Простой Поведенческая Анализ для тестирования зрительной функции в Xenopus Laevis

Summary

Xenopus Laevis головастики предпочитают плавание на белом стороне черного / белого танка. Такое поведение руководствуется своим видением. На основе этого поведения, мы представляем простой анализ, чтобы проверить зрительные функции головастиков.

Abstract

Измерение зрительной функции в головастиков лягушки, Xenopus Laevis, позволяет скрининг для слепоты в живых животных. Оптокинетическим ответ видение основе, рефлексивно поведение, которое наблюдается у всех позвоночных протестированных. Головастик глаза маленькие, поэтому реакция хвост флип был использован в качестве альтернативной меры, которая требует квалифицированный специалист для записи тонкий ответ. Мы разработали альтернативный поведение анализа основан на том, что головастиков предпочитают, чтобы плавать на белом стороне бака при помещении в резервуар с обоих черных и белых сторон. Анализ, представленный здесь является недорогим, простым альтернатива, которая создает ответ, который легко измерить. Установка состоит из штатива, веб-камера и вложенных танков тестирования, доступной в большинстве Xenopus лабораторий. Эта статья включает в себя фильм, показывающий поведение головастиков, до и после разрыва зрительный нерв. Для того чтобы проверить функцию одним глазом, мы также включаем предтель результаты головастика, в которой каждый глаз прошли сетчатки аксотомии на последовательных дней. Будущие исследования могут разработать автоматизированную версию этого анализа для тестирования видение многих головастиков сразу.

Introduction

Xenopus Laevis были использованы в качестве модельного организма для изучения формирования глаз. Глаза быстро развиваться, растет до погашения менее чем за неделю тестирования генов или путей, которые оказывают влияние на визуальной разработки и функции. Чтобы проверить зрительные функции, оптокинетическим и оптомоторная ответ был использован у рыбок данио и Xenopus головастиков соответственно ^1,2. Потому что глаза Xenopus головастиков относительно меньше, чем у рыбок данио, этот анализ требует использования специального оборудования и подготовленного персонала для выявления тонкий хвост-флип и глаз-движения поведение в Xenopus. Более надежная поведение в Xenopus является предпочтение для купания в резервуаре с белым фоном, который описан здесь ^3. При размещении головастика в полтора черный / наполовину белый танк, предварительно метаморфических головастик быстро плывет к белой стороне резервуара. Ранее мы использовали эту пробу, чтобы определить, плюрипотентных клеток, полученныхГлаза были функциональны ^4. Здесь мы приводим подробное версию этого анализа, который может быть использован для тестирования зрительной функции premetamorphic головастиков Xenopus.

Этот анализ является более простым, чем анализа отклика оптомоторная, так как он только требует установленный цифровую видеокамеру, цифровой программное обеспечение камеры и стандартного оборудования можно найти в большинстве Xenopus лабораторий. Кроме того, записанный ответ не требует специальной подготовки к результатам учетные. Наши представительства результаты показывают, что та же группа головастиков, претерпев двойной сетчатки аксотомии, плавать случайно вокруг танка. Мы также включили результаты поведение анализа из репрезентативной головастика, показывая, как один глаз может быть проверена для визуального ответ. Лист был включен так, что числа, полученные в ходе анализа могут быть вставлены и проанализированы. Этот лист может быть использован для определения головастиков испытаны, имеют ли визуальный отклик.

Protocol

Уход животных

Xenopus Laevis головастики используемые в этом исследовании были выращены, поднял и лечение в соответствии с процедурами, утвержденными северной части штата медицинского университета IACUC и Руководства по проблемам помощи и использованию лабораторных животных.

. 1 Настройка Предварительно поведение: Головастики

1. Получение оплодотворенные эмбрионы Xenopus из коммерчески доступного источника или в пробирке оплодотворению ооцитов, как описано выше ^6.
2. Наведите бластула в нейронных эмбрионов на стадии пластины на 18 ˚ С в 60 мм чашки Петри, содержащие 0.1x MMR [10 изменения решение (MMR) акции Рингера X Marc автора (10 мМ MgCl _2, 20 мМ KCl, 20 мМ CaCl _2, 50 мМ HEPES; 1 М NaCl; доводят до рН 7,5, в автоклаве и хранили при комнатной температуре)] с 50 мкг / мл гентамицина антибиотика. Изменение 0.1x MMR каждый день, и удалить все мертвые эмбрионы.
3. Как только эмбрионы достигают Nieuwkoop и Faber этап ~ 27 - 30 ^7, переключения тыс.е эмбрионов в 0,1 X MMR без антибиотика, чтобы позволить кишечника бактериального роста.
4. Расти головастиков, пока они не достигнут стадии подачи (этап 45) и переместить их в 100 мм чашки Петри, наполненных 0,1 X MMR. Накормите их крапивы порошок супернатант через день в течение недели, меняя 0.1x MMR на прошедший день.
5. После одной недели в 100 мм чашки Петри, перейти животных половиной галлонов цистерны, заполненные лягушки воды [0,5 г / л мгновенный океан и 2 мМ фосфат натрия двузамещенный (Na ₂ HPO _4: MW 141,96) рН 6,8]. Накормите их как на этапе 2.4, но менять воду всего 2-3 раза в неделю, когда вода мутная. Поддерживать животных в 12-часовом light/12 темно светового цикла с огни включения в 6 утра.
6. Поместите половину-литровый аквариум с испытуемых на белой поверхности, как лаборатории скамейке underpad, по крайней мере, 12 часов O / N, перед тестированием.
7. Тестовые головастики на этапах 45 до 50, как описано в шаге 3 ниже.

. 2 Установка Предварительно поведение: Equipmenт

1. Отложите площадь лаборатории для поведения анализа. Он должен быть в тихом, с низким уровнем трафика области со стандартным люминесцентным освещением.
2. Подготовка к тестированию танки для животных.
   Вложенный, наполовину галлон тестирования танки состоят из двух частей: внутренний бак, который будет содержать воду и головастиков; и внешний бак с визуального стимула.
   1. Для внутреннего резервуара, сделать небольшой след в наружных углах с шулером, 5 см от дна; это линия воды (рис. 1А, зеленая пунктирная линия).
   2. Кроме того, для внутреннего резервуара, заполнить divets в баке (в углах и центре) с инертным соединением, как Sylgard эластомера. Примечание: головастики будут задерживаться в этих областях, если они не заполнены дюйма
   3. Для внешнего резервуара, накрыть ровно половина от внешней одном баке с черной изоленты, а другая половина с белым ткани бумаги рисунке 1b.
3. Поместите танки напрививки проигрыватель.
4. Настройка веб-камеры / штатив так, чтобы она выше тестирования танков. Настройка камеры, чтобы позволить визуализацию области тестирования, как показано на рисунке 1С.
5. Подключите веб-камеру к компьютеру с программным обеспечением Quicktime Player установлен ^5. Включите камеру. В QuickTime Player, в Файл выберите 'нового фильма запись.' Установка анализ поведения будут видны на компьютере сразу.
6. Драпируйте легкий хлопчатобумажную ткань по всей установки, чтобы уменьшить внешние сигналы, которые могут повлиять на поведение головастика, а также, уменьшить отражение света от поверхности воды.
7. Убедитесь, что яркость под ткань мер между 35-50 кд / м ^2.

3. Поведение Анализ

1. Заполните внутреннюю тестирования бак до отметки 5 см воды сделали в шаге 1.2.1 с лягушки воды.
2. С помощью небольшой сети, осторожно двигаться животное во внутренний резервуар тестирования.
3. Открыть QuickTime программное обеспечение на компьютере и, используя внешний резервуар в качестве руководства, чтобы убедиться, что камера находится в состоянии представить себе и записать область тестирования.
4. Напишите имя животного, дату и время на листке бумаги и записи с камеры.
5. Поместите тест-танк во внешний бак с черной стороне бака в правом рисунке 2.
6. Начните немедленно записи фильма устроив бак и установить таймер на 2 мин.
7. Когда таймер подает звуковой сигнал, снимите внутреннюю тест танк, поверните наружный резервуар на 180 ° и установите внутреннюю тест бак внутри внешнего резервуара. Запустите таймер. Примечание: теперь черная сторона должна быть на другой стороне.
8. Повторите шаг 3.7, еще восемь раз в общей сложности десять испытаний. Используйте рисунок 2 в качестве ориентира, помечая каждый суда.
9. Повторите поведения анализа в два отдельных дня.

4. Сетчатки аксотомии

1. Поместите животное в 0,02% Tricaine, пока они не отвечать на запросыв хвостовой крайнем случае с # 3 щипцами.
2. Растопить 1% агарозы в 0,1 X MMR, а затем добавить к 60 мм чашки Петри. После охлаждения сделать небольшое прямоугольное дерн в агарозе и добавить головастика в дерн с небольшим 0,02% Tricaine, так что животное частично погруженным в жидкость.
3. Прокалывают кожу под углом 45 градусов за дорсальную область глаза с иглой 25 г, в то время как крепление животное от щипцов на противоположной стороне.
4. Стараясь не отрезать вену, которая лежит рядом с зрительного нерва, тщательно достичь в отверстие с # 5 щипцами, СНиП зрительный нерв и перевернуть его с пути. Если есть сильное кровотечение из-за случайно отрезая артерию, а затем быстро разместить животное в 2% Tricaine усыпить. ВНИМАНИЕ: 2% раствор Tricaine может вызвать онемение в организме человека. Это решение должно быть в перчатках.
5. Для восстановления животного после операции, поместить животное в 100 мм чашки Петри с 0.7x MMR и 50 мкг / мл гентамицина в течение 20 мин. Небраскахи, передача головастик, чтобы бака утилизации лягушки воды. Пусть животное сидение O / N.
6. На следующее утро, проверить зрительные функции, как описано выше (шаги 3,1-3,9).

5. Анализ результатов

1. После испытания окончании измерения количества времени головастика остается на черной стороне бака.
   1. Вручную просмотра видео с помощью программного обеспечения, который отображает время и позволяет частое приостановку. Посмотрите на время отображения видео. Записывают начало двух проб мин, что, когда внутренний бак успешно гнезда внутри внешнего резервуара и в квадрат в поле зрения камеры.
   2. Используйте позицию глазах головастик, чтобы определить, с какой стороны бака животные плавают на. Определить пересекая с одной стороны резервуара в другой, только когда оба глаза пересекли черный / белый линию.
2. Запишите начало и конец каждого интервала (в секундах), что животное тратит на черной стороне. Пауза и повторноветер видео для обеспечения точности. Всего в сек в каждом испытании.
3. Входной эти цифры в прилагаемом поведения листе. Лист будет вычислять соотношение количества времени, что животное, потраченные на белой стороне путем вычитания времени, затрачиваемого на черной стороне резервуара от общего 120 сек проб и разделите на общее время в сек [(120 - всего секунд тратится на черная сторона) / 120 сек]. Средние листа это соотношение по всем 10 испытаний.
4. Используйте Т-тест студента, в паре, двустороннее распределение, чтобы определить, испытания между дней значимы (р ≤ 0,05).

Results

Предыдущие доклады показали, что premetamorphic головастики Xenopus предпочитают плавать на белом стороне черного / белого танка и называется этот анализ, цвет фона Preference Пробирной ³ мы изменили этот анализ для того, чтобы проверить зрительные функции либо глаза головастиков в менее чем за неделю. Таким образом, их глаза могут быть собраны для гистологического исследования.

Здесь мы показываем, как реакция обусловлена ​​визуальные подсказки. В Movie 1,

Discussion

Мы сообщаем здесь простой видение наведением поведенческий анализ, который может быть легко выполнена в рамках недели по минимально подготовленных персонала лаборатории. В то время как другие анализы требуют специального оборудования и опыта в поведении животных, этот анализ позволяет быстрый тест для определения зрительной функции. Другой поведенческая анализ, Визуальный Избежание анализа, был разработан, чтобы определить, каким образом Tectum способствует зрительного восприятия в Xenopus ^10. Это ан...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/2 галлона Flex-Tank с крышкой	eNasco	SB19271M	Размер: 5-3/8" x 7" x 3-3/4"
Черная изолента
Белая папиросная бумага
Большой инокуляционный проигрыватель	VWR	50809-022	Размер: Диаметр 114,3 x  В 76,2 мм (4 1/2  x  3")
Подкладка Durasorb	VWR	82004-836	Размер: 43,2 x 60,1 см (17 x 24")
Kimwipe	Krackeler Scientific, Inc.	1945-34155-CS
Стандартный штатив		Различные
камеры или веб-камеры iSight	Apple	M8817LL/A	Хорошо подходит для больших головастиков, но маленькие плохо видны
Портативный компьютер	Apple/PC	Разное	Мы использовали 13-дюймовый MacBook, 2 ГГц Intel Core 2 Duo под управлением MacOSX Lion 10.7.5
MiniDV ручная камкордер	SONY	DCR-HC42	Подключается с помощью firewire к компьютеру с помощью 6-жильного и 4-жильного альфа-канала FireWire 400
Станция Handycam	SONY	DCRA-C121	Это можно использовать для подключения пожарного провода к камере
Программное обеспечение QuickTime Player	Версия	10.1
26 G Игла (длина 5/8 дюйма)	VWR	BD305115
Dumont #5 Щипцы	Fine Science Tools	11295-10
Одноразовые материалы
Гентамицина сульфат [50 мг/мл]	Fisher Scientific	17-528Z	Хранится в RT
Sylgard 184 силиконовый эластомер	Fisher Scientific	NC9644388
Instant ocean	Doctors Foster and Smith	CD-116528	Стоковый раствор = 100 г/л хранится в RT
Двухосновной фосфат	натрия Sigma Aldrich	S0876	Стоковый раствор = 0,4 M хранится в RT
in vitro оплодотворенных эмбрионов	eNasco	LM00490MX	100 эмбрионов/единицу