Поверхности клеток Маркер опосредованной Очистка плюрипотентных клеточных промежуточных от модели Перепрограммируемая Mouse

Краткое содержание

Эмбриональный фибробласт мыши может быть перепрограммирован в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки с низкой эффективностью путем принудительной экспрессии транскрипционных факторов Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. Редкими промежуточными продуктами реакции перепрограммирования являются FACS, выделенные путем мечения антителами против производителей клеточной поверхности Thy-1.2, Ssea-1 и Epcam.

Аннотация

Зрелые клетки могут быть перепрограммированы в плюрипотентное состояние. Эти так называемые индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS) способны давать начало всем типам клеток организма и, следовательно, имеют огромный потенциал для применения в регенеративной медицине. Традиционно iPS-клетки образуются путем вирусного введения транскрипционных факторов Oct-4, Klf-4, Sox-2 и c-Myc (OKSM) в фибробласты. Тем не менее, перепрограммирование является неэффективным процессом, когда только 0,1-1% клеток возвращаются к плюрипотентному состоянию, что затрудняет изучение механизма перепрограммирования. Проверенная методология, позволившая изучить процесс перепрограммирования, заключается в выделении редких промежуточных продуктов реакции из тугоплавкой объемной популяции. В случае эмбриональных фибробластов мышей (МЭФ) мы и другие ранее показали, что перепрограммирование клеток претерпевает определенный ряд изменений в профиле экспрессии маркеров клеточной поверхности, которые могут быть использованы для разделения этих клеток. На ранних стадиях экспрессии OKSM клетки успешно перепрограммируют, теряют маркер идентичности фибробластов Thy-1.2 и повышают регуляцию ассоциированного с плюрипотентностью маркера Ssea-1. Окончательный переход подмножества Ssea-1-положительных клеток в плюрипотентное состояние отмечен экспрессией Epcam на поздних стадиях перепрограммирования. Здесь мы приводим подробное описание методологии, используемой для выделения промежуточных продуктов перепрограммирования из культур перепрограммирования MEF. Для повышения экспериментальной воспроизводимости мы используем перепрограммируемую линию мыши, которая была сконструирована для экспрессии транскрипционного трансактиватора (m2rtTA) под контролем локуса Rosa26 и OKSM под контролем промотора, реагирующего на доксициклин. Клетки, выделенные у этих мышей, являются изогенными и гомогенно экспрессируют OKSM при добавлении доксициклина. Мы подробно описываем создание перепрограммируемых мышей, получение MEF и последующее выделение промежуточных продуктов во время перепрограммирования в iPS-клетки с помощью сортировки флуоресцентных активированных клеток (FACS).

Введение

Эмбриональных стволовых (ЭС) клетки получают из внутренней клеточной массы эмбриона на стадии бластоцисты ^1. При соответствующих условиях культивирования они самообновлению и остаются плюрипотентные. В 2006 году Яманака и его коллеги показали, что зрелые клетки могут быть перепрограммированы в так называемый индуцированных плюрипотентных стволовых (плюрипотентных) клеток путем принудительного выражения факторов транскрипции Oct-4, Klf-4, Сокс-2, С-Мус (OKSM) ^2. плюрипотентных клеток, как ЭС клеток, может привести к всех типов клеток организма, тем не менее, они свободны от этических ограничений, окружающих поколение ЭС клеток ^3. Кроме того, IPS клетки несут обещание персонализированной регенеративной медицины и несет в себе огромный потенциал для таких приложений, как моделирования заболевания и в пробирке наркотиков скрининга ^4,5. Для того, чтобы перепрограммировать технику для выполнения этого потенциала, основной механизм ядерного перепрограммирования необходимо в полной мере понимать. Тем не менее, усилия препарировать перепрограммирования погладитьhway были затруднены тем, что только очень небольшое число клеток перепрограммировать (0,1-1%). Успешно перепрограммирования фибробластов были зарегистрированы для прохождения различных серии событий, включая мезенхимальных к эпителиальной перехода ^6-10 и, в завершающей стадии перепрограммирования, активации эндогенного основной плюрипотентности сети ^11-14. Мы и другие ^12,13,15-17 недавно идентифицирован набор маркеров клеточной поверхности, который позволяет для разделения редких промежуточных от огнеупорной объемной населения. Перепрограммирование мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs) претерпевают изменения в экспрессии Thy-1.2, Ssea1 и EpCAM (среди прочих) во время 2-недельного процесса перепрограммирования ^15. На ранних этапах перепрограммирования подмножество MEFs вниз-регулируют экспрессию фибробластов идентичности маркера (Твое-1.2), а затем начать выражая плюрипотентности связанных маркер SSEA-1 ^12. Во время заключительных этапах перепрограммирования Ssea1-позитивных клеток Reactivели эндогенные гены плюрипотентности такие как Oct-4 ^10-13,15. Этот последний переход отмечен на поверхности клетки экспрессии этого из EpCAM (рисунок 1) или в более поздней стадии PECAM ^15. В последнее время О'Мэлли и др. Сообщили об использовании CD44 и ICAM1 в качестве альтернативы или дополняют Твоему-1.2 и SSEA-1 для идентификации перепрограммирования промежуточных. Ранее мы уже FACS извлечены перепрограммирования промежуточных со дня 0, 3-й день, 6-й день, День 9 и 12 день перепрограммирования культур, а также от установленных клеточных линий плюрипотентных основе этих маркеров клеточной поверхности ^15,18. Для ниже описанной системы и условий перепрограммирования мы показали на одном уровне клетки, что, хотя население тихие однородная, есть определенная степень неоднородности в определенных промежуточных популяций. Следует отметить, что только подмножество клеток в этих популяциях могут прогрессировать к соответствующему следующему STAGE процесса перепрограммирования и порождают колоний плюрипотентных клеток в различной эффективностью, которые широко характеризуются ранее ^15,19. Кроме того, эффективность перепрограммирования этих популяций будет зависеть также и от повторных гальванических и культуры условиях. Для увеличения экспериментальную воспроизводимость мы используем перепрограммируемой штамм мыши, которая была разработана специально, чтобы выразить транскрипции трансактиватор (m2rtTA) под контролем локуса Rosa26 и полицистронной OKSM кассеты под контролем доксициклина реагировать промоутер ^20,21. Используя эту модель мыши обходит нежелательные побочные эффекты традиционных вирусных методов генерации клеток IPS, т.е., неоднородной отправной населения с клетки к изменчивости клеток в количестве и расположении интеграции сайтов вирусных вставок. Два трансгенные линии мышей (OKSM, m2rtTA), доступные как гомозиготных учредителей животных в лаборатории Джексона, должны быть скрещены в целях установления reprogrammable модель мыши (рисунок 2). В этой рукописи мы подробно описывают, как получить MEFs, генерировать плюрипотентных клеток, и изолировать перепрограммирования промежуточные на различных этапах процесса преобразования по FACS.

Протокол

1 Параметры прибора / Подготовка реагентов / генотипирования

1. Подготовка клеток IPS среды: Дополнение 500 мл DMEM Нокаут носитель с 75 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), 5 мл L-глутамина, 5 мл Номера незаменимые аминокислоты, 500 мкл β-меркаптоэтанола, 5 × 10 ⁵ шт лейкоз ингибирующего фактора ( LIF). Пожалуйста, обратитесь к Список материалов для информации покупательной продукта и для реагентов, используемых в контексте этой рукописи.
2. Подготовка MEF среды: Дополнение 500 мл DMEM среды с 50 мл FBS, 5 мл L-глутамина, 5 мл несущественных аминокислот, 5 мл пирувата натрия, 500 мкл β-меркаптоэтанола.
3. Подготовьте замораживания среды: по 10 мл, объединить 9 мл FBS с 1 мл ДМСО.
4. Подготовьте желатин покрытием блюда добавить 3-5 мл 0,1% раствора свиной желатин в колбе Т75, инкубируют при комнатной температуре в течение по крайней мере 10 мин и аспирации непосредственно перед использованием.
5. Подготовка FACS маркировки среды: по 10 мл, сочетают 9,9 мл PBS с 0,1 мл ФБС.
6. Выполнитегенотипирование ПЦР для локуса Rosa26 m2rtTA: Выполнение реакции полимеразы Taq ДНК в соответствии с инструкциями изготовителя. Используйте изменение MgCl ₂ -концентрация 3,5 мм и следующие 3 праймеров: oIMR8052: 5 'GCG AAG AGT ТТГ TCC TCA ACC 3', oIMR8545: 5'AAA GTC GCT CTG AGT TGT ТАТ 3 ', oIMR8546: 5' GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG 3 '. Велоспорт условия: 94 ° C в течение 3 мин; 35 циклов (94 ° С в течение 30 сек, 65 ° С в течение 1 мин, 72 ° С в течение 1 мин); 72 ° С в течение 2 мин; выдержка при 12 ° С. Ожидаемый размер продукта: 650 б.п. для аллеля дикого типа и 340 б.п. для мутантного аллеля.
7. Выполните генотипирования ПЦР для локуса Коллаген-StemCa / OKSM: Выполнение реакции с полимеразы Taq ДНК в соответствии с указаниями. Используйте изменение MgCl ₂ -концентрация 2,5 мм, а следующие 3 праймеров: цв / FRT-B: 5 'CCCTCCATGTGTGACCAAGG 3', цв / frtA1: 5 'GCACAGCATTGCGGACATGC 3', цв / frtC1: 5 'GCAGAAGCGCGGCCGTCTGG 3 '. Велоспорт условия: 95 ° C в течение 1 мин: 2 циклов (94 ° С в течение 30 с, 70 ° C в течение 45 сек), 6 циклов (94 ° С в течение 30 с, 68 ° C в течение 45 сек) и 30 циклов из (94 ° С в течение 20 сек, 60 ° С в течение 1 мин); 72 ° С в течение 5 мин; выдержка при 12 ° С. Ожидаемый размер продукта: 331 б.п. для аллеля дикого типа и 551 б.п. для мутантного аллеля.
8. Выполнить все операции центрифугирования при 400 мкг в течение 3 мин при 4 ° С.

2 Генерация эмбриональных фибробластов мыши

1. Выполните приуроченный спаривания между животным штамма OKSM с членом противоположного пола штамма m2rtTA. Урожай эмбрионов на день эмбрионального 13,5 по выбраковки мать и удаления рог матки. Перед удалением рога матки, спрей брюшной области с 80% раствором этанола, чтобы избежать микробного загрязнения.
2. Передача рог матки в 10 см тканевой культуральной чашке, содержащей 10 мл стерильного фосфатно-солевом буфере (PBS). Используйте стерилизованные ножницы хирургические класса сократить рог матки на куски, содержащих один эмбрион (рисунок 3а, б).
3. Используйте рассечение микроскоп (идеально расположен в ткани капот культуры) и стерилизованные щипцы осторожно удалите матки конверт и внеэмбриональной мембраны, окружающие каждый эмбрион. Передача каждого эмбриона в отдельном 10-см чашку с 10 мл PBS.
4. Продолжать, удалив голову эмбриона, конечности, хвост и внутренние органы (сердце, печень, кишечник и т.д.) с помощью пинцета (рисунок 3C). Передача голову эмбриона в 1,5 мл пробирку и замораживают вниз таким образом, он может быть использован для генотипирования, если это необходимо.
5. Трансфер туловище эмбриона в пустую 10см пластины и использовать два хирургических лезвия рубить эмбрион в течение 2 мин. Добавить 200 мкл трипсина / EDTA раствора в верхней части фарша эмбриона и инкубировать в течение 3-5 мин при комнатной температуре. Продолжить мясорубки в течение еще 2 мин, добавить 2 мл MEF СМИ в активировать трипсин, а затем передать в 15 мл трубки.
6. Используйте 1000 мкл пипетки для дальнейшего механически отделить ткань, осторожно пипеткой. Трансфер в желатиновую покрытием 10 см блюдо и добавить дополнительный 10 мл MEF СМИ. Примечание: Оба гипоксическим и гипоксические инкубаторы могут быть использованы для культуры, относятся к дискуссии для получения дополнительной информации.
7. После 24-48 часов пластина должна быть густо покрыты MEFs.
8. С другой стороны, клетки могут быть затем дополнительно размножают или замораживают. Для замораживания клеток, удалить питательных сред, промыть блюдо с 10 мл PBS для удаления следов массовой информации и наложения с 3 мл трипсина / ЭДТА. Инкубировать в течение 3-5 мин при температуре 37 ° С, инактивируют трипсин-переваривание путем добавления 5 мл MEF информации и передачи в 15 мл центрифужную пробирку. Спин вниз и ресуспендируют осадок в 3 мл замораживания средств массовой информации. Переезд в 3 криопробирки и заморозить вниз в морозильной контейнера клеток.

3 Перепрограммирование MEFs

ove_content "> Примечание: Гранул клетки центрифугированием при 200 мкг в течение 5 мин при 4 ° С и использовать нормоксических культуры ткани инкубаторы для перепрограммирования Это может быть полезно для получения и расширения MEFs в условиях гипоксии (5% кислорода, см обсуждение для получения дополнительной информации. ).

1. Быстро разморозить низкий проход криопробирку (P0-P1, 2-3 Mio клетки) на водяной бане (37 ° C) и переместите содержимое в трубку 10 мл подогретого MEF СМИ. Пелле клетки, ресуспендируют в 12 мл свежих MEF СМИ, передать в желатиновую покрытием T75 сосуда для культивирования, и позволяют клеткам восстанавливаться в течение 24-48 часов, прежде чем продолжить. Примечание: MEFs также может быть использован непосредственно после вывода.
2. После удаления культуральной среды, промыть MEFs с PBS и cellularize путем наложения раствором трипсин / ЭДТА (3 мл в течение 3-5 мин при температуре 37 ° С). Гасят трипсин путем добавления 5 мл MEF сред и далее диссоциации клеток при осторожном перемешивании с 10 мл пипетки. Определить число клеток с использованием гемоцитометра.
3. Для reprogramming эксперименты, семян MEFs Онто покрытые желатином Т75 колбы в плотностях 6,7 х 10 ³ клеток / см ² (~ 0,5 Mio клеток на колбу) в ИПСК средах, содержащих 2 мкг / мл доксициклина. Обратитесь к Таблице 1, касающиеся рекомендации посева получить около 2 Mio перепрограммирования промежуточные продукты для каждого момента времени. Примечание: Перепрограммирование начинается с того доксициклина (2 мкг / мл) с добавлением средств массовой информации
4. За первые 6 дней заменить СМИ каждый день со свежими доксициклин дополнен IPSC СМИ (12 мл средствах массовой информации в T75 колбу). За этой точкой продлить носитель на ежедневной основе, если есть большое число клеток. Удвоить объем культуры, если изменения медиа может быть выполнена только через день.
5. Урожай перепрограммирования промежуточные в требуемых временных точках (предложение: Дни 3, 6, 9, 12), удалив СМИ, промывки соответствующим объемом PBS (10 мл для T75 колбу) и наложения раствором трипсина-ЭДТА (3 мл для T75 колбу). Выдержитев течение 3-5 мин при температуре 37 ° C и гасят путем добавления 5 мл Ipsc средах с последующим осторожным пипетированием.
6. Количество суспензии клеток с помощью гемоцитометра (смотри выше), осадок центрифугированием, аспирации супернатант и ресуспендируют клеток в 10 мл PBS, чтобы удалить все следы трипсина. Гранул клетки вновь, аспирата супернатант и перейдите к шагу 4.1 изолировать перепрограммирования промежуточные. Примечание: Клетки, проходящие перепрограммирование может быть криоконсервированных и оттаивали для изоляции FACS на более позднем этапе.
7. Чтобы установить полностью перепрограммировать плюрипотентных культур, роста клеток в DOX-бесплатно IPSC СМИ еще в течение 4-7 дней. Примечание: Успешно перепрограммирования культуры будет содержать большое количество колоний на 12 день (рисунок 4). В течение этого времени, аномальным плюрипотентных клеток, которые еще требуют OKSM выражение исчезнет.
8. Кроме того, для распространения оставшиеся полностью перепрограммировать плюрипотентных культур: первоначально, семян облученных MEFs при плотности 15 х 10 ³ клеток / см ² в 12 мл IPSC СМИ на желатин покрытием T75 колбу один день или 6 ч перед экспериментов.
9. Далее, cellularize плюрипотентных клеточных культур путем удаления носителя промывки T75 колбу с 10 мл PBS, наложением с 3 мл раствора трипсина-ЭДТА и инкубировали в течение 3-5 мин при температуре 37 ° С. Quench трипсин, добавив 5 мл ИПСК СМИ с последующим осторожным перемешиванием, трансфер в 15 мл коническую трубку, спин вниз и затем ресуспендировали в 10 мл плюрипотентных СМИ.
10. Передача 500 мкл этой клеточной суспензии на облученных MEFs (Т75 колбы) и позволяют культуры расти в течение 4-5 дней. Примечание: Установленные плюрипотентных культуры могут подвергнуть криоконсервации или использовать для экспериментов. Клональные клеточные линии могут быть получены путем выбора каждой колонии IPSC под микроскопом рассекает ^22.
11. Крио сохранить конфлюэнтных культур IPSC, как описано в 2.8 для MEFs.

4 Антитела Маркировка

1. Ресуспендируйте клеточные гранулы перепрограммирования культур, подготовленные в разделе 3, вFACS-маркировки, дополненной антител (анти-Thy-1.2 Pacific Blue 1: 400, анти-SSEA-1 биотин 1: 400 и анти-EpCAM Fitc 1: 400). Используйте 200 мкл дополненной маркировки смеси на 5 млн клеток и инкубировать на льду.
2. Через 10 мин осторожно нажать на трубу, чтобы ресуспендирования клеток и инкубируют в течение дополнительных 10 мин на льду. Добавьте 10 мл холодной PBS на пробирку и спином вниз.
3. Для каждой трубки, чтобы быть окрашены подготовки 200 мкл маркировки средах с добавлением 1 мкл стрептавидин-PeCy7 (1: 200) за 5000000 клеток. Когда клетки осаждали, тщательно аспирата супернатант и ресуспендируют в соответствующем объеме маркировки среде с Streptavidin-PeCy7.
4. Хранить клеток на льду в течение 10 мин, нажмите для ресуспендирования, инкубируют в течение еще 10 мин на льду, добавляют 10 мл холодного PBS на пробирку, спин вниз и аспирации супернатант.
5. Ресуспендируют осадок клеток в маркировке средах с добавлением иодида пропидия (PI) (2 мкг / мл) примерно в 1 х 10 ⁷ клеток / мл. Удалить скопления клеток пропусканием суспензии через сито 70 мкм. Передача клеток к соответствующему FACS трубы и держать их на льду.
6. Подготовьте отдельные образцы с отдельных антител (анти-Thy-1.2, анти-SSEA-1 и анти-EpCAM). ПРИМЕЧАНИЕ: Они необходимы для выполнения цветовой компенсацию в трех каналов, используемых в анализе. Кроме того, немаркированные клетки необходимы для установки напряжения и ворота для сортировки. В идеале плюрипотентных клеток используются для компенсации: запасы 0,5-1 × 10 ⁶ плюрипотентных клеток, поддерживаемых в облученных MEFs хранятся в криопробирки в жидком азоте. Наличие MEFs важно, чтобы получить сигнал в Thy-1.2 канал.
7. Оттепель криопробирку из плюрипотентных клеток, как описано для MEFs (раздел 3). После центрифугирования ресуспендирования клеток в 800 мкл маркировки буфера и 200 мкл этого образца, выделено в качестве намеченного контроля.
8. Используйте оставшиеся клетки в качестве контроля компенсации. Разделите клетки между тремя 15 мл пробирки и добавить антителследующим образом: Pacific Blue контроль компенсации: добавить 0,5 мкл анти-Thy-1.2 Pacific Blue антитела. Fitc компенсации трубки: добавить 0,5 мкл антитела анти-EpCAM-FITC. Пе-Cy7 контроль компенсации: 0,5 мкл анти SSEA-1-биотин антитела.
9. Держите образцы клетки-антитела на льду в течение 10 мин, тщательно смешать и инкубировать в течение 10 мин на льду.
10. Образцы Промыть 10 мл холодной PBS для удаления несвязанных антител, спина клетки вниз и аспирата супернатант. Ресуспендируйте клеточные осадки в 200 мкл FACS маркировки СМИ.
11. Для анти-SSEA-1-биотин меченых образцов, добавить сопряженное Стрептавидин-PeCy7 (1 мкл на 200 мкл клеток). Этикетка клетки, как описано для первичного антитела (SSEA-1-биотин).
12. Пройти все образцы, включая немеченым контроля через 70 мкм сито и добавить PI (2 мкг / мл). Трансфер клетки FACS труб и держать на льду пока не требуется.

5 FACS Выделение промежуточных

ПРИМЕЧАНИЕ:Клетки сортируются с использованием клеток с возбуждением флуоресценции сортировщик с 405 нм, 488 нм и 560 лазеров возбуждения нм и сопла 100 мкм.

1. Настройка напряжения для переднего и бокового разброса, так что популяция клеток правильно визуализированы. Нарисуйте ворота вокруг клеток, как указано на рисунке 5А исключить мусор. Примечание: Правильный набор из напряжений на мобильный сортировщик может быть сложным и требует опытного оператора FACS.
2. Использование Вперед разброс (FSC) высота по сравнению с FSC области, чтобы исключить агрегатов (Рисунок 5б).
3. Визуализируйте PI канал против ФСБ к воротам в на PI негативных живых клеток (Рисунок 5С).
4. Используйте немеченые клетки для регулировки напряжения для люминесцентных каналов PB, FITC / GFP, Пе-Cy7. В идеальном случае позиционировать клеточной популяции на нижнем конце соответствующего канала.
5. Установите ворота с немеченых контрольных клеток, как показано на рисунке 6A, B, чтобы югу фракции перепрограммирование культовогоОЭС в День 3, 6 и 9 группы населения: SSEA-1 / Thy-1.2 + клеток; SSEA-1 / Thy-1.2- клетки; и перепрограммирование промежуточные SSEA-1 + / Thy-1.2- клетки.
6. Далее разделить День 9 SSEA-1 + / Thy-1.2- фракция помощью Пе-Cy7 против FITC блоте; привлечь ворота вокруг Sse-А1 + / EpCAM + клеток и SSEA-1 + / Epcam- клеток. Установите ворота с немеченых контрольных клеток, как показано на рисунке 6С, D.
7. Prefill соответствующие трубки сбора с плюрипотентных клеток СМИ (1-2 мл) до сортировки желаемых субпопуляции (рисунок 7 для представительных FACS профилей для MEFs, день 3 / День 6 / День 9 / День 12 культур и плюрипотентных клеток).
8. Выполните FACS сортировки по производит протокол.
9. После выделения FACS представить клетки молекулярного профилирования (РНК / извлечения белка, иммунопреципитации хроматина, ДНК methylome анализ и т.д.). Кроме того, различные клеточные фракции можно культивировать.

Результаты

После вскрытия, разукрупнения и обшивки эмбриона E13.5 мыши, 10 см блюдо как ожидается, достигнет слияния в приблизительно от 1 до 2 дней. На данном этапе, это нормально для культуры, чтобы содержать некоторые прилипшие кусочки ткани, которые не были cellularized правильно. Они исчезнут после пассирования.

По индукции доксициклина, перепрограммирования MEFs пройти различные морфологические изменения. Вокруг 6 день, ранние колонии-как патчи должны начать появляться (рисунок 4C). Они будут продолжать расти в размерах при дальнейшем культуры (рис 4D, E). Хороший эксперимент перепрограммирование должны привести в> 500 колоний на T75, который был первоначально засеянного 5 х 10 ⁵ клеток (рис 4д). Штатные культуры плюрипотентных обладают характерными купольного типа колоний и должны в основном быть лишен дифференцированных клеток (Рисунок 4F). Иногда дополнительные пассажи IPS Cultuразрешение может потребоваться удалить недифференцированные / частично перепрограммировать клетки; сливной колбу клеток могут быть разделены в соотношении 1:10 на фидерного слоя облученных MEFs.

Как упоминалось выше, морфологические и молекулярные изменения во время перепрограммирования отражаются от изменений в FACS профилей для Thy-1.2, SSEA-1 и в конечном итоге EpCAM (рисунок 7A-F). Как сообщалось ранее ^12,15, в то время как MEFs преимущественно позитивным для Твоей-1.2 и отрицательным для других маркеров, день 3 культур уже выглядят заметно отличается. Большая часть клеток начали вниз-регулируют экспрессию Thy-1.2 и очень небольшое подмножество этих Thy-1.2 негативных клетках стать положительным для SSEA-1, фактическое перепрограммирования промежуточного для этого момент времени. Число промежуточных перепрограммирования, которые могут быть извлечены из 3-й день культуры очень непредсказуемы как процент SSEA-1 + / Thy-1.2-, как правило, лежит в диапазоне между 1-10% viablе клетки. На 6 и 9 Увеличение доли клеток SSEA-1 +, как правило, значительно выше 10%, могут быть обнаружены. Вокруг 12-й день подмножество SSEA-1 позитивных клеток могут быть обнаружены, что также маркировать положительным для EpCAM. День 12 культур, как 3-й день культуры, представляет собой узкое место в очистке промежуточных продуктов, как процент SSEA-1,2 + / + клеток EpCAM является переменной и, как правило, лежит в диапазоне от всего 2-4% всех живых клеток. Ожидаемое количество перепрограммирования промежуточных, представленных в таблице 1 служит лишь в грубом приближении. Штатные добросовестные клеточные культуры плюрипотентных будет сильно положительным для SSEA-1 и EpCAM.

Рис.1 Поверхностные изменения габаритных течение перепрограммирования пути: вниз-регулирование фибробластов идентичности маркера Твоего-1.2 следует регуляциюSSEA-1. Переход из подмножества SSEA-1 позитивных клеток к плюрипотентное состояние обозначается приобретение EpCAM вокруг 12-й день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2 Схематическое представление перепрограммируемой модели мыши:. Выражение m2rtTA находится под контролем повсеместно активного Rosa26 локуса В присутствии доксициклина (DOX) белок m2rtTA связывается с тетрациклиновой зависимого промотора (tetOP) в коллагена 1A1 (COL1A1) локус в результате экспрессии четыре фактора кассеты. Два бицистронной кассеты соединены посредством сайта входа рибосомы (IRES). Открытые рамки считывания для Окт-4 / KLF-4 и Sox-2 / C-Myc являются фу SED по саморасщепляющиеся F2A и E2A последовательностей, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3 эмбрионов рассечение: (А) Передача рог матки в 10 см чашку, наполненную 10 мл PBS и (В) разрезают на куски, содержащие один эмбрион. (C), используя щипцы освободить эмбрионы из дополнительной эмбриональной ткани и удалить голову, конечности, хвост и внутренние органы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

ле / ftp_upload / 51728 / 51728fig4highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 4 Морфологические изменения при перепрограммировании. Колоний, как патчи становятся очевидными в культурах из 6-й день года. Добросовестный иПСК характеризуются куполообразной профилированного морфологии. (А) День 0 / MEFs, (B) День 3, (С) День 6, (D) День 9, (Е) День 12, (F), IPS клеточной культуре. Шкала бар:. 200 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5 Настройка Основные FACS. () Исключить мусора с боковым Scatter против Forward Scatter Площадь пятно. (В)Исключить агрегаты из не-мусора на гейт на одной клеточной популяции с Forward Scatter Площадь против Forward Scatter Верховного пятно. (C) Исключить мертвые клетки с одной популяции клеток путем стробирования с ИП низких событий с П. И. канала против Forward Scatter Площадь блот. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6 Память. (A, B) Используя немеченые контрольные клетки, установленные ворота для Твоей-1.2 + / SSEA-1- клеток, Твоих-1.2- / SSEA-1 клеток и Thy-1.2- / SSEA-1 + клетки. (C) Используйте немеченые контрольные клетки, чтобы установить ворота для EpCAM положительных и отрицательных EpCAM клеток. (D), SSEA-1 + / Thy-1.2- клетки могут быть отделеныв EpCAM положительной и в отрицательной населения EpCAM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7 Thy-1.2 по сравнению с SSEA-1 FACS-блоттинга на различных этапах процесса перепрограммирования. (А) День 0 / MEFs, (B) День 3, (С) День 6, (D) День 9, (Е) День 12, культура клеток (F) IPS.

Таблица 1 Предлагаемые посева плотность, число колбу и ожидаемые результаты для P1 MEFs эмбриона гетерозиготных для OKSM и m2rtTA. Пожалуйста, нажмите часпрежде чем, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

День	Количество Т75 колбы засевали в день 0	Общее количество Ssea1 + клеток после FACS	Общее количество Ssea1 + / EpCAM + клеток после FACS
3	8	2000000
6	4	2000000
9	4	2000000
12	10	10000000	2000000

Обсуждение

Для того, чтобы успешно перепрограммировать MEFs в плюрипотентных клеток и очистить перепрограммирования промежуточные на высоком количестве важно быть в курсе факторов, которые оказывают влияние на общую эффективность. В частности партия FBS используется в дополнение к плюрипотентных СМИ может иметь отрицательное влияние. В общих положительных впечатлений были сделаны с эмбриональными стволовыми квалифицированных FBS (ES) клеток, но пакетном тестирования сывороток от различных поставщиков может определить более дешевую альтернативу.

Другим фактором, который влияет на эффективность перепрограммирования является генотип MEFs ^15,20. Хотя MEFs, полученных от мышей, гетерозиготных (HET) как для OKSM и локуса m2rtTA ли перепрограммировать, homozygousity на одном или обоих локусов приводит к более высокой эффективности перепрограммирования. Действительно, MEFs, полученные из потомства OKSM и m2rtTA крестов показывают увеличение эффективности перепрограммирования в следующем порядке (OKSM / m2rtTA): гет / гет <гомо / гет <гет / гомо <гомо /гомо (обратите внимание, что цифры, приведенные в таблице 1, для гет / гет животных). В тех редких случаях мужчины гомо / гомо животное идентифицировано, гарем спаривания с несколькими самками m2rtTA можно настроить. Все потомство от этих крестов будет Het / гомо для OKSM / m2rtTA локусов, соответственно. Кроме того, быстрое генотипирование пометов рекомендуется как крупные пометы получаются при использовании более молодых мышей для разведения (6-15 недельного возраста).

Кроме того, использование низких MEFs прохода для перепрограммирования подчеркивается ^23. Если MEFs были получены и разложить в нормоксических культуры ткани инкубаторе мы настоятельно рекомендуем использовать только эти клетки до прохождения 2. Однако, если экспериментатор имеет доступ к инкубатора низкий кислорода (5% кислорода) для вывода и расширения MEFs, цифры выше, чем 3-прежнему будет приносить хорошие результаты ²³ прохождение.

В случае экспериментатор сталкивается с проблемами, связанные с перепрограммированием, как указано, наиболее вероятные объяснения высокие цифры прохождение в момент DOX того, неправильное генотипа мышей или использования FBS, которая не способствует генерации IPS клеток. Тем не менее, в редких случаях мы наблюдали, что MEFs не смогли перепрограммировать даже при идеальных условиях. В этих случаях спонтанное заново удаление в открытой рамки считывания в m2rtTA был идентифицирован как основной причине.

Эта методика была успешно адаптирована для извлечения SSEA-1 + промежуточные через изоляции магнитного клеток (MACS). Существует явное преимущество времени при помощи MACS, однако, чистота SSEA-1 + клеточных популяций 'уменьшается до 80-90%, а не больше, чем 95%, что в зависимости от типа эксперимента клетки, предназначенные для может представлять проблемой. Таким образом, вариант заключается в использовании MACS для обогащения SSEA-1 + клеток с последующим FACS увеличить чистоту и / или доли их в SSEA-1 + / EpCAM + и SSEA-1 + / Epcam- клеток.

"> В то время как клетки плюрипотентных произведенные описанным протоколом и мышиной модели было показано, что плюрипотентные и эффективно содействовать всех тканях химерных животных ^15,20, снижается способность производить эмбрионы полностью состоит из этих плюрипотентных клеток с помощью дополнения тетраплоидной был показали ^24. Аберрантные метилирования на кластере генов Dlk-DIO3 были определены в качестве основной причины ^24. Тем не менее, добавление аскорбиновой кислоты в концентрации 50 мкг / мл в СМИ во время перепрограммирования будет производить тетраплоид комплементации компетентные плюрипотентных клеток ^24. Доводим до вашего сведения, что альтернативная модель перепрограммируемый мышь, сконструированные для экспрессии факторов перепрограммирования в другом стехиометрии может производить тетраплоидные компетентные плюрипотентных клеток даже в отсутствие лечения аскорбиновой кислоты ^25. Тем не менее, в наших руках клеток из этого штамма перепрограммирует на значительно ниже частоты по сравнению к настоящей Методики используются режиме мышил.

Методология, описанная в этой рукописи позволяет разделить перепрограммирования промежуточных от огнеупорной массы населения и должны рассматриваться как ценный инструмент разбираются и понять процесс перепрограммирования, удаляя предыдущие ограничения того, чтобы использовать unfractioned населения для профилирования (например, высокий шумовой сигнал от тугоплавких клеток). Сочетание описанных здесь антител позволяет выделения промежуточных продуктов из мышиных клеток с высокой степенью чистоты, однако, возможно, что дополнительные маркеры клеточной поверхности будут обнаружены в будущем, что позволит получить промежуточные продукты при еще более высокой чистоты. Пожалуйста, обратите внимание, что SSEA-1 выражение не является отличительным признаком человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и, таким этом протоколе не может быть использован на перепрограммирование клетки человеческого происхождения. В заключение, перепрограммировать После выделения промежуточных продуктов с описанным способом, может быть использован для молекулярных анализов в том числе экспрессии Профилинг, хроматин иммунопреципитации, methylome анализа, и белковые анализы.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Антимышиный CD90.2 (Thy1.2) Pacific Blue	eBioscience	48-0902-82
Античеловеко-мышиный SSEA-1 биотин	eBioscience	13-8813
Стрептавидин ПЭ-Cy 7	eBioscience	25-4317-82
Антимышь CD326(Epcam) Fitc	eBioscience	48-5791-82
Пируват натрия	Технологии жизни	11360-070
Заменимые аминокислоты MEM (NEAA)	Технологии жизни	11140-050
Эмбриональные стволовые клетки, сертифицированная для получения фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS)	Технологии жизни
Трипсин-ЭДТА (0,25%)	Технологии жизни	25200-056
Технологии GlutaMAX	Life	35050-070
β-Меркаптоэтанол	Технологии жизни	21985-023
ДМСО (диметилсульфоксид)	Сигма-Олдрич	D8418
Пенициллин/стрептомицин	Технологии жизни	15140
Раствор йодида пропидии (PI)	Сигма-Олдрич	P4864-10ML
Желатин из свиной кожи	Сигма-Олдрич	G1890
Доксициклин гиклат	Сигма-Олдрич	33429-100MG-R
Фактор ингибирования лейкемии (ЛИФ)	Millipore	ESG1107
DMEM с высоким содержанием глюкозы	Технологии жизни	11960-044
DPBS (фосфатный буферный раствор Дульбекко)	Технологии жизни	14190-144
KnockOut DMEM	Технологии жизни	10829-018
Облученные МЭФиБСП;	Технологии жизни	S1520-100
75-см<суп>2 Колбы для культуры тканей	Corning/BD Bioscience
Центрифужные пробирки 15 мл	Corning/BD Bioscience
центрифужные пробирки объемом 50 мл	Corning/BD Bioscience
Одноразовые хирургические лезвия	Clifford Hallam	SM0501
Криогенные флаконы	Corning/BD Bioscience
70 & микро; m Клеточный фильтр	BD Bioscience	352340
Taq ДНК-полимераза	Технологии жизни	10342-020