Методическая статья

Функциональный анализ для Gap Junctional экспертизы; Электропорация прилипшие клетки на индий-оксид олова

DOI:

10.3791/51710

⸱

18 октября 2014 г.

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology and Department of Pathology, Queen's University, 2Ask Science Products Inc.

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта презентация демонстрирует метод, при котором электропорация адгезивных, культивируемых клеток используется для изучения межклеточной, соединительной коммуникации, в то время как клетки растут на предметном стекле, покрытом проводящим и прозрачным оксидом индия-олова.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом методе клетки культивируются на предметном стекле, частично покрытом оксидом индия-олова (ITO), прозрачным, электропроводящим материалом. Различные молекулы, такие как пептиды или олигонуклеотиды, могут быть введены практически в 100% клеток нетравматичным способом. Здесь мы опишем, как это может быть использовано для изучения межклеточной коммуникации в щелевом соединении. Желтый люцифер проникает в клетки, когда электрический импульс, приложенный к проводящей поверхности, на которой они растут, вызывает образование пор через клеточную мембрану. Это и есть электропорация. Клетки, растущие на непроводящей стеклянной поверхности, непосредственно прилегающей к электропорированной области, не поглощают желтый Люцифер путем электропорации, но приобретают флуоресцентный краситель, когда он проходит к ним через щелевые соединения, которые связывают их с электропорированными ячейками. Результаты переноса красителя от клетки к клетке можно наблюдать под микроскопом при флуоресцентном освещении. Этот метод позволяет точно количественно оценить связь между зазорами. Кроме того, он может быть использован для введения пептидов или других непроницаемых молекул, а перенос небольших электропорированных пептидов через щелевые соединения для ингибирования сигнала в соседних, неэлектропорированных клетках является мощной демонстрацией ингибирования сигнала.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Применение электрического тока в клетку приводит к образованию пор на клеточной мембране, с помощью процесса, называют электропорации. Поры обеспечивают прохождение различных nonpermeant молекул через мембрану. Электрическое поле может управляться точно, так что поры, образованные очень малы и быстро повторного, с минимальным нарушением к клеточной физиологии. Интересно, прилипшие клетки могут быть выращены на предметное стекло, покрытой проводящим и прозрачной оксида индия-олова (ITO) и электропорации на месте, то есть на поверхности, где они растут, не будучи оторванными быть электропорации в суспензии. Клетки могут расти очень хорошо на этой поверхности, и как они связаны и расширен, детальное микроскопическое наблюдение можно. При использовании этого метода, небольшие nonpermeant молекулы могут быть введены мгновенно и в по существу 100% клеток, что делает этот метод особенно подходит для исследований по активации компonents из тропе следующие лиганда стимуляции рецепторов (обзор 1).

Электропорация был использован в основном для введения ДНК (также называется electrotransfection). Тем не менее, электропорацию на месте может быть полезным для введения большого разнообразия молекул, таких как пептиды 2-4, олигонуклеотидов, таких как антисмысловой РНК, двухцепочечных олигонуклеотидов ДНК-ловушек для ингибирования связывания фактора транскрипции, и миРНК 3,5, 6, радиоактивные нуклеотиды 7-10, белки 11 12 или пролекарства 13. После электропорации клетки можно лизировать для биохимических анализов или фиксировали и окрашивали антителами.

Проводящий ITO покрытия является очень тонким, 800-1,000Å, таким образом, что рост клеток не нарушается по разнице в высоте двух поверхностей, как клетки растут по краю проводящего покрытия. Это дает то преимущество, что не-electropораторствовал клетки могут быть выращены бок о бок с электропорации те, в качестве контрольной группы. Тот же самый подход может быть использован для изучения зазора соединительного, межклеточных взаимодействий (GJIC), как описано в видео.

Щелевые контакты каналы, соединяющие интерьеры соседних ячеек 14. Зазор узловой, межклеточной коммуникации играет важную роль в формировании опухоли и метастаз, а онкогены, такие как Src подавить GJIC 15,16. Чтобы исследовать GJIC флуоресцентный краситель, такой как Lucifer желтый (LY) часто вводят в культивируемые клетки с помощью микроинъекции или царапать-нагрузку 17 и диффузии красителя в соседних ячеек под микроскопом наблюдали под флуоресцентным освещением. Эти методы, однако, неизменно вызывают повреждения клеток. Опишем технику, где клетки, выращенные на предметное стекло, которое частично покрытой ITO 18. Электрический импульс был применен в присутствии LY (или других красителей) чаиспользуя ее проникновение в клетки, растущие на проводящей части слайда, в то время как миграция красителя с соседними, не-электропорации клеток под микроскопом наблюдается через флуоресценции освещения. Чтобы не беспокоить чувствительные клетки, которые могут иметь тенденцию отделить от монослоя, сборка была разработана, что не требует электрод должны быть размещены в верхней части клеток для применения электрического тока 19. Этот подход дает возможность количественного GJIC в большом количестве клеток, без обнаруживаемого помех на клеточный метаболизм, как показано отсутствие эффекта от длины фазе G1 следующей сыворотки стимуляции 12, увеличение уровней ФОС протоонкоген белок (Raptis, не опубликовано) или две киназы, связанные с клеточным стрессом, р38 свиней или JNK / SAPK киназы 1. Такой подход сделал возможным изучение связи между уровнем экспрессии онкогенов, преобразования и ГДжИК 18, а также эффект Src и Stat3 на GJIC в различных типах клеток, в том числе клеток, культивированных из свежих опухолей легких образцов 20-23. Кроме того, на месте электропорации на установке, описанной в котором отсутствует верхний электрод успешно применяется для демонстрации закрытия щелевых контактов по adipocytic дифференциации, хотя сотовой крепления к подложке снижается на этом этапе 19,24.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 Покрытие ячеек в электропорации палат

  1. В ламинарном потока, Trypsinize клетки с использованием стерильной техники, как обычно.
    Примечание: Очень важно, чтобы устранить путем центрифугирования все следы трипсина, так как они могут помешать распространению клеток на стекле, следовательно, образование слипчивых и щелевых контактов.
  2. Внесите 1 мл клеточной суспензии в стерильных камерах электропорации, поставляемых с на месте электропоратора (рисунок 1), и место в 37 ° С, CO 2 инкубаторе.
    Примечание: адгезию клеток может быть улучшена путем высева на фибронектин, коллаген, поли-лизин или клеточной и тканевой клей (см материалы таблицу).
  3. Когда клетки сформировали сливающийся слой они готовы к GJIC экспертизы.

2 Электропорация Порядок

Электропорация для экспертизы GJIC может проводиться вне ламинарном потока,так как это занимает всего несколько минут. Если более длинные периоды инкубации требуется для конкретного эксперимента, то она может быть проведена полностью в вытяжном шкафу с ламинарным потоком. Во всех случаях, камеры, где выращивают клетки должны быть стерильными.

  1. Подготовьте 5 мг / мл Люцифера желтый раствор: растворить 10 мг LY порошок (поставляется с электропоратора) в 2 мл кальция среде без роста. Для экспериментов, что требует большего времени инкубации, фильтр-стерилизовать решение и хранят при 4 ° С.
  2. Аспирируйте питательную среду и промыть клетки с бескальциевой среды, стараясь не поцарапать монослой или высушить клетки. Если клетки сушат они обычно имеют более темные ядра и забрать LY без электропорации. Эффект более выражен в середине слайда, который подвергается воздействию более потоков воздуха (4F) Рис.
  3. С пипетки Eppendorf, пипетки раствора красителя к клеткам (400 мкл для всей камере), на краю камеры, бEing осторожны, чтобы не коснуться слой клеток.
  4. Поместите камеру в держателе, поставляемой с электропоратора и применить импульс соответствующей величины (см Обсуждение).
  5. Тщательно аспирата некоторые решения LY. Она может быть использована во второй раз менее важных экспериментов.
  6. Добавить бескальциевой DMEM, содержащей 10% диализу сыворотку.
  7. Инкубируйте клетки в течение 3-5 мин в инкубаторе, чтобы обеспечить передачу краску через щелевые контакты.
    Примечание: Включение диализованного сыворотки в этой точке помогает закрытие пор.
  8. Вымойте неинкорпорированную краситель с бескальциевой DMEM для живого наблюдения клеток. С другой стороны, клетки могут быть закреплены на этой стадии, путем добавления 4% формальдегидом в скважине, а затем промывали PBS (фосфатно-солевой буфер). Во всех случаях стиральная должны удалить все фон.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В предварительные эксперименты, чтобы определить оптимальные условия, если напряжение слишком низкое, то можно позволить клетки восстановить в incubatoг в течение нескольких минут и электропорации одном слайде во второй раз, чтобы сохранить в стоимость горок.

3 Микроскопическое исследование

  1. Соблюдайте клетки под флуоресцентным освещением, использованием инвертированного микроскопа, оснащенный соответствующим фильтром для красителя используется. Для Люцифера желтого, возбуждение 423nm, 555nm выбросов, WBV фильтр для микроскопом Nikon IX70.
  2. Ликвидировать последствия мениска путем размещения стеклянной крышкой скольжения в верхней части пластика также, после заполнения его к вершине с жидкостью, чтобы изучить клеток морфологию под фазового контраста. Для улучшения изображений, также может быть отделен от ползуна, и покровное размещены на раме. При фиксированных клеток, также могут быть заполнены с глицерином для микроскопического наблюдения, в то время как для живых клеток она должна быть заполнена средой роста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стиральная и фотосъемка легче, если клетки фиксировали с формальдегидом после перевода красителя (шаг 2.7 выше). Если клетки нетT фиксировано, флуоресценции выводится из клеток в течение примерно 60 мин в зависимости от типа клеток, напряжения и количества обычно выводят в то время как в основной клеток флуоресценции сохраняется в течение нескольких часов. Однако, флуоресценция исчезает или рассеивается после O / N инкубации, даже в фиксированных клетках. По этой причине, фотографии должны быть приняты вскоре после электропорации (рисунок 2).

4 Количественное определение межклеточной коммуникации

  1. Сфотографировать клетки с 20-кратным цели под флуоресценции и фазового контраста (рисунок 3).
  2. Определите и отметьте со звездой электропорации клетки на границе с не-электропорации области (рис 2, стрелки, электропорации край).
  3. Определите и отметьте с точки флуоресцирующих клеток на не-электропорации стороны, где краситель передал через щелевые контакты (3А и 3В).
  4. Разделить общее количествофлуоресцирующих клеток на не-электропорации области по количеству электропорации клеток по краю (3А и 3В).
    Примечание: Передача по меньшей мере, 200 смежных электропорации клеток пограничных рассчитывается для каждого эксперимента. Полученное число является значением GJIC.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 2 показан печени крыс эпителиальных T51B клетки 22, электропорации с LY и сфотографированных под флуоресценции (панели А и Б), или фазоконтрастной (C) освещение, следующие фиксации и промывки. В панели А, край электропорации области отмечены красным цветом. Градиент флуоресценции справа от красной линии обозначает передачу через щелевые контакты. На рисунке 3А и 3В, количественный анализ разрыв соединительного связи показано: Клетки на краю электро...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Критические шаги в протоколе

Электропорации материал
Чистота материала, подлежащего электропорации является очень важным. Если клетки очень плоским, то более высокие концентрации красителя для отслеживания должны быть использованы (до 20 мг / мл в течение ют) и в таких случаях, чистота еще более важное значение, чем в клетках с более сферической формы 1. Кроме того, LY были использованы большое разнообразие других красителей или nonpermeant молекул, таких как...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Автор, отвечающий за переписку, является изобретателем в патенте, принадлежащем Королевскому университету, который был лицензирован компанией Cell Projects Inc. Ни компания, ни университет не имели никакого влияния на содержание статьи.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Лоуэлла Кокрана за экспертную помощь в видеосъемке. Выражаем благодарность за финансовую помощь Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR), Канадского фонда по борьбе с раком молочной железы (CBCF, Ontario Chapter), Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC), Канадского альянса по исследованию рака молочной железы, Центров передового опыта Онтарио, Breast Cancer Action Kingston и Фонда завещания Клэр Нельсон в виде грантов для LR. SG был стипендиатом NSERC. MG была поддержана постдокторской стипендией от Программы армии США по борьбе с раком молочной железы, Министерства исследований и инноваций провинции Онтарио и Консультативного исследовательского комитета Королевского университета.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEMCellgro http://www.cellgro.com/50-013-PB
DMEM безгиклона кальция (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com)SH30319-01
Сыворотка донора для телят PAA: http://www.paa.com/Cat.# B15-008
Фетальная бычья сывороткаPAA: http://www.paa.com/Cat.# A15-751
Аппарат для электропорацииCell Projects Ltd Великобритания: http://www.cellprojects.com/ACE-100
ChambersCell Projects Ltd UKACE-04-CC4-лунки
ChambersCell Projects Ltd UKACE-08-CC8-лунки
Lucifer YellowCell Projects Ltd UKACE-25-LYВысокая чистота
CelTakBD Biosciences354240Клеточный и тканевый адгезив
ФибронектинSigma AldrichF1141
КоллагенBD Biosciences354236
полилизинаSigma AldrichP8920

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raptis, L., et al. Electroporation of Adherent Cells in Situ for the Study of Signal Transduction and Gap Junctional Communication. Electroporation protocols. , The Humana Press Inc. edited by S Li 167-183 (2008).
  2. Giorgetti-Peraldi, S., Ottinger, E., Wolf, G., Ye, B., Burke, T. R., Shoelson, S. E. Cellular effects of phosphotyrosine-binding domain inhibitors on insulin receptor signalling and trafficking. Mol Cell Biol. 17, 1180-1188 (1997).
  3. Boccaccio, C., Ando, M., Tamagnone, L., Bardelli, A., Michielli, P., Battistini, C., Comoglio, P. M. Induction of epithelial tubules by growth factor HGF depends on the STAT pathway. Nature. 391, 285-288 (1998).
  4. Bardelli, A., Longati, P., Gramaglia, D., Basilico, C., Tamagnone, L., Giordano, S., Ballinari, D., Michieli, P., Comoglio, P. M. Uncoupling signal transducers from oncogenic MET mutants abrogates cell transformation and inhibits invasive growth. Proc Nat Acad Sci USA. 95, 14379-14383 (1998).
  5. Gambarotta, G., Boccaccio, C., Giordano, S., Ando, M., Stella, M. C., Comoglio, P. M. Ets up-regulates met transcription. Oncogene. 13, 1911-1917 (1996).
  6. Arulanandam, R., Vultur, A., Raptis, L. Transfection techniques affecting Stat3 activity levels. Anal Biochem. 338 (1), 83-89 (2005).
  7. Boussiotis, V. A., Freeman, G. J., Berezovskaya, A., Barber, D. L., Nadler, L. M. Maintenance of human T cell anergy: blocking of IL-2 gene transcription by activated Rap1. Science. 278 (5335), 124-128 (1997).
  8. Brownell, H. L., Firth, K. L., Kawauchi, K., Delovitch, T. L., Raptis, L. A novel technique for the study of Ras activation; electroporation of [alpha-32]GTP. DNA Cell Biol. 16, 103-110 (1997).
  9. Tomai, E., Vultur, A., Balboa, V., Hsu, T., Brownell, H. L., Firth, K. L., Raptis, L. In situ electroporation of radioactive compounds into adherent cells. DNA Cell Biol. 22, 339-346 (2003).
  10. Raptis, L., Vultur, A., Tomai, E., Brownell, H. L., Firth, K. L. In situ electroporation of radioactive nucleotides: assessment of Ras activity and 32P-labelling of cellular proteins. Cell Biology A Laboratory Handbook, Celis, Ed. 43, 329-339 (2006).
  11. Nakashima, N., Rose, D., Xiao, S., Egawa, K., Martin, S., Haruta, T., Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. The functional role of crk II in actin cytoskeleton organization and mitogenesis. J Biol Chem. 274, 3001-3008 (1999).
  12. Raptis, L., Firth, K. L. Electroporation of adherent cells in situ. DNA Cell Biol. 9, 615-621 (1990).
  13. Marais, R., Spooner, R. A., Stribbling, S. M., Light, Y., Martin, J., Springer, C. J. A cell surface tethered enzyme improves efficiency in gene-directed enzyme prodrug therapy. Nat Biotechnol. 15, 1373-1377 (1997).
  14. Nielsen, M. S., Nygaard, A. L., Sorgen, P. L., Verma, V., Delmar, M., Holstein-Rathlou, N. H. Gap junctions. Compr Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).
  15. Geletu, M., Trotman-Grant, A., Raptis, L. Mind the gap; regulation of gap junctional, intercellular communication by the SRC oncogene product and its effectors. Anticancer Res. 32 (10), 4245-4250 (2012).
  16. Vinken, M., Vanhaecke, T., Papeleu, P., Snykers, S., Henkens, T., Rogiers, V. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
  17. Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer: A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp Cell Res. 168, 430-442 (1987).
  18. Raptis, L., Brownell, H. L., Firth, K. L., MacKenzie, L. W. A novel technique for the study of intercellular, junctional communication; electroporation of adherent cells on a partly conductive slide. DNA & Cell Biol. 13, 963-975 (1994).
  19. Anagnostopoulou, A., Cao, J., Vultur, A., Firth, K. L., Raptis, L. Examination of gap junctional, intercellular communication by in situ electroporation on two co-planar indium-tin oxide electrodes. Mol Oncol. 1, 226-231 (2007).
  20. Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, S., Campling, B. G., Raptis, L. A functional assay for intercellular, junctional communication in cultured human lung carcinoma cells. Lab Invest. 78, 639-640 (1998).
  21. Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, L. Gap junctional communication in lung carcinoma cells. Lung Cancer. 23, 223-231 (1999).
  22. Geletu, M., Chaize, C., Arulanandam, R., Vultur, A., Kowolik, C., Anagnostopoulou, A., Jove, R., Raptis, L. Stat3 activity is required for gap junctional permeability in normal epithelial cells and fibroblasts. DNA Cell Biol. 28, 319-327 (2009).
  23. Geletu, M., Arulanandam, R., Greer, S., Trotman-Grant, A., Tomai, E., Raptis, L. Stat3 is a positive regulator of gap junctional intercellular communication in cultured, human lung carcinoma cells. BMC Cancer. 12, 605(2012).
  24. Brownell, H. L., Narsimhan, R., Corbley, M. J., Mann, V. M., Whitfield, J. F., Raptis, L. Ras is involved in gap junction closure in mouse fibroblasts or preadipocytes but not in differentiated adipocytes. DNA & Cell Biol. 15, 443-451 (1996).
  25. Weber, P. A., Chang, H. C., Spaeth, K. E., Nitsche, J. M., Nicholson, B. J. The permeability of gap junction channels to probes of different size is dependent on connexin composition and permeant-pore affinities. Biophys J. 87 (2), 958-973 (2004).
  26. Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human Adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
  27. Arulanandam, R., Vultur, A., Cao, J., Carefoot, E., Truesdell, P., Elliott, B., Larue, L., Feracci, H., Raptis, L. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Mol Cancer Res 7. , 1310-1327 (2009).
  28. Williams, E. J., Dunican, D. J., Green, P. J., Howell, F. V., Derossi, D., Walsh, F. S., Doherty, P. Selective inhibition of growth factor-stimulated mitogenesis by a cell-permeable Grb2-binding peptide. J. Biol. Chem. 272, 22349-22354 (1997).
  29. Raptis, L., Brownell, H. L., Vultur, A. M., Ross, G., Tremblay, E., Elliott, B. E. Specific inhibition of Growth Factor-stimulated ERK1/2 activation in intact cells by electroporation of a Grb2-SH2 binding peptide. Cell Growth Differ. 11, 293-303 (2000).
  30. Meda, P. Assaying the molecular permeability of connexin channels. Methods Mol Biol. 154, 201-224 (2001).
  31. Hofgaard, J. P., Mollerup, S., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Quantification of gap junctional intercellular communication based on digital image analysis. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 297 (2), R243-R247 (2009).
  32. Raptis, L., Lamfrom, H., Benjamin, T. L. Regulation of cellular phenotype and expression of polyomavirus middle T antigen in rat fibroblasts. Mol Cell Biol. 5, 2476-2486 (1985).
  33. Raptis, L., Marcellus, R. C., Whitfield, J. F. High membrane-associated protein kinase C activity correlates to tumorigenicity but not anchorage-independence in a clone of mouse NIH 3T3 cells. Exp Cell Res. 207, 152-154 (1993).
  34. Vultur, A., Cao, J., Arulanandam, R., Turkson, J., Jove, R., Greer, P., Craig, A., Elliott, B. E., Raptis, L. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
  35. Vultur, A., Arulanandam, R., Turkson, J., Niu, G., Jove, R., Raptis, L. Stat3 is required for full neoplastic transformation by the Simian Virus 40 Large Tumor antigen. Mol Biol Cell. 16, 3832-3846 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи