Методическая статья

Режиссер дофаминергических Neuron Дифференциация от человека плюрипотентных стволовых клеток

DOI:

10.3791/51737

⸱

15 сентября 2014 г.

 ,  , 
1Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Stanford University School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы, основываясь на знаниях из биологии развития и опубликованных исследованиях, разработали оптимизированный протокол для эффективной генерации дофаминергических нейронов среднего мозга A9 как из человеческих эмбриональных стволовых клеток, так и из человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, что было бы полезно для моделирования заболеваний и клеточной заместительной терапии болезни Паркинсона.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dopaminergic (DA) нейроны в составе компактной субстанции черной массы (также известные как нейроны A9 DA) — это специфический тип клеток, который теряется при болезни Паркинсона (БП). Существует большой интерес к получению нейронов A9 DA из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs) для регенеративной клеточной заместительной терапии при БП. Во время развития нервной системы нейроны A9 DA происходят из предшественников напольной пластины (FP), расположенных на вентральной средней линии центральной нервной системы. В данной работе мы оптимизировали условия культивирования для ступенчатой дифференцировки hPSCs в A9 DA нейроны, которая имитирует эмбриональное развитие DA нейронов. В нашем протоколе мы сначала описываем эффективную генерацию клеток-предшественников FP из hPSCs с помощью метода малых молекул, а затем преобразуем FP-клетки в нейроны A9 DA, которые могут поддерживаться in vitro в течение нескольких месяцев. Этот эффективный, воспроизводимый и контролируемый протокол хорошо работает с человеческими эмбриональными стволовыми клетками (hESCs) и человеческими индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (hiPSCs) от здоровых людей и пациентов с болезнью Паркинсона, в которых можно получить нейроны A9 DA для моделирования заболевания in vitro и скрининга лекарств, а также трансплантационной терапии клеток in vivo при БП.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дофаминергический (DA) нейроны можно найти в нескольких областях мозга, в том числе среднего мозга, гипоталамуса, сетчатке и обонятельных луковиц. Нейроны A9 DA в черной субстанции Парс компактов (SNPC) поведения управления и движения, проецируя на полосатом теле в переднем мозге и формирования экстрапирамидной системы двигателя. Вырождение A9 DA нейронов приводит к болезни Паркинсона (БП), который является вторым наиболее распространенным человек нейродегенеративные расстройства и в настоящее время неизлечимыми. Замена Клеточная терапия является одним из наиболее перспективных стратегий для лечения PD 1, поэтому, там был большой интерес при выводе A9 DA нейроны от человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs), в том числе и человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и Недавнее человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs).

Много исследований попытались вывести A9 DA нейроны от hPSCs с использованием различных методов. Самые ранние отчеты все генерируемые DA нейроны через нейроннуюрозетка этап предшественников. По совместном культивировании с MS5 2 или ПА6 3-5 стромальных клеток с или без внешних факторов роста в течение 2-4 недель, L. Studer и коллегами и трех других групп успешно индуцированных ЭСК, чтобы произвести нейронных розетки. Затем они обогатили эти розетки от механического вскрытия или ферментативного расщепления для дальнейшей дифференциации. В других докладах, исследователи генерируется нейронных розетки через эмбриоидов тела (EB) плавающие культуры дифференциацию 6-9. Позже исследователи установили монослоя на основе метода дифференциации 10,11, где они покрытием ЭСК и hiPSCs на внеклеточного матрикса, добавили различные факторы роста в культуре, чтобы вызвать дифференциацию hPSCs к DA нейронов, которая имитирует в естественных условиях развития эмбриональных DA нейронов . Хотя все эти исследования получены тирозингидроксилазу (TH) экспрессирующие клетки с некоторыми характеристиками DA нейронов, весь процесс дифференциации время и трудоемким,как правило, неэффективно, и что более важно, A9 идентичность этих нейронов не были продемонстрированы в большинстве исследований, кроме одного с LMX1a эктопической экспрессии 12. В последнее время новый плиты перекрытия (FP) основанное был разработан протокол 13-16, в котором предшественники FP с DA нейронов потенциала были впервые подготовлена ​​путем активации звуковой ежа и канонических Wnt сигнальных путей на ранней стадии дифференцировки, а затем эти клетки FP были дополнительно указываться в DA нейронов. Хотя этот протокол является более эффективным, все еще существуют некоторые проблемы; Например, весь процесс дифференциации занимает много времени (по крайней мере, 35 дней), и это зависит от клеток-фидеров 15, или EB зависит 16 или личность A9 не была продемонстрирована 14.

Здесь, на основе знаний из в естественных условиях эмбрионального развития DA нейронов и опубликованных результатов других исследователей, мы оптимизировали условий культивирования для эфпоколение циент из DA нейронов обеих ЭСК и hiPSCs. Мы сначала формируют клетки FP-предшественников путем активации канонической передачи сигналов Wnt с небольшой молекулы CHIR99021 и звуковой еж сигнализации с малых молекул SAG и purmorphamine. Эти FP клетки выразить Foxa2, LMX1a, Корин, Otx2 и нестин. Мы тогда определенном эти FP клетки к DA нейронов с факторами роста, включая BDNF, GDNF, и т.д.. Сформированные DA нейроны имеют A9 типа клеток, поскольку они являются позитивными для GIRK2 а отрицательный для кальбиндин 17. Этот протокол подачи клетка или EB независимо, высокой эффективностью и воспроизводимостью. Используя этот протокол, можно получить DA нейроны менее чем за 4 недели от ЭСК или hiPSCs нормальных людей для клеточной трансплантационной исследования, или от hiPSCs пациентов с БП для моделирования в пробирке PD или тестирования потенциальных терапевтических агентов для PD.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 приготовления питательных сред

  1. Подготовка мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) среды путем объединения следующее: 445 мл DMEM, 50 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 5 ​​мл 100x пенициллин / ампициллину маточного раствора. Хранить фильтр стерилизуют среду при температуре 4 ° С в течение не более 14 дней.
  2. Подготовка содержащей сыворотку культуральной среды HPSC путем объединения следующий: 385 мл DMEM / F12, 100 мл замены нокаутом в сыворотке крови (КСР), 5 мл 100x не-незаменимую аминокислоту раствор, 5 мл 100x пенициллин / ампициллин исходный раствор, 5 мл 100x -mercaptoethanol маточного раствора, и 10 нг / мл bFGF. Хранить фильтр стерилизуют среду при температуре 4 ° С в течение не более 10 дней.
  3. Подготовка mTeSR1 бессывороточной среды путем объединения следующее: 400 мл mTeSR1 базальной среды, 100 мл 5x добавки, и 5 мл 100x пенициллин / ампициллин раствор. Хранить среды при 4 ° С в течение не более 10 дней.
  4. Подготовка 10x коллагеназы IV маточного раствора: отвешивать 0,5 г коллагеназы IV власть, ирастворить его с 50 мл DMEM / F12 и фильтра стерилизуют. Сделать аликвоты и запастись их при -20 ° С в течение нескольких месяцев.
  5. Готовят 0,1% раствор желатина: отвесить 0,5 г желатина (из бычьей кожи, тип B) мощности и растворить его деионизованной водой. Держите автоклаве стерилизуют раствор при комнатной температуре в течение недели.
  6. Подготовьте KSR дифференциации среды путем объединения следующих: 410 мл DMEM, 75 мл KSR, 5 мл 100x несущественные аминокислоты исходного раствора, 5 мл 100x пенициллин / ампициллин маточного раствора, 5 мл 100x -mercaptoethanol маточного раствора. Хранить фильтр стерилизуют среду при температуре 4 ° С в течение не более 10 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: KSR варьируется от партии к партии, которые могут повлиять на эффективность дифференциации. Поэтому лучше, чтобы проверить несколько партий KSR найти лучший для дифференциации.
  7. Подготовьте N2 дифференциации среды путем объединения следующих: 98 мл DMEM, 1 мл 100x N2 дополнения и 1 мл 100x пенициллина / ампициллин маточного раствора. Держите фильтр стерилизовать среду на 4° C в течение не более 10 дней.
  8. Подготовка B27 дифференциации среды путем объединения следующий: 480 мл Neurobasal среду, 10 мл 50x B27 добавки, 5 мл 100x глютамаксом маточного раствора, и 5 мл 100x пенициллин / ампициллин раствор. Хранить фильтр стерилизуют среду при температуре 4 ° С в течение не более 10 дней.

2 Культура ЭСК и hiPSCs на MEF фидерных клеток

ЭСК H9 были получены из WiCell научно-исследовательского института и hiPSCs были созданы в лаборатории Reijo Pera через ретровируса-опосредованной трансдукции Яманака факторы OCT3 / 4, Sox2, KLF4, и с-тус 18.

  1. По крайней мере, за один день до прохождения клеток, подготовить некоторые желатиновых пластин, добавив 1 мл 0,1% желатина в 1 лунку 6-луночные планшеты, и инкубировать пластин при 37 ° С в течение не менее 30 мин.
  2. После инкубации, аспирация желатина из пластин, и облучение семян инактивированной MEF клеток на планшетах при плотности 1,6 × 10 5 клеток/ Лунку в среде MEF с помощью гемоцитометра для подсчета клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости подготовить MEF кормушки, чем за 3 дня до прохождения клеток.
  3. Пассаж клетки один день после посева MEF кормушки: аспирата средние от hPSCs, добавить 1 мг / мл коллагеназы IV к клеткам в 1 мл / лунку, и инкубировать клетки при 37 ° С в течение 1 часа.
  4. Во время этой инкубации, мыть MEF питатели один раз PBS, а затем добавить теплой (37 ° С), содержащей сыворотку культуральной среды HPSC на 1,5 мл / лунку.
  5. Через 1 час, коснитесь планшета для культуры пару раз так, что большинство из недифференцированных колоний будут отключаться от пластин, в то время как дифференцированные колонии остаются прикрепленными. Осторожно собрать плавающие колонии, и передавать их в 15 мл трубки.
  6. Осторожно промыть пластины один раз с теплым (37 ° C) DMEM / F12 и передавать DMEM / F12 в ту же пробирку на 15 мл.
  7. Центрифуга трубки на 179 мкг в течение 3 мин.
  8. Аспирируйте среду из трубок, стараясь не потревожить осадок. Добавить войнум HPSC культуральной среды, пипетки клетки вверх и вниз несколько раз, чтобы разорвать их на мелкие кластеры и хорошо перемешать.
  9. Перенесите клетки на новые MEF фидеров на 1: 3-1: 6 соотношение.
  10. Изменение среды каждый день, и проход клетки каждые 5-6 дней.

3 Получение клеток для дифференциации

  1. По крайней мере, за один день до приготовления клеток, подготовить некоторые Матригель пластины (обычно 3 лунки 6-луночного планшета). Развести Матригель с холодной (4 ° С) DMEM / F12 в 1:40 и добавить 1 мл Матригель на лунку 6-луночных планшетах. Выдержите Матригель пластин при 4 ° С в течение ночи. ПРИМЕЧАНИЕ: Можно запечатать Матригель пластины парафильмом и запастись их при 4 ° С до тех пор, как за одну неделю.
  2. Используйте клетки (этап 2) 4 дня после прохождения. Удалите все дифференцированные колонии от пластин. Аспирируйте среды из культуральной пластины, добавить 1 мл на лунку Accutase, и инкубируют клетки при 37 ° С в течение 5 мин.
  3. Во время инкубации, подготовить некоторые гельAtin пластин добавлением 1 мл желатина 1 колодец 6-луночных планшетах. Поместите эти тарелки и матригелем тарелки, приготовленные за день до в инкубаторе.
  4. После 5-минутной инкубации или когда клетки стали полуплавающие, пипеток клетки вверх и вниз несколько раз, чтобы сделать их в одиночных камерах.
  5. Соберите одиночных клеток в 15 мл пробирки и центрифуги при 258 мкг в течение 3 мин.
  6. Ресуспендируют клеток с соответствующим количеством сыворотки, содержащей культуральную среду HPSC, а также добавить Thiazovivin в конечной концентрации 2 мкМ.
  7. Передача клеток на покрытых желатином пластин в соотношении 1: 1, и инкубируют клетки при 37 ° С в течение 30 мин, чтобы удалить MEF питатели.
  8. Перенесите клетки к 15 мл коническую трубку, добавить соответствующее сыворотки, содержащей HPSC среду и подсчета клеток с гемоцитометре.
  9. Центрифуга клетки при 258 мкг в течение 3 мин.
  10. В центрифуге, добавить Thiazovivin в соответствующие mTeSR1 среды, чтобы сделать концентрации 2 мкМ.
  11. После центрифугирования, аspirate среду и добавить соответствующее mTeSR1 среду с Thiazovivin так что есть 1,8 х 10 5 клеток / мл среды.
  12. Выньте пластины Матригель из инкубатора, аспирации Матригель и добавить 2 мл смешанных клеток на 1 лунку 6-луночных планшетах.
    Примечание: плотность клеток должна быть 3,6 × 10 4 клеток / см 2 площади поверхности.
  13. Возвращение пластины обратно в инкубатор, и пусть клетки приложить в течение 24 часов.
  14. 24 часа в сутки после посева клеток, аспирация старый субстрат и добавить 2 мл новый mTeSR1 среду на лунку и пусть клетки расти еще 24 часов, прежде чем начать дифференцировку.

Сотовый Дифференциация

  1. Начните дифференциации 48 часа после replating клетки на матригеля пластин.
  2. Аспирируйте культуральную среду от пластины, промыть клетки один раз PBS, и добавляют 2 мл следующем дифференцировки среды на лунку: KSR дифференцировки среде с добавлением 10 мкМ SB431542 и 100 нМ LDN-193189. Отметить этот день как D0 дифференциации.
  3. Изменение средней ежедневно с D0 до D20.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно приготовить среду для использования не более 2 дней за один раз.
  4. Используйте следующую среду для D1 и D2: KSR дифференциации среду, дополненную 10 мкМ SB431542, 100 нМ LDN-193189, 0,25 мкМ SAG, 2 мкМ purmorphamine, и 50 нг / мл FGF8b.
  5. Используйте следующую среду для D3 и D4: KSR дифференциации среду, дополненную 10 мкМ SB431542, 100 нМ LDN-193189, 0,25 мкМ SAG, 2 мкМ purmorphamine, 50 нг / мл FGF8b и 3 мкМ CHIR99021.
  6. Используйте следующую среду для D5 и D6: 75% KSR дифференцировки среды плюс 25% N 2 дифференцировки среде с добавлением 100 нМ LDN-193189, 0,25 мкМ SAG, 2 мкМ purmorphamine, 50 нг / мл FGF8b и 3 мкМ CHIR99021.
  7. Используйте следующую среду для D7 и D8: 50% KSR дифференциации среды плюс 50% N2 дифференциации среде с добавлением 100 нМ LDN-193189 и 3 мкМ CHIR99021.
  8. Используйте следующую среду для D9 и D10: 25% KSR дифференциации среды плюс 75% N2 дифференциации среду, дополненную 100 нМ LDN-193189 и 3 мкм CHIR99021.
  9. Используйте следующую среду для D11 и D12: B27 дифференцировки среде с добавлением 3 мкм CHIR99021, 10 нг / мл BDNF, 10 нг / мл GDNF, 1 нг / мл TGF3, 0,2 мМ аскорбиновой кислоты и 0,1 мМ цАМФ.
  10. Используйте следующую среду для остальной части дифференциации: B27 дифференцировки среде, дополненной 10 нг / мл BDNF, 10 нг / мл GDNF, 1 нг / мл TGF3, 0,2 мМ аскорбиновой кислоты и 0,1 мМ цАМФ.
  11. Около D16 дифференциации, подготовить некоторые поли-L-орнитин / Ламинин / фибронектина пластины. Развести поли-L-орнитин раствор с холодной (4 ° С) PBS до 15 мкг / мл, добавляют 1 мл на 1 лунку 6-луночных планшетах, и инкубировать пластин при 37 ° С в течение ночи.
  12. Аспирируйте поли-L-орнитин решение, промыть пластины 3 раза стерильной водой, а затем высушить воздух пластины.
  13. Развести ламинина фондовый зольution с холодной (4 ° С) PBS с 1 мкг / мл, добавляют 1 мл на одну лунку 6-луночных планшетах, и инкубировать пластин при 37 ° С в течение ночи.
  14. Аспирируйте ламинина решение, промыть пластины 3 раза стерильной водой, а затем высушить воздух пластины.
  15. Развести фибронектин маточного раствора с холодной (4 ° С) PBS до 2 мкг / мл, добавляют 1 мл на 1 лунку 6-луночных планшетах, и инкубировать пластин при 37 ° С в течение ночи.
  16. Seal пластины с парафильмом и разместить их на 4 ° С до тех пор, как две недели.
  17. После 20 дней дифференциации, replate ячейки на поли-L-орнитин / Ламинин / фибронектина пластин. Аспирируйте дифференциации среднего, добавить 1 мл теплого (37 ° С), чтобы Accutase 1 лунку 6-луночных планшетах, и инкубируют клетки при 37 ° С в течение 5 мин.
  18. Во время инкубации, разместить поли-L-орнитин / ламинин / фибронектина пластин в инкубаторе.
  19. После 5-минутной инкубации или когда клетки стали полуплавающие, мягко пипетки клетки вверх и вниз несколько раз впревратить их в одиночных камерах.
  20. Соберите отдельные клетки в 15 мл конические пробирки и добавить соответствующее количество Neurobasal среды для подсчета клеток, который будет изменяться в зависимости от расширения (после 11 дней дифференциации, клетки могут расширить 15-20 раз). Граф клеток с использованием гемоцитометра.
  21. Центрифуга клетки при 258 мкг в течение 3 мин. Аспирируйте надосадочной жидкости и ресуспендирования клеток В27 дифференцировки среды таким образом, чтобы концентрацию клеток 1 × 10 6 клеток / мл среды.
  22. Аспирируйте фибронектина с пластин, дважды промывали PBS и добавляют 2 мл клеток в 1 лунку 6-луночных планшетах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность клеток для replating должно быть 2 х 10 5 клеток / см 2 площади поверхности.
  23. Изменение средней 24 часа спустя, чтобы удалить любые одиноких мертвые клетки.
  24. Измените среднего через день, пока желаемых временных точках для данного эксперимента.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обзор протокола дифференцировки показано на рисунке 1. Эффективность протокола дифференцировки представленной здесь полагается на статус исходных клеток. Таким образом, крайне важно, чтобы убедиться, что, первый удаляет все дифференцированные колонии до диссоциации hPSCs на отдельные клетки к дифференциации, и второй, один истощает большинство, если не все, то MEF фидерных клеток путем инкубации клеток на покрытых желатином пластин в течение 30 мин, и третье, один пластин HPSC отдельные клетки в соответ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стволовые плюрипотентные клетки человека (в том числе обоих ЭСК и hiPSCs) могут быть дифференцированы в пробирке для создания большинства, если не всех, типы клеток нашего тела, включая DA нейронов, которая была продемонстрирована в предыдущих исследованиях 19. Здесь, на основе знаний из эмбриональных дофаминергической развития нейронов 20 и опубликованных протоколов от других лабораторий 14,15, мы оптимизировали условий культивирования для генерации DA нейронов ЭСК и hiPSCs. Эт...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят сотрудников лаборатории Рене Рейо Пера за помощь во время разработки этого протокола и во время подготовки этой рукописи. Эта работа поддерживается общей лабораторией Калифорнийского института регенеративной медицины (CIRM) (CL-00518).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEMLife Technologies10569-010
FBSLife Technologies26140
пенициллин/ампициллинLife Technologies15140-122
DMEM/F12Life Technologies10565-018
KSRLife Technologies10828-028
Заменимые аминокислотыLife Технологии11140-050
b-меркаптоэтанолMilliporeES-007-E
bFGFR& D Systems233-FB-025
mTesR1STEMCELL Technologies5850
Коллагеназа IVLife Technologies17104-019
ЖелатинSigma-AldrichG9391
N2 добавкаLife Technologies17502-048
B27 добавкаLife Technologies17504-044
НейробазалЛайф Технолоджис21103-049
ГлутамаксЛайф Технолоджис35050-061
ПБСЛайф Технолоджис10010-023
Сниженный фактор ростаБД Бионауки354230
АккутазаМП Биомедикалс1000449
ТиазовивинСанта Круз Биотехнологииsc-361380
SB431542Tocris Bioscience1614
LDN-193189Stemgent04-0074
SAGEMD Millipore566660-1MG
PurmorphamineSanta Cruz Biotechnologysc-202785
FGF8bR& D Systems423-F8-025
CHIR99021Cellagen TechnologyC2447-2s
BDNFR& D Systems248-BD-025
GDNFR& D Systems212-GD-010
TGF-beta3НИР D Systems243-B3-002
Аскорбиновая кислотаSigma-AldrichA4034
cAMPSigma-AldrichD0627
Мышиное антитело к человеческому NESTINSanta Cruz Biotechnologysc-239271/1,000 разведение
Кролик против человека OTX2 антителоMilliporeAB95661/2,000 разведение
Козье антитело против человека FOXA2НИР D SystemsAF24001/200 разведение
кролика против человека LMX1a антителоМиллипорAB105331/1,000 разведение
Кролик против человека TH антителоPel FreezP401011/500 разведение
Курица против человека TH антителоMilliporeAB97021/500 разведение
Мышь против человека TUJ1 антителоCovanceMMS-435P1/,2000 разведение
Кролик против человека GIRK2 антителоAbcamab307381/300 разведение
Кролик против человека антитело к кальбиндинуAbcamab250851/400 разведение
ЦентрифугаEppendorf5804

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Freed, C. R. Will embryonic stem cells be a useful source of dopamine neurons for transplant into patients with Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 1755-1757 (2002).
  2. Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 12543-12548 (2004).
  3. Park, C. H., et al. In vitro and in vivo analyses of human embryonic stem cell-derived dopamine neurons. Journal of Neurochemistry. 92, 1265-1276 (2005).
  4. Buytaert-Hoefen, K. A., Alvarez, E., Freed, C. R. Generation of tyrosine hydroxylase positive neurons from human embryonic stem cells after coculture with cellular substrates and exposure to GDNF. Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 669-674 (2004).
  5. Zeng, X., et al. Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 925-940 (2004).
  6. Yan, Y., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
  7. Schulz, T. C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to dopaminergic neurons in serum-free suspension culture. Stem Cells. 22, 1218-1238 (2004).
  8. Park, S., et al. Generation of dopaminergic neurons in vitro from human embryonic stem cells treated with neurotrophic factors. Neuroscience Letters. 359, 99-103 (2004).
  9. Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3392-3397 (2008).
  10. Cooper, O., et al. Differentiation of human ES and Parkinson's disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid. Molecular and Cellular Neurosciences. 45, 258-266 (2010).
  11. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27, 275-280 (2009).
  12. Sanchez-Danes, A., et al. Efficient generation of A9 midbrain dopaminergic neurons by lentiviral delivery of LMX1A in human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Human Gene Therapy. 23, 56-69 (2012).
  13. Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6, 336-347 (2010).
  14. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
  15. Xi, J., et al. Specification of midbrain dopamine neurons from primate pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 1655-1663 (2012).
  16. Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1, 703-714 (2012).
  17. Mendez, I., et al. Cell type analysis of functional fetal dopamine cell suspension transplants in the striatum and substantia nigra of patients with Parkinson's disease. Brain: a Journal of Neurology. 128, 1498-1510 (2005).
  18. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  19. Nishimura, K., Takahashi, J. Therapeutic application of stem cell technology toward the treatment of Parkinson's disease. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 171-175 (2013).
  20. Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nature Reviews. Neuroscience. 8, 21-32 (2007).
  21. Wang, G., et al. Noggin and bFGF cooperate to maintain the pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 330, 934-942 (2005).
  22. Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14071-14076 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

A9LMatrigel

Похожие статьи