Методическая статья

ДНК-аффинно очищенного Чип (DAP-чип) Метод определения целей гена для бактериальных двухкомпонентный регуляторных систем

15.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51715

⸱

21 июля 2014 г.

 ,  , 
1Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory

В этой статье

Краткое содержание

Это видео статье описывается микрочипов на основе метода в пробирке для определения целевых генов и сайты связывания для двухкомпонентных регуляторов срабатывания системы.

Аннотация

В методах естественных условиях, таких как чип-чип являются хорошо зарекомендовавшие себя методы, используемые для определения глобальных целей гена для транскрипционных факторов. Тем не менее, они имеют ограниченное применение в изучении бактериальных двухкомпонентных систем регулирования с неохарактеризованных условиях активации. Такие системы регулировать транскрипцию только при активации в присутствии уникальных сигналов. Так как эти сигналы часто неизвестно, пробирке микрочипов на основе метода в описано в этой статье видео может быть использован для определения генов цели и сайты связывания для регуляторов реагирования. Этот метод ДНК-аффинно очищенного-чип может быть использован для любого очищенного регулятора в любом организме с виртуализированного генома. Протокол включает позволяя очищают отмеченных белка для связывания с стриженой геномной ДНК, а затем очистки сродство ДНК связанной с белком, а затем флуоресцентного мечения ДНК и гибридизации в массив пользовательских плитки. Предыдущие шаги, которые могут быть использованы для оптимизации анализа для спецификациирегуляторы грн, также описаны. Пики, полученные в результате анализа данных массива используются для прогнозирования обязательные мотивы сайта, которые затем экспериментально проверенные. Предсказания мотив может быть дополнительно использован для определения генов целей ортологичных регуляторов реагирования в близкородственных видов. Мы продемонстрировать применимость этого метода путем определения генов цели и связывающие мотивы сайта и таким образом предсказывать функцию для sigma54 зависит от регулятора ответ DVU3023 в экологической бактерии Desulfovibrio обыкновенная Hildenborough.

Введение

Способность бактерий, чтобы выжить и процветать в решающей степени зависит от того, как хорошо они способны воспринимать и отвечать возмущений в их среде, а это, в свою очередь, зависит от их систем передачи сигнала. Количество сигнальных систем бактерия кодирует вектор был назван его "микробная IQ" и может быть признаком как изменчивости его среды и ее способность чувствовать несколько сигналов и тонкой настройки его отклика 1. Два компонента системы передачи сигнала (TCS) являются наиболее распространенными системами сигнализации, используемые бактериями, и они состоят из гистидинкиназа (HK), что воспринимает внешний сигнал и передает через фосфорилирования к регулятору отклика эффектор (RR) 2. ОР могут иметь различные выходных доменов и, следовательно, различные режимы эффекторные, но наиболее распространенным ответом является регуляция транскрипции с помощью ДНК-связывающего домена 1. Сигналы зондирования и соответствующие функции протокат Большинство ТТС остаются неизвестными.

Хотя естественных условиях методы в таких, как чип-чип обычно используются для определения геномных сайтов связывания транскрипционных факторов 3, они могут быть использованы только для бактериальных RR, двухкомпонентная система, если условия активирующие или сигналы известны. Часто экологические сигналы, которые активируют TCS труднее определить, чем их генов мишеней. Пробирке микрочипов в основе анализа, описанного здесь, могут использоваться для эффективного и быстрого определения генов цели и прогнозировать функции ТТС. Этот анализ имеет преимущество в том, что РП может быть фосфорилирован и, таким образом активированного в пробирке с использованием малых молекул доноров, таких как ацетил фосфата 4.

В этом методе, названный DAP-чип для ДНК-аффинной очистке чипа (рис. 1), ген RR интересующий клонированный с His-меткой в Е. палочка, и отмеченных белок очищен разрешается биго по стриженой геномной ДНК. ДНК белком затем обогащается аффинной очистки, обогащенный и вход ДНК усиливаются, флуоресцентно меченных, объединяли и гибридизации с массивом плитки, которая на заказ для организма интереса (рис. 1). Microarray эксперименты подлежат артефактов и, следовательно, дополнительные шаги используются для оптимизации анализа. Одним из таких шагов является попытка определить одну цель для РР изучается с помощью электрофореза сдвига мобильность анализов (EMSA) (см. рабочий процесс на рисунке 2). Затем, после связывания с геномной ДНК и DAP шагов, ДНК белком и вход рассматриваются кПЦР чтобы увидеть, если положительный целевой обогащается во фракции белком относительно входного фракции, подтвердив тем самым оптимальное обязательные условия для RR (рис. 2). После массива гибридизации, данные анализируются, чтобы найти пиков высокой интенсивности сигнала, указывающие геномной локусов, где белок чобъявление связаны. Функции могут быть предсказаны на основе РР целевых генов, полученных. Целевые геномные локусы используются для прогнозирования обязательные мотивы сайта, которые затем экспериментально проверены с использованием EMSAs (рис. 2). Функциональные прогнозы и генные мишени для РР может быть продлен до близкородственных видов, которые кодируют ортологичные RRs путем сканирования эти геномы для аналогичных обязательных мотивов (рис. 2). Метод доступа DAP-чип может обеспечить большой объем информации для TCS, где ранее не было ни одного. Способ также может быть использован для любого транскрипционного регулятора, если белок может быть очищен и условиях связывания ДНК может быть определена, и для любого интересующего организма с последовательностью генома доступны.

figure-introduction-1
Рисунок 1. ДНК-аффинно очищенного-чип (DAP-чип) Стратегия 7. Ген RR от интересующего организма, клонируют с карбокси-концевой His-меткой в Е. Штамм выражение. Очищенный белок His-меченого активируется путем фосфорилирования с ацетил фосфата и смешивают с обрезной геномной ДНК. Аликвоту реакции связывания сохраняется в качестве входного ДНК, а остальные подвергают аффинной очистки с использованием Ni-NTA смолы. Входной и RR-связаны ДНК амплифицируют весь геном, и помечены с Cy3 и Cy5, соответственно. Меченый ДНК объединяли и гибридизовали в массив плитки, которую затем анализируют для определения генов мишеней. Рисунок изменен и перепечатана с помощью творческую лицензию общин от 7.

figure-introduction-2
Рисунок 2. Резюме процесса. Для любого очищенного меченого Proteiп, начать с определения цели использования Emsa. Разрешить белок связывать геномной ДНК, а затем ДНК-сродства-Purify (DAP) и весь геном усиления (WGA) обогатили и вход ДНК. Если ген-мишень, как известно, использовать КПЦР чтобы гарантировать, что известно целевой обогащен фракции белком. Если цель не могла быть определена, перейдем непосредственно к маркировке ДНК и массива гибридизации. Если обогащение кПЦР не могло быть обнаружено, а затем повторите белок-гДНК связывания и DAP-WGA шаги, используя различные количества белка. Используйте анализ массива найти пики и сопоставить их с генов-мишеней. Используйте вверх по течению регионы генов-мишеней для прогнозирования обязательные мотивы сайта. Подтвердить мотивы экспериментально с помощью EMSAs. Используйте мотив для сканирования геномы родственных видов, кодирующих Ортологи РР в стадии изучения, и предсказать гены целевых в тех видах, а также. На основе целей гена, полученных, физиологическая функция РР и его ортологов может быть предсказано. Рисунок изменен и перепечатана с помощью творческого грommons лицензировать с 7.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Протокол ниже предназначена для определения генов мишеней РР DVU3023 от бактерии Desulfovibrio обыкновенная Hildenborough. Это могут быть адаптированы к любой другой транскрипционного регулятора интереса.

1. Клон и очистить рублей

  1. Клонировать ген RR, в частности DVU3023, от D. угри Hildenborough в палочки Escherichia экспрессирующий вектор таким образом, что ген C-терминально His-меткой и выражение под контролем промотора Т7.
    Примечание: Несколько методов клонирования могут быть использованы и определяется исследователем. Также могут быть использованы альтернативные метки сродства.
  2. Transform выражение построить в E. палочка BL21 (DE3) выражение штамм.
  3. Расти 1 л штамма экспрессии BL21 при 37 ° С В середины логарифмической фазы, добавляют IPTG до 0,5 мм для индуцирования экспрессии белка. Продолжить рост при комнатной температуре в течение 24 часов.
  4. Центрифуга клетки при 5000 мкг в течение 10 мин при 4 ° С. Ресуспендируют клеток в буфере для лизиса (20 мМ фосфат натрия, рН 7,4, 500 мМ NaCl, 40 мМ имидазола, 1 мг / мл лизоцима, 1x Benzonase нуклеазы). Клетки лизируют с использованием французского пресса при 4 ° С.
  5. Центрифуга лизат при 15000 х г в течение 30 мин при 4 ° С. Фильтр с использованием шприцевой фильтр 0,45 мкм.
  6. Промыть 1 мл колонку Sepharose Ni на FPLC инструмента с использованием 10 мл промывочного буфера (фосфат 20 мМ натрий, рН 7,4, 500 мМ NaCl, 40 мМ имидазол).
  7. Загрузите лизат на колонке. Промыть колонку с 20 мл промывочного буфера.
  8. Элюировать DVU3023 с использованием градиента 0-100% элюирующего буфера (20 мМ фосфат натрия, рН 7,4, 500 мМ NaCl, 500 мМ имидазол).
  9. Загрузить элюированных фракций на колонке обессоливания и промывают обессоливающей буфера (20 мМ фосфат натрия, рН 7,4, 100 мМ NaCl).
  10. Центрифуга образец белка в высокой молекулярной массой среза фильтра центрифуги к концентрации белка. Добавить DTT до 0,1 мм и глицерина до 50% белка и хранить при -20 ° С.
    Примечание: методы очистки должны быть оптимизированы индивидуально для каждого белка на стадии изучения.

2. Определите гена-мишени для RR Использование электрофоретической подвижности Shift, анализ (EMSA)

  1. ПЦР-амплификации 400 п.н. области выше гена-мишени кандидат DVU3025, используя D. угри Hildenborough геномной ДНК в качестве матрицы и вперед немеченого праймера и обратного 5'-биотин-меченый праймер.
    Примечание: Советы для выбора целевой ген-кандидат: Часто ОР связывать вверх по течению регионы собственной гена / оперона, или они могут регулировать проксимально закодированные гены. Если RR имеет ортологи в других видах, искать генов, которые сохраняются в районе. Альтернативные методы включают выбор генов-кандидатов на основе регулона предсказаний (например, RegPrecise 5), или прогнозирования sigma54 зависит от промоутеров 6 для RR, которые сами sigma54-зависимыми.
  2. Запуск ПЦР-продукта на 1% агарозном геле, вырезали 400 бр размера продукта и очистить ДНК с помощью экстракции геля очистить комплект.
  3. Смешайте DVU3023 белок (0,5 пмоль) с 100 фмоль биотинилированного субстрата ДНК в 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 50 мМ KCl, 5 мМ MgCl 2, 1 мМ DTT, 25% глицерина и 1 мкг / мл поли dI.dC (не конкретной ДНК конкурента) в общем объеме 20 мкл. Также создана реакции без белка в качестве контроля. Инкубируйте реакции при комнатной температуре на скамейке в течение 20 мин.
  4. Примечание: Это стандартные условия, перечисленные и другие компоненты реакции могут быть добавлены в зависимости от RR интересов. Если активация желательно добавить 50 мМ ацетил фосфата в реакции (ОР часто связывается ДНК в пробирке без активации).
  5. Предварительно запустить сборного мини 6% полиакриламидном-0.5x TBE гель в 0,5 х КЭ буфера при 100 V в течение 30 мин. Добавьте 5 мкл 5x загрузки буфера (0,1% бромфеноловый синий, 0,1% ксилолцианола, 30% глицерина в 1x КЭ) в реакциях связывания и нагрузки 18 мкл реакции на в гэль. Запуск при 100 V в течение 2 часов.
    Примечание: Во избежание перегрева, что может привести к диссоциации комплексов белок-ДНК, заполнить внешнюю буферную камеру в системе электрофореза с рабочим буфером таким образом, что большинство из геля изолирован буфера. С другой стороны, гель может быть запущен при 4 ° С.
  6. Cut заряженную нейлоновую мембрану с размером геля и замочить в 0,5 × ТВЕ по крайней мере десять минут. Снимите гель из кассеты. Вырезать любые хребты от геля и сэндвич гель и мембрану между двумя толстыми фильтровальной бумаги, пропитанные 0,5 х КЭ, и разместить в полусухого блоттинга аппарата и работать на 20 В в течение 30 мин.
  7. Поместите мембрану внутри коммерческой ультрафиолетовый свет сшивателя инструмента и установите время до 3 мин.
    Примечание: Мембрана может теперь быть сохранены сухой при комнатной температуре в течение нескольких дней, прежде чем перейти к следующему шагу.
  8. Используйте имеющийся в продаже хемилюминесцентную набора определения, который использует стрептавидин-хрен peroxidaсебе сопряжены развивать кляксу в соответствии с инструкциями изготовителя.
  9. Изображение пятном с помощью компьютера подключены к CCD оборудован камерой и искать сдвига в мобильности подложки ДНК в присутствии РР, который указывает, что RR связывает ДНК проходит испытания.
    Примечание: Специфичность сдвига белок-ДНК может быть проверена в том числе в реакции избыток немеченого конкурента ДНК, которое должно устранить или уменьшить сдвиг видел.

3. Убедитесь, Target обогащение после геномную ДНК-связывания с белками

  1. Геномная ДНК-белок Реакцию связывания
    1. Shear геномной ДНК со средним размером 500 п.н. обработкой ультразвуком 100 мкл геномной ДНК (при концентрации 100-200 нг / мкл) в 1,5 мл пробирке с использованием микронаконечник с 9 низких импульсов амплитудой до 1 сек, 2 сек с зазором между ними каждый.
      Примечание: Если брызги ДНК к сторонам трубки, спин вниз содержимое после каждых 3 импульсов. Точные условия, используемыеварьирует в зависимости от используемого инструмента обработки ультразвуком. В сдвиговых фрагменты ДНК может находиться в диапазоне от 100-1000 п.о., но средний размер должен быть в пределах 400-600 п.н.. Слишком много сдвига может привести к уменьшению числа неповрежденных участков связывания, и либо слишком много или слишком мало сдвига повлияет библиотеки подготовку в течение последующих целых шагов геном усиления.
    2. Смешайте 2-3 мкг геномной ДНК обрезной с RR белка (0,5 пмоль DVU3023) в 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 1 мМ DTT, 50 мМ KCl, 5 мМ MgCl 2, 25% глицерина, и 50 мМ ацетил фосфата. Инкубируйте реакции при 25 ° С в течение 30 мин. Передача 10 мкл этой реакции на 1,5 мл трубки и этикетки в качестве входных данных ДНК.
      Примечание: ацетил фосфат добавляется для активации фосфорилированием белка в пробирке. Фосфорилирование стимулирует ДНК-связывающие, но многие ОР также связывать ДНК в пробирке без активации 7. Количество белка добавляют к реакционной смеси, будет зависеть от активности белка преп. EMSA могут быть использованы, чтобы выбратьimize эту сумму.
  2. Affinity очистить ДНК связанной с белком
    1. Добавить 30 мкл Ni-NTA агарозы смолы в 0,6 мл пробирке. Центрифуга при 100 х г в течение 1 мин, чтобы собрать смолу на дне, и удалить супернатант. Добавить 100 мкл промывочного буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 5 мМ MgCl 2, 50 мМ KCl, 25% глицерина), фильм трубка смешивать и центрифуги при 100 мкг в течение 2 мин. Удалить супернатант.
    2. Добавить остальные 90 мкл реакции связывания с промытой Ni-NTA смолы и инкубировать в ротационном шейкере в течение 30 мин.
    3. Центрифуга при 100 мкг в течение 2 мин, и удалите супернатант (несвязанный ДНК). Добавить 100 мкл промывочного буфера, Флик трубку смешать содержимое, и центрифуге при 100 мкг в течение 2 мин. Удалить супернатант. Повторите стадии промывки в два раза больше.
    4. Добавить 35 мкл элюирующего буфера (фосфат 20 мМ натрий-буфера, рН 8, 500 мМ NaCl, 500 мМ имидазол) к смоле и перемешать на вортексе. Выдержите на скамейке при комнатной температуре в течение 5 мин. Центрифуга при 100 мкг в течение 2 мин. Передача супернатант в новую пробирку 1,5 мл и этикетки в виде фракции ДНК с белком.
    5. Кроме того, добавить 35 мкл элюирующего буфера с входным ДНК.
    6. Очищают вход и белковые фракции, связанного ДНК с использованием набора для очистки ПЦР.
  3. Всего геном усилить вход и образцы ДНК белок граница.
    1. Добавить 10 мкл входе и белком ДНК, чтобы отделить ПЦР пробирки. Добавить 1 мкл 10x фрагментации буфера, 2 мкл Подготовка Библиотека буфера и 1 мкл Библиотека стабилизации решения каждого образца. Хорошо перемешать встряхиванием. Тепло в амплификаторе при 95 ° С в течение 2 мин, и охладить на льду.
      Примечание: исходное количество ДНК должна быть не менее 10 нг того, чтобы избежать введения смещения усиления.
    2. Добавить 1 мкл библиотеки ферментный препарат, перемешать с помощью пипетки, и инкубировать в термоциклер при 16 ° С/20 мин, 24 ° C/20 мин, 37 ° C в течение 20 мин, 75 ° C / 5 мин, И удерживайте при 4 ° С.
    3. В каждую пробирку добавляют 47,5 мкл воды, 7,5 мкл 10х амплификации мастер-смеси и 5 мкл полимеразы. Хорошо перемешать и тепла при температуре 95 ° C / 3 мин, а затем 20 циклов при 94 ° С/15 сек, 65 ° C / 5 мин. Держите реакции при 4 ° С.
    4. Очищают усиленные образцы ДНК с использованием набора для очистки ПЦР и измерить концентрацию ДНК спектрофотометрически.
  4. Проверьте целевой обогащение в ДНК с белком с использованием КПЦР
    1. Дизайн КПЦР праймеров для амплификации 200 б.п. выше по потоку области EMSA-проверено гена-мишени (DVU3025), используя любой свободно распространяемый разработки программного обеспечения праймера.
    2. Настройка трех экземплярах КПЦР реакции для каждого шаблона ДНК с каждым набором праймеров. Подготовьте основной смеси для каждого набора праймеров. 1x мастер смесь содержит 10 мкл 2x Sybr Зеленый КПЦР смеси, 0,5 мкМ каждого праймера и воды в общей сложности 18 мкл. Алиготе 18 мкл мастер-микс на лунку в 96-луночный ПЦР планшет.
    3. Разбавлятьэ усиленный и очищенный вход и образцы ДНК белок связан с 5 нг / мкл водой и использовать в качестве ДНК-матрицы. Добавить 2 мкл ДНК-матрицы в лунки.
    4. Уплотнение тарелку с ультра ясной КПЦР уплотнительной пленкой, спин вниз пластину в центрифуге при 200g / 1 мин. Поместите пластинку в реальном времени КПЦР машины. Цикл следующим помощью связанных с ними КПЦР ПО: 95 ° C / 1 мин и 40 циклов 95 ° C/10 сек, 59 ° С/15 сек и 70 ° С/35 сек.
    5. Также настроен трех экземплярах реакции КПЦР с праймеров для амплификации вверх по течению регионы неродственного гена (отрицательный контроль).
    6. Рассчитать ΔC Т путем вычитания значения C т с белком ДНК, что входного ДНК. Рассчитать раза обогащение гена-мишени в ДНК с белком, как 2 ΔC T.
      Примечание: Если на входе область цель была обогащена в ДНК с белком против входного ДНК, это означает, что связывание реакции и аффинной очистки были Successful. Перейдите к шагу 4. Если обогащение восходящем районе целевой не наблюдалось, повторите обязательные реакции (шаг 3.1) с различным количеством белка.

4. Маркировка ДНК и Массив Гибридизация

  1. Этикетка Входной ДНК с Cy3 и обогащенного ДНК с Cy5
    ПРИМЕЧАНИЕ: Cy3 и Cy5 красители чувствительны к свету и следует позаботиться, чтобы сохранить освещенность до минимума.
    1. Смешайте 1 мкг ДНК с 40 мкл Cy3/Cy5-labeled 9-меры и регулировать громкость до 80 мкл водой.
    2. Тепло денатурация при 98 ° С в течение 10 мин в темноте (в амплификатор). Быстрый холод на льду в течение 2 мин.
    3. Добавить 2 мкл полимеразы Кленова (3'-5'-экзо -, 50000 ед / мл), 5 мМ дНТФ и 8 мкл воды для каждой реакции, хорошо перемешать и инкубировать при 37 ° С в течение 2 ч в темноте (в термоциклер).
    4. Добавить ЭДТА до 50 мМ, чтобы остановить реакцию и раствор NaCl до 0,5 М
    5. Образцы передачи до 1,5 мл пробирок CONTAining 0,9 объема изопропанола, инкубировать в темноте в течение 10 мин и центрифугируют при 12000 х г в течение 10 мин. Осадок должен быть розовый для Су3-меченого ДНК и синего для Су5-меченой ДНК.
    6. Промыть гранулу с 80%-ным этанолом (500 мкл) и центрифуге при 12000 х г в течение 2 мин. Воздушно-сухих гранул в течение 5-10 мин в темноте.
      Примечание: Гранулы можно хранить при -20 ° С.
    7. Ресуспендируют гранул в 25 мкл воды. Измерьте концентрацию ДНК спектрофотометрически.
    8. Бассейн вместе 6 мкг каждого из Cy-3 и Cy5-меченого ДНК в 1,5 мл трубки и сушат в вакууме с в центрифуге на медленном огне в темноте (покрытие крышки центрифуги, если она прозрачна).
      Примечание: Гранулы можно хранить при температуре от -20 ° С до готовности для гибридизации.
  2. Микрочипов Гибридизация
    1. Включите систему гибридизации на 3-4 ч до использования и установить температуру до 42 ° C.
    2. Подготовьте гибридизации решение основной смеси такие, что решение 1x содержит 11,8 мкл 2x Hybridiзация буфера, 4,7 мкл Гибридизация Компонент А и 0,5 мкл выравнивание олиго.
    3. Ресуспендируют гранул в 5 мкл воды. Добавить 13 мкл этой смеси в образце. Vortex в течение 15 сек, инкубации при 95 ° С в сухом бане в течение 5 мин. Хранить образцы при 42 ° С в гибридизации системы до готовности к загрузке.
    4. Подготовьте микрочипов слайд-смесительной, в соответствии с протоколом производителя.
    5. Поместите смеситель-слайд-сборку в системе гибридизации. Нагрузка 16 мкл образца в заливное отверстие, герметизации порта с клейкой пленкой, повернуть на смешивание в системе, и гибридизуются в течение 16-20 ч при 42 ° С.
    6. Приготовьте 1х стирки буферы I (250 мл), II (50 мл) и III (50 мл) при разбавлении 10-кратного коммерчески доступные буферы в воде, и в каждый добавить DTT до 1 мм. Теплый буфера я до 42 ° С.
    7. Наденьте смеситель-слайд в разборки инструмента, и место внутри блюдо с теплым буфера I. Peel смеситель с, в то время активно шAking разборки инструмент вручную.
    8. Поместите слайд в контейнер с 50 мл промывочного буфера I и энергично встряхивают в течение 2 мин вручную.
    9. Передача слайд во вторую емкость с 50 мл промывочного буфера II и энергично встряхивают в течение 1 мин вручную.
    10. Передача слайд в третьем контейнере с 50 мл промывочного буфера III, и энергично встряхивают в течение 15 сек вручную.
    11. Быстро промокните края слайда на бумажное полотенце, и поместите в режиме слайд-стойку. Центрифуга при 200 мкг в течение 2 мин, чтобы высушить слайд. Поместите в случае слайд, оберните его фольгой, и хранить в эксикаторе.
  3. Сканирование массива
    1. Поместите слайд в микрочипов сканера в соответствии с инструкциями инструмента.
    2. Используйте программное обеспечение сканера для установки длины волны, как 532 нм = Су3 и 635 нм = Cy5, а начальные успехи ФЭУ между 350 и 400.
    3. Предварительный просмотр слайд, чтобы найти массив на слайде. Выберите регион массива для сканирования.
    4. Сканирование массив и настроить параметры ФЭУ, так что особенности массива в основном желтого цвета. Гистограмма должна показать красные и зеленые кривые накладываются или как можно ближе друг к другу, насколько это возможно. Кривые должны закончить выше 10 -5 нормированных пунктам в насыщения.
    5. Сохраните оба 532 и 635 нм изображения отдельно.
  4. Массив Анализ данных
    1. Импорт изображений в программное обеспечение для анализа массива. Использование программного обеспечения, создать два отчета пара (. Пара) для каждого массива (для Cy3 и Cy5 изображений). Создание масштабных журнал 2 Отношение файлы, используя парные файлы. Использование войти 2 Отношение файлов для поиска пиков с использованием скользящее окно 500 п.н.. Карта пиковую локусы в верховьях регионах генов мишеней.
    2. Убедитесь, что положительный цель (определяется с помощью EMSA и подтверждено кПЦР, DVU3025 в этом примере) появляется в лучших пиков.
      Примечание: Если положительная цель не среди лучших хитов, вполне возможно, что RR под Consiотменять имеет несколько целей генов и репликации DAP-чипы могут быть проведены и пики, общие для всех повторов может быть использован, чтобы генерировать целевой список.

5. Связывание сайта Мотив Прогнозирование и проверка

  1. Получить последовательности для добывающих регионах (400 б.п.) для лучших целей генных как порожденная анализа DAP-чипов. Применить мем на этих последовательностей через Микробы онлайн (meme.nbcr.net) предсказать мотивы.
    Примечание: Enhancer связывающие белки, такие как sigma54-зависимых регуляторов могут связываться несколько сотен пар оснований выше начальной сайте. Для других транскрипционных регуляторов, короче область, такие как 200 п.н. выше будет достаточно.
  2. Дизайн верхней и нижней ветви олигомеры ДНК, которые содержат предсказанный сайт связывания мотив в окружении 10 оснований на обоих концах. Заказать верхнюю прядь 5 'биотинилированного.
  3. Смешайте верхнюю и нижнюю нити в олигонуклеотидов 1:1,5 соотношении в 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА и 50 мМ NaCl вОбщий объем реакционной смеси 20 мкл в ПЦР пробирок. Нагревают до 95 ° С в течение 5 мин в термоциклере, с последующим медленным охлаждением до 25 ° С. Развести в десять раз и использовать в качестве дикого типа двухцепочечной ДНК субстрата для EMSA.
  4. Подготовка модифицированные субстраты, используя те же шаги, что и выше, но дизайн олигомеры нести 4-6 замен в консервативных основ обязательного мотив.
  5. Настройка реакции связывания с РР и дикого типа или модифицированных субстратов и изучить с помощью EMSA, как описано в шаге 2.
  6. Примечание: предсказал мотив проверяется если бы курс рубля связывает дикого типа подложки, но не изменение одного.

6. Сохранение Motif в других связанных с ними видов бактерий

  1. Выберите геномы интерес, содержащие Ортологи DVU3023. Получить последовательность и аннотации файлов для геномов с сайта NCBI.
  2. Используйте язык программирования, таких как Perl для написания сценариев, которые будут использовать мотив последовательности из целей DAP-чип построить позition взвешенная матрица и использовать матрицу забить подобные мотивы, присутствующие в других секвенированных геномов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Данный метод был применен для определения глобальных генных целей РРП в модельном сульфатвосстанавливающими бактерию Desulfovibrio обыкновенная Hildenborough 7. Этот организм имеет большое количество ТТС, представленную более чем 70 RR, с указанием широкий спектр возможных сигналов, что она чувствует и реагирует на. В естественных условиях анализы на функциях этих систем сигнализации трудно выполнить, так как их сигналы и таким образом их условия активирующие неизвестны. Здесь метод DAP-чип ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Метод доступа DAP-чип описано здесь был успешно использован для определения генов цели в течение нескольких записей ресурсов в Desulfovibrio обыкновенная Hildenborough 7, один из которых показан здесь как представитель результате. Для RR DVU3023, выбирая цель гена-кандидата был прямым. DVU3025 расположен непосредственно ниже гена RR и РР и гены-мишени сохраняются в нескольких видов Desulfovibrio, и дополнительно DVU3025 имеет предсказанную sigma54-зависимый промотор. EMSA предоставляет прост...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конфликта интересов раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Эми Чен за помощь в подготовке к съемках клипа и для демонстрации техники. Эта работа проводится ENIGMA: Экосистемы и сети Интегрированный с генами и молекулярных ансамблей (http://enigma.lbl.gov), Программа научно Зона фокусировки на Национальной лаборатории Лоренса Беркли, была поддержана Управлением науки, Управления биологического и экологических исследований, Департамента энергетики США по договору № DE-AC02-05CH11231.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Колонна HisTrapFF (колонна Ni-Sepharose)GE Lfe Sciences, Питтсбург, Пенсильвания, США17-5255-01
Эксплорер Akta (инструмент FPLC)GE Lfe Sciences, Питтсбург, Пенсильвания, США
HiPrep 26/10 Обессоливающая колоннаGE Lfe Sciences, Питтсбург, Пенсильвания, США17-5087-01
Набор для экстракции геля QiaquickQiagen Inc, Валенсия, Калифорния, США28704
Меченые биотином олигонуклеотидыIntegrated DNA TechnologiesN/A
6% полиакриламид-0,5x TBE сборный мини-гель для замедления ДНКLife Technologies, Grand Island, NY, СШАEC63652BOXВ качестве альтернативы вы можете налить свой собственный гель.
Нейлоновая мембранаEMD Millipore, Billerica, MA, США INYC00010
Trans-Blot SD Полусухая электрофоретическая передаточная ячейкаBiorad, Hercules, CA, США170-3940
Сверхплотная бумага-блотка, 8 x 13,5 смBiorad, Hercules, CA, США170-3967
УФ-сшиватель Модель XL-1000Fisher Scientific11-992-89
Набор для обнаружения хемилюминесцентных нуклеиновых кислот (Pierce)Thermo fisher Scientific, Рокфорд, Иллинойс, США89880
Агарозная смола Ni-NTAQiagen Inc, Валенсия, Калифорния, США30210
Набор для амплификации всего генома GenomePlex (буфер для фрагментации, буфер для подготовки библиотеки, раствор для стабилизации библиотеки, фермент для подготовки библиотеки, мастер-смесь 10-кратной амплификации, полимераза WGA)Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАWGA2-50RXN
Nanodrop ND-1000Thermo Scientific, Уилмингтон, Германия, СШАДля количественного определения ДНК
Perfecta Sybr Green SuperMix, с ROXQuanta biosciences95055-500Любая смесь Sybr Green PCR может быть использована
PlateMax Ultra Clear термосваривающая пленка для qPCRAxygen
[header]
96-луночная прозрачная низкопрофильная микропластина для ПЦРLife Technologies, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, СШАPCR-96-LP-AB-C
Applied Biosystems StepOne Plus Система для ПЦР в реальном времениLife Technologies, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США4376600Можно использовать любую систему для ПЦР в реальном времени
QiaquickQiagen Inc, Валенсия, Калифорния, США28104Любой набор для очистки ПЦР может быть использован
Cy3/Cy5-меченые ноннемерыTrilink biotechnologies, Сан-Диего, Калифорния, СШАN46-0001, N46-0002
Кленоу-полимераза 50 000 Ед/мл, 3'-5' экзо<сап>-New England Biolabs, Ипсвич, МассачусетсM0212M
Система гибридизацииRoche-Nimblegen, Мэдисон, Висконсин, СШАН/ДЭта компания больше не производит массивы или связанные с ними элементы, поэтому необходимо использовать альтернативные источники, такие как Agilent или Affymetrix.
Напечатанные на заказ микрочипы и миксерыRoche-Nimblegen, Мэдисон, Висконсин, СШАН/Д
Комплект для гибридизации (2x Буфер для гибридизации, Гибридизационный компонент A, Выравнивание олиго)Roche-Nimblegen, Мэдисон, Висконсин, СШАН/Д
Набор для промывки буфера (10x Wash buffer I, II, III, 1 M DTT)Roche-Nimblegen, Мэдисон, Висконсин, СШАН/Д
Сканер микрочипов GenePix 4200AMolecular Devices, Саннивейл, Калифорния, СШАЭта модель была заменена на более совершенные
Программное обеспечение для микрочипов GenePix Pro MolecularDevices, Саннивейл, Калифорния, США
Nimblescan v.2.4, программное обеспечение для анализа чипов ChIPRoche-Nimblegen, Мэдисон, Висконсин, СШАН/Д

Ссылки

  1. Galperin, M. Y. Diversity of structure and function of response regulator output domains. Curr Opin Microbiol. 13, 150-159 (2010).
  2. Casino, P., Rubio, V., Marina, A. The mechanism of signal transduction by two-component systems. Curr Opin Struct Biol. 20, 763-771 (2010).
  3. Aparicio, O., Geisberg, J. V., Struhl, K. Chromatin immunoprecipitation for determining the association of proteins with specific genomic sequences in vivo. Curr Protoc Cell Biol. 17 (17), (2004).
  4. McCleary, W. R., Stock, J. B. Acetyl phosphate and the activation of two-component response regulators. J Biol Chem. 269, 31567-31572 (1994).
  5. Novichkov, P. S., et al. RegPrecise web services interface: programmatic access to the transcriptional regulatory interactions in bacteria reconstructed by comparative genomics. Nucleic Acids Res. 40, 604-608 (2012).
  6. Studholme, D. J., Buck, M., Nixon, T. Identification of potential sigma(N)-dependent promoters in bacterial genomes. Microbiology. 146 (12), 3021-3023 (2000).
  7. Rajeev, L., et al. Systematic mapping of two component response regulators to gene targets in a model sulfate reducing bacterium. Genome Biol. 12, 99(2011).
  8. Crooks, G. E., Hon, G., Chandonia, J. M., Brenner, S. E. WebLogo: a sequence logo generator. Genome Res. 14, 1188-1190 (2004).
  9. Barbieri, C. M., Mack, T. R., Robinson, V. L., Miller, M. T., Stock, A. M. Regulation of response regulator autophosphorylation through interdomain contacts. J Biol Chem. 285, 32325-32335 (2010).
  10. Bourret, R. B. Receiver domain structure and function in response regulator proteins. Curr Opin Microbiol. 13, 142-149 (2010).
  11. Gao, R., Stock, A. M. Molecular strategies for phosphorylation-mediated regulation of response regulator activity. Curr Opin Microbiol. 13, 160-167 (2010).
  12. Hung, D. C., et al. Oligomerization of the response regulator ComE from Streptococcus mutans is affected by phosphorylation. J Bacteriol. 194, 1127-1135 (2012).
  13. Ladds, J. C., et al. The response regulator Spo0A from Bacillus subtilis is efficiently phosphorylated in Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett. 223, 153-157 (2003).
  14. Wen, Y., Feng, J., Scott, D. R., Marcus, E. A., Sachs, G. Involvement of the HP0165-HP0166 two-component system in expression of some acidic-pH-upregulated genes of Helicobacter pylori. J Bacteriol. 188, 1750-1761 (2006).
  15. Liu, X., Noll, D. M., Lieb, J. D., Clarke, N. D. DIP-chip: rapid and accurate determination of DNA-binding specificity. Genome Res. 15, 421-427 (2005).
  16. Gossett, A. J., Lieb, J. D. DNA Immunoprecipitation (DIP) for the Determination of DNA-Binding Specificity. CSH Protoc. 2008, (2008).
  17. Mascher, T., et al. The Streptococcus pneumoniae cia regulon: CiaR target sites and transcription profile analysis. J Bacteriol. 185, 60-70 (2003).
  18. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).
  19. Lefrancois, P., Zheng, W., Snyder, M. ChIP-Seq using high-throughput DNA sequencing for genome-wide identification of transcription factor binding sites. Methods Enzymol. 470, 77-104 (2010).
  20. Ho, J. W., et al. ChIP-chip versus ChIP-seq: lessons for experimental design and data analysis. BMC Genomics. 12, 134(2011).
  21. Liu, X., Lee, C. K., Granek, J. A., Clarke, N. D., Lieb, J. D. Whole-genome comparison of Leu3 binding in vitro and in vivo reveals the importance of nucleosome occupancy in target site selection. Genome Res. 16, 1517-1528 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Sigma54

Похожие статьи