов, чтобы облегчить доставку цитозольного внеклеточных молекул стал привлекательным средством манипулирования клеток млекопитающих. ¹ Этот процесс, известный также как электропорация, обратимо permeabilizes клеточной мембраны, что позволяет по своей природе мембран молекул непроницаемых, чтобы получить доступ к внутриклеточной среде клетки. Поскольку практически любую молекулу могут быть введены в цитозоле с помощью временных созданных поры в мембране любого типа клеток с использованием электропорации, техника сообщалось как более воспроизводимым, универсально применимыми, и более эффективным, чем другие методы, включая вирус-опосредованной, химической и оптические подходы. ^2-3 Эта техника была использована для введения флуоресцентных молекул, ⁴ наркотики ⁵ и нуклеиновых кислот ^6-7, сохраняя клетки жизнеспособны и нетронутыми. Учитывая эти преимущества, электропорации был принят в качестве общего трудаТехника Atory для трансфекции ДНК, в естественных условиях генной терапии ⁸ и исследования вакцинации клеток. Это, однако, все еще трудно обычные системы электропорации одновременно достичь практическую эффективность и жизнеспособность для образцов с большой неоднородности в размере, потому что напряженность электрического поля, необходимые для успешного электропорации тесно коррелирует с диаметром ячейки. Кроме того, эти системы не позволяют точное управление из нескольких молекулярных количествах поставляются в связи с зависимостью от объемной стохастических молекулярных процесса доставки. ⁹ В целях решения этих проблем, многие группы разработали микрофлюидных платформы электропорации, дает преимущество более низких напряжениях порации, лучше эффективность трансфекции, значительное снижение клеток смертности, и способность доставлять несколько молекул. ^10-13 Эти преимущества стали возможными благодаря малых следы микромасштабных систем электропорации, чьи электрод шагдлины суб-миллиметров, резко уменьшая напряжения, необходимые для успешной реализации. Кроме того, эти микромасштабные системы электропорации можно добиться равномерного распределения электрического поля и быстро рассеивается выделяемое тепло, уступая снижением смертности клеток, повысить эффективность доставки. Использование прозрачных материалов для этих микрочипов дальнейших позволяет на месте наблюдения за процессом электропорации для быстрых изменений параметров. ^2,12 Однако, точный контроль дозировки и молекулярно-и сотовой зависит от контроля параметров, необходимых для новых исследований и терапевтических приложений, ^{6, 14-16} все еще ​​остаются нерешенными.

Эта работа представляет собой микрофлюидных вихревую-помощь электропорации систему, способную доставлять несколько молекул последовательно в заранее выбранном одинаковой населения клеток-мишеней. Клетки с равномерного распределения размера изолированы до электропорации с использованием сообщалось ранее сиге-селективный механизм захвата. ^17-18 Имея однородное распределение по размеру, меньше отклонений в эффективности электропорации и повышенную жизнеспособность за данной напряженности электрического поля были достигнуты. ¹⁹ Кроме того, постоянно агитирует захваченных клеток с использованием микромасштабной вихри разрешено для равномерного доставки молекул через Весь цитозоле, в соответствии с результатами ранее сообщалось, с использованием другого вихревого при содействии электропорации платформу. ^20, чтобы продемонстрировать, что эта система будет применяться для широкого диапазона молекул, обычно используемых в биологических приложений, макромолекул с широким диапазоном молекулярных масс были доставлены метастатических клеток рака молочной железы. Кроме того, с помощью мониторинга процесса в режиме реального времени, эта работа дает больше доказательств, чтобы положить конец долгой стоячей дискуссии относительно механизма молекулярной доставкой в electrporation, будучи преимущественно электрофорез опосредованного против диффузии опосредованной. ¹⁴ В отличие от других систем электропорации, эта платформа однозначно предоставляет объединенные преимущества доставки точного нескольких молекул, высокой эффективности молекулярной поставки, минимальной смертности клеток, в широком диапазоне размеров и зарядов поставляемых молекул, а также в режиме реального времени визуализации электропорации процесс. Учитывая эти возможности, развитая система электропорации имеет практический потенциал как универсальный инструмент для сотовой перепрограммирования исследований, приложений ^6,14,21-22 наркотиков доставки ^10,19 и приложений, требующих для углубленного понимания электропорации механизмов молекулярных доставки.

Protocol

1 Приготовление клеток

1. Пластина 1 × 10 ⁵ клеток / мл метастатического клеточной линии рака молочной железы MDA-MB-231 в объеме 10 мл на культуре ткани Т75 колбы в Лейбовица L-15 среде, дополненной 10% (объем / объем) фетальной бычьей сыворотки и 1 % пенициллина-стрептомицина.
2. Инкубируйте MDA-MB-231 клеток в увлажненном инкубаторе при 37 ° С с 0% CO ₂ окружающей среды.
3. Урожай клеток для экспериментов 2 дней после посева при обработке клеток с 0,25% трипсин-ЭДТА в течение 2 мин и инактивации ферментативной активности трипсина путем добавления 8 мл питательной среды.
4. Гранул клетки центрифугированием в течение 5 мин при 200 х г и ресуспендируют в фосфатно-буферном солевом растворе Дульбекко (DPBS, 1x, без Са ^{2 +} и Mg ^{2 +)} до конечной концентрации 5 × 10 ⁵ клеток / мл.

2 Дизайн устройства и изготовление

ПРИМЕЧАНИЕ: Маска, мастер плесени измышления иПроцесс вшита микроканальной должны быть проведены внутри чистой комнаты в то время как полидиметилсилоксан (PDMS) микроканальной процесс литья может быть выполнена на регулярной лабораторного лабораторного стола.

1. Дизайн микрожидкостных устройств, как показано на рисунке 1 с AutoCAD. Устройство должно состоять из входе с несколькими портами впрыска, фильтры грубой очистки и двумя параллельными прямыми прямоугольными инерциальных фокусировки каналов (L = 7 мм, W = 40 мкм, и H = 70 мкм). Индивидуальный прямо канал состоит из 5 электропорации камер, которые размещены 800 мкм друг от друга (W _C = 400 мкм) с двумя проходами для алюминиевых электродов. Два поперечно смежных электропорации камеры поделиться отверстие для отрицательного электрода. Две прямые каналы сливаются в розетке ниже по течению в области электропорации.
2. Преобразуйте файл CAD с микро-моделей в файл GDSII использованием LinkCAD. Написать микро-моделей на 5 "х 5" фотошаблона пустойс использованием лазерной маски писателя. Разработка маску, следуя протоколу производителя. ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс разработки маска включает фоторезиста развивается, хром травление и противостоять удаление. Кроме того, микро-модели напечатаны на высокой прозрачностью разрешения (> 20 000 точек на дюйм) можно приобрести у производителя третьей стороны и использовать в качестве фотошаблона. Заключительные микромасштабные особенности на фотошаблон должен быть прозрачным, чтобы соблюдайте полярность негативного фоторезиста.
3. Изготовление литейной формы в конструкции устройства с использованием стандартных методов мягкой литографии ²³ с отрицательным фоторезиста формованной пальто на 4 дюйма кремниевой пластины при 2000 оборотов в минуту, чтобы иметь конечную толщину 70 мкм.
4. Обожженными пластину с негативного фоторезиста в течение 20 мин при 95 ° С.
5. Связаться маску с пластины и подвергать УФ источника (17,4 МДж / см ²⁾ в течение 80 сек с использованием маски выпрямитель.
6. Разработать открытую пластины для 4 мин в разработчика СУ-8.
7. Измерьтеразвитая толщина фоторезиста с использованием поверхности профилометра.
8. Строго смешать 10: соотношение 1 из эластомера к отвердителя (силиконового эластомера комплект) и вылейте смесь на литейную форму для создания PDMS реплики. Дегазации литья эластомер течение 30 мин и вылечить литейной формы с дегазированной эластомера в сушильном шкафу при 70 ° С в течение 2 часов.
9. Расслаиваться вылечить PDMS реплики с микроканальных моделей из формы и перфорированная для воздухозаборников, выпускных и электродных вставок с использованием пин тиски. ПРИМЕЧАНИЕ: Нормальный диаметр передний край по выводам тиски должны быть 0,76 мм, достаточно для плотно держит PEEK трубки (OD из 1/32 ") и алюминиевых электродов (ОП 0,029") на месте.
10. Создание закрытых микроканалов путем соединения PDMS реплик на предметное стекло обрабатывают в очиститель кислорода в плазме в течение 7 секунд при радиочастотной мощности, и парциальном давлении кислорода 75 Вт и 500 мТорр, соответственно.

3. Эксперименты Flow

1. Вставитьалюминиевые электроды (0,029 "OD) и трубки на выходе PEEK (1/32" OD) в предназначенных для этого местах через отверстия в микроканале (рисунок 3б).
2. Подключите электрооборудование ^18, ответственный за создание высоковольтных короткий прямоугольные импульсы на алюминиевые электроды (рис 3C), что находятся в контакте с проточной решения в форме PDMS. ПРИМЕЧАНИЕ: Оборудование должно состоять из генератора импульсов и в-дом, построенный усилителя высокой напряжения ^18.
3. Подготовьте четыре 50 мл центрифужные пробирки индивидуально, содержащие DPBS, решения с клетками и биомолекул, и приложите каждую пробирку с соответствующим держателем флакона, подключенного к системе управления пневматической поток (рисунок 3А). ¹⁸
4. Подключите впускную трубу PEEK из флакона владельцев в соответствующих впускных отверстий в микрожидкостных устройств.
5. Установите величину прямоугольных импульсов, V, 100 V, чтобы иметь электрическую тьфуСила сть, Е = V / L _е, через электропорации камеры эквивалентно 0,7 кВ / см. Примечание: Здесь L _E представляет собой расстояние между двумя точками, где положительные и отрицательные электроды находятся в контакте с текучей раствора (рисунок 1).
6. Установите регулятор давления до 40 фунтов на квадратный дюйм. ПРИМЕЧАНИЕ:. Один ручной регулировкой источник азота используется для равномерно давление все ампулами и высокоскоростной коллектор используется для своевременного включения отдельных портов решений с использованием индивидуальному заказу программное обеспечение LabVIEW ¹⁸
7. Для управления клапаном, открыть по индивидуальному заказу программное обеспечение LabVIEW надписью клапана Runner, и выберите пункт Выполнить из выпадающего меню под названием работают.
8. Включите клапанов, нажав на соответствующую иконку клапана. ПРИМЕЧАНИЕ: Значок клапан станет зеленым, когда она включена. При нажатии на активную значок осуществляется отключение и закрыть клапан. Значок закрытого клапана должны седеть.
9. Откройте клапан для резервуара DPBS (т.е.., моющий раствор), чтобы премьер скорости потока, необходимого для стабильной генерации вихревого клеток-захвата в течение 1,5 мин.
10. Переключение активного порт решение от моющего раствора к клеточной решения ловушки клеток в электропорации камере в течение 30 сек (то есть этап клеток-ловушек).
11. Поток как стиральные и клеточные решения через устройство одновременно в течение 10 сек до стадии клеточного захвата, чтобы обеспечить бесперебойное потока во время стадии раствор переключения. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот краткий шаг совместное прохождение следует повторить на каждом шаге решения переключения.
12. Включение стиральной порта и промыть устройство в течение 20 сек, чтобы удалить не-ловушке загрязняющих клетки.
13. Введите раствора, содержащего первую интерес молекулу (0,2 мг / мл 3000 Да молекул нейтральной и анионной декстран или 1,5 мг / мл 70000 Da нейтральной молекуле декстрана) в устройство.
14. Применить пять коротких импульсов (T = 30 мс с 2-секундными интервалами) сразу же после инъекциимолекулярный раствор и контролировать масштабы и продолжительность применяемых электрических импульсов в реальном времени с помощью осциллографа.
15. Повторите шаг 3,10 столько раз, сколько количество дополнительных молекул должны быть доставлены. Для каждого молекулярной доставки, инкубировать клетки для 100 с в молекулярном растворе затем промойте устройство с моющим раствором для 100 с для удаления избытка молекул.
16. Выпуск клеток в 96-луночный планшет для анализа вниз по течению за счет снижения рабочего давления при температуре ниже 5 фунтов на квадратный дюйм. Примечание: Приблизительно 100 мкл раствора с 100 клеток собрана из каждого выпуска.
17. Запуск экспериментального шаги 3,9 через 3,16 три раза, чтобы собрать достаточно клеток для проточной цитометрии.
18. Центрифуга 96-луночный планшет, содержащий обработанные клетки в течение 5 мин при 228 х г.
19. Удалить супернатант, содержащий лишние молекулы флуоресцентные.
20. Ресуспендируют клеток в DPBS для проточной цитометрии.
21. Датчики в проточной цитометрии для молекулярной Uptake анализ эффективности.

Results

Разработанная параллельно Микрожидкостных Электропоратор доставлен макромолекулы с различных размеров и электрических зарядов в живых метастатических клеток рака молочной железы. Успешное молекулярная поставки был качественно определены путем мониторинга изменений в интенсивности флуоресценции по орбите электропорации клеток в месте, и подтверждается количественных измерений с помощью проточной цитометрии. Фиг.4А показывает, что 90% клеток, обработанных поглощение на 70000 Da нейтральный декстр...

Discussion

С новым распараллелить электропорации платформы, повышение в 10 раз в пропускной способности и эффективности системы оказания мульти-молекулы была достигнута в дополнение ко всем достоинствам, которые обеспечивает ранее разработанная система однокамерный. ⁺¹⁸ Ранее доступные заслуги включают (I) предварительной очистки клетки-мишени с равномерным распределением по размерам для повышения жизнеспособности, (II) и точного индивидуального молекулярного контроля дозы, и (III) низкой эксплуатационной электрического...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MDA-MB-231 Линия раковых клеток	American Type Culture Collection (ATCC)	HTB-26
Leibovitz' s L-15 Medium	Cellgro, Mediatech, Inc.	10-045-CV
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Gibco, Life Technologies	16000-044
Пенициллин-стрептомицин	Sigma-Aldrich	P4333
Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS)	Cellgro, Mediatech, Inc.	21-030
Трипсин	Gibco, Life Technologies	25200-056
Проточный цитометр easyCyte HT	Millipore	0500-4008
Кислородный плазменный очиститель	Technics Micro-RIE
Dektak 6M профилограф поверхности	Veeco
KMPR 1050	Microchem
SYLGARD 184 СИЛИКОНОВЫЙ ЭЛАСТОМЕР	KIT Dow Corning
Сжатый азот	газообразный воздушный газ	NI 300
Регулятор высокого давления	McMaster-Carr	6162K22
Регулятор ниже по потоку	McMaster-Carr	4000K563
Высокоскоростной коллектор с 3/2-ходовым 8 клапанами	Festo
Встроенный обратный клапан	Idex Health and Science	CV3320
5/32" OD x 3/32" ID Полиуретановые трубки	Pneumadyne	PU-156F-0
1/4" OD X 0,17" ID Полиуретановые трубки	Pneumadyne	PU-250PB-4
1/16" PEEK трубки	Festo	P1533
1/32" PEEK Трубки	Idex Health and Science	P1569
PEEK Соединения трубок	Idex Health and Science	P881
Генератор импульсов	HP	8110A Алюминиевая
проволока Bob	Martin Company	6061 ALUM
Осциллограф	Agilent	DSO3062A
центрифужные пробирки 50 мл	VWR	21008-178
Центрифужная пробирка 15 мл	VWR	21008-216
T75 колба для культуры	VWR	82050-862
Декстран, Тетраметилродамин, 3 000 МВт, Анионный	Gibco, Life Technologies	D3307
Декстран, Тетраметилродамин, 70 000 МВт, Нейтральный.	Gibco, Life Technologies	D1819
Dextran, Texas Red, 3,000 МВт, нейтральный	Gibco, Life Technologies	D3329