Иммунофлуоресцентное метод характеристики пищевода клеток Барретта

Краткое содержание

Существует заметная потребность в улучшении информации о молекулярных водителей пищевода Барретта. Окрашивание Иммунофлуоресцентное является полезным методом для понимания последствий клеточной сигнализации на морфологии клеток. Мы представляем простой и эффективный протокол для использования иммунофлуоресцентного окрашивания для оценки терапевтического лечения в пищеводе клеток Барретта.

Аннотация

Аденокарциномы пищевода (ВАС) имеет общую выживаемость менее 17% и заболеваемость EAC резко возросло за последние два десятилетия. Одним из основных факторов риска EAC является пищевод Барретта (BE), метапластические изменение чешуйчатого пищевода в ответ на хронической изжоги. Несмотря на хорошо установленного соединения между ВАС и BE, допрос молекулярных событий, в частности, измененных сигнальных путей, включающих прогрессирование быть EAC, мало изучены. Во многом это связано с отсутствием подходит в пробирке моделей, доступных для изучения этих болезней. Недавно иммортализованные BE клеточные линии стали коммерчески доступны позволяет исследований в пробирке ВЕ. Здесь мы представляем метод для иммунофлуоресцентного окрашивания увековечены BE клеточных линий, что позволяет в пробирке характеристики сигналов и структуры клеток после воздействия терапевтических соединений. Применение этих методов будет Хельр развивать понимание механизмов, участвующих в ВЕ до прогрессирования EAC и предоставить потенциальным возможности для лечения и профилактики EAC.

Введение

Пищевод Барретта (BE) является метапластические изменение нормального плоского эпителия пищевода и следствие хронического воздействия желудочного содержимого в результате гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (ГЭРБ) ^1. BE, как думают, защитный механизм в ответ на ГЭРБ, однако присутствие ВЕ придает повышенный риск аденокарциномы пищевода (ВАС), болезни, которая несет в себе значительно плохое выживание ^1. Согласно текущим оценкам, до 5,6% американского населения BE, однако, как BE часто протекает бессимптомно, считается, что большинство ВЕ остается невыявленным ^2. Как частота как ГЭРБ и EAC видели постоянный рост ^3, стало важно понять молекулярные механизмы, участвующие в прогрессировании BE для ВАС, в частности, эта информация потенциально может обеспечить терапевтические подходы к предотвращению прогрессирования BE для ВАС.

Пациент направленные исследования привели к текущей парадигмы BE-EAC патогенезе ^1. Хроническое воспаление, травма, и генотоксичным ущерб в результате длительного воздействия желудочного содержимого оказывают селективное давление на BE поражения, способствующего опухолевой прогрессии в ВАС. Ряд генетических изменений были определены во время BE в EAC прогрессии. Тем не менее, несмотря на это есть явное отсутствие понимания о точных изменений в клеточной сигнализации и последующих воздействий на структуры и функции клеток.

Увековечены в пробирке клеточных линий являются полезными инструментами для изучения эффектов клеточной сигнализации, особенно в расследовании последствий целевых терапевтических соединений. Недавнее коммерческая доступность иммортализованных BE клеточных линий позволяет для таких исследований. Хотя высокой пропускной анализы, такие как широко используемых жизнеспособности анализов, могут оказаться ценными в оценке последствий целевой терапии на клеточной пролиферации и суrvival ^4-6, эти анализы не являются полезными для допроса эффекты клеточной сигнализации на морфологии клеток. Иммунофлуоресцентное окрашивание (IF) является полезным методом для изучения влияния целевой терапии от характеристик морфологических, роста и выживаемости клеток и белков, которые участвуют. Наша лаборатория адаптировался эти методы к увековечены BE клеточных линий, используя ЕСЛИ чтобы оценить эффекты клинически доступного препарата при линий BE клеток в надежде разграничения возможного chemopreventative лечение и биомаркеров для лечения наркозависимости ^7. Аналогично, применение этих методов в EAC, BE и увековечил пищевода клеточные линии уже очерчены критические выводы относительно BE в EAC прогрессии ^8-10. Мы находим ЕСЛИ анализ BE клеток, обработанных целевой терапии имеет значение, что позволяет для характеристики изменений в структуре клеток и локализации белков. Здесь мы представляем наши методы ПЧ иммортализованных BE клеток к сharacterize медикаментозное лечение.

Протокол

1. Клеточная линия Техническое обслуживание

1. Увековеченный человека быть полноценным диспластические (СР-В, CP-C, CP-D) и метапластические (CP-А) клеточные линии по стабильной трансфекции человеческого теломеразы обратной транскриптазы (трет) белок ^11.
2. Поддержание BE клеточные линии кератиноцитов в средах с добавлением экстракта бычьего гипофиза (BPE), эпидермальный фактор роста (EGF), 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), заменимые аминокислоты (NEAA), пенициллин-стрептомицин-неомицин (PSN) и стандарт условия для культивирования тканей (37 ° C, 5% CO _2, 98% влажности).

2. BE сотовый Покрытие

1. Получение 12-луночный планшет / покровные. Поместите 18 мм покровные в стеклянную чашку Петри и автоклав. Передача в автоклаве 18 мм покровные стекла в блюдо культуры ткани 12-а, используя стерильную стеклянную пипетку, прикрепленный к вакуумной трубки. Вымойте покровное стерильной PBS и СМИ.
2. Trypsinize и считать иммортализованные быть клетки. Граф клеток USIнг автоматизированный счетчик клеток или гемоцитометра. Развести клеток в культуральной среде до концентрации 20,000-40,000 клеток / мл.
3. Поместите 1 мл клеток в каждой лунке, содержащей покровное для общего количества клеток в 20,000-40,000 клеток / лунку.
4. С помощью стерильной пипетки аккуратно введите покровное в нижней части скважины для того, чтобы клетки приложить к покровное.

3. Медикаментозное лечение быть клетками

1. Развести выбранный препарат в теплых (37 ° C) сред в желаемой концентрации и хорошо перемешать путем обращения трубки несколько раз или с помощью вихревой мешалки. Определены концентрации препарата эмпирически. Начать лечение через 24 часа после первоначального посева Бе клеток, чтобы позволить вложение клеток на на покровное
2. Для сравнения и контроля, лечения дополнительный покровное Бе клеток с 0,1% транспортного средства (диметилсульфоксид [ДМСО] или агент, используемый для растворения соединения), разведенного в культуральной среде. Этикетка пластина с лабораторной ручкой для выявления наркотиков и ветомобиля обработанных образцов. Поместите клетки в инкубаторе для клеточных культур, установленной до 37 ° С, 5% СО _2, 98% влажности и выдержать в течение желаемых времени.

4. Иммунофлуоресцентное Окрашивание

1. Фиксация
   1. После требуемого времени инкубации лекарственной терапии, аспирация носитель и мыть покровные быстро с 1x забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) при комнатной температуре (КТ, 25 ° С).
   2. Аспирируйте PBS и добавить 1 мл PBS, содержащие 4% PFA [4% PFA / PBS] в каждую лунку и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин.
   3. Аспирируйте 4% PFA / PBS и мыть покровные 3 раза, 5 мин каждый с PBS при комнатной температуре. Храните покровные в течение одной недели в PBS с 0,1% PFA при 4 ° С, при желании.
2. Пермеабилизации / Блокирование
   Фиксированные клетки проницаемыми PFA, чтобы позволить антителу для доступа к внутриклеточные мишени. Для внеклеточного всплыли белки, выполните все последующие шаги без сапонин добавляется в 1x PBS/0.5% раствора BSA.
   1. Уменьшение фона путем инкубации с 50 мМ NH ₄ Cl, разведенного в PBS в течение 10 мин при комнатной температуре и промывают один раз PBS RT в течение 5 мин.
   2. Инкубировать быть клетками в течение 30 мин в 100-300 мкл PBS, содержащего 0,1% сапонина и 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Развести сапонин из стерилизованным фильтрацией 10% складе, приготовлены в воде и хранили при 4 ° С.
   Примечание: Это предотвращает неспецифическое связывание антител к клеточных белков, блокируя покровные из-за добавлением 0,5% БСА. Кроме того, заменить БСА с козьей сывороткой, разбавленного до 5%, чтобы помочь уменьшить неспецифическое связывание антител.
3. Подготовка человека палаты
   1. Подготовка квадратную биопроб блюдо отводками в нижней части камеры с влажных бумажных полотенец и поместить слой Parafilm сверху.
   2. Аккуратно перенести покровные, клетки, стоящие вверх, на парафильмом с помощью щипцов и иглы шприца.
   3. Отметить парафильмом с лабораторной пера выявления покровные.
4. Первичных антител Инкубационный
   1. Развести первичного антитела в PBS, содержащий как 0,5% BSA и 0,1% сапонина.
   2. Аккуратно промокните блокирующий раствор, используя лабораторную салфетку и добавить 100 мкл раствора первичной антител. Выдержите первичного антитела на BE клеток в течение ночи при 4 ° С.
5. Вторичный Инкубационный антител
   1. Вымойте слайды 3x с PBS/0.5% BSA/0.1% сапонина в течение 5 мин каждый при комнатной температуре.
   2. Развести вторичного антитела, конъюгированного с флуоресцентной меткой в ​​PBS/0.5% BSA/0.1% сапонина, что вторичное антитело распознает видов, в котором первичное антитело, поднятые.
   3. Добавить 100 мкл разбавленных антител к каждому покровное. Инкубируйте вторичное антитело в течение 2 ч при комнатной температуре.
6. Стиральная и Монтаж покровные
   1. Вымойте покровные 3 раза, 5 мин каждый в PBS/0.5% BSA/0.1% сапонина. Снимите промывочный буфер и добавить 100-300 мкл PBS, чтобы покровные.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для двойная функцияокрашивание кузова, повторите шаги 4,4-4,5 с нужным дополнительного начального и среднего антитела в соответствии с информацией, изложенной в обсуждении.
   2. Использование щипцов, мягко поднимите покровное и промокните от PBS с помощью лабораторной ткань или бумажное полотенце.
   3. Добавить 15 мкл подходящего анти-Fade монтажа среде, содержащей 4 ',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) к покровным и инвертировать покровное клетки вниз, на предметное стекло микроскопа.
   4. Поместите слайды в папку слайд и инкубировать от прямого света ночи при комнатной температуре, чтобы позволить трудно установить анти-увядает среднего вылечить, в соответствии с инструкциями производителя. После того, как анти-увядает среднего установил, слайды не могут быть сохранены на любом 4 ° С или -20 ° С до микроскопической визуализации.

5. Микроскопическое Визуализация покровные

Окрашенные клетки могут быть отображены либо через конфокальной микроскопии или ЕСЛИ способен вертикально Микроскопэ. Хотя конфокальной микроскопии позволяет получить изображение с высоким разрешением в дискретные глубинах, в вертикальном положении микроскопические способен производить полезные изображения быстрее. Для краткости, метод визуализации, окрашенных BE клетки с использованием стандартной микроскопии представлена. В общем, чтобы изображения флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) или аналогичных флуорофорами (т.е. зеленый флуоресцентный белок), Техас Красный и DAPI, требуется микроскоп с фильтрами, способными различать эти флуорофоры. Проверьте микроскоп перед началом протокола, чтобы определить совместимые флуорофоры.

1. Изображений на стандартной, если микроскоп
   1. Удалить сохраненные слайды / покровные от -20 ° С или 4 ° С и дать им возможность нагреться до комнатной температуры. Включите микроскопа и дуговой ртутной лампы.
   2. Наведите микроскопа с покровное обращенной к цели на столике микроскопа. Для использования масляного иммерсионного объектива, добавить каплю иммерсионного масла на покровное.
   3. Выберите DAPI фильтр и открыть затвор.
   4. Сфокусируйтесь на цели, глядя через окуляры, пока не появится изображение. Поскольку все клетки будут окрашиваются DAPI, ядра должны быть легко наблюдается.
   5. Сбор изображений с помощью соответствующего программного обеспечения для обработки изображений.

Результаты

Пример результатов, полученных с применением описанных процедур показано на фиг.1А-D. Покровные с CP-D и CP-C BE клетки обрабатывали в течение 24 часов с 1 мкМ семейного ингибитора Src, SKI-606, или транспортного средства (ДМСО) и окрашивали с использованием вышеуказанных процедур слипчивых Junction и Wnt сигнализации белок, β -катенин. Визуализация β-катенина было достигнуто за счет маркировки с анти-IgG кролика в сочетании с зеленым флуорофором, в то время как маркировка клеточного ядра было достигнут...

Обсуждение

Мы наметили способ применения ИФ BE клеток к выяснению физиологические эффекты целевой терапии на этих клетках. В то время как мы описали использование этих процедур по отношению к быть клетками, мы обнаружили, что эти методы применимы также к различным различных типов клеток ^13,17,18. Кроме того, эти процедуры могут быть изменены в нескольких способов оптимизации окрашивание для конкретных задач.

Мы находим один параметр, который имеет прямое влияние на правильной, если это выбор...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
CP-A (метапластическая клеточная линия)	ATCC	CRL-4027
CP-B (высокодиспластическая клеточная линия)	ATCC	CRL-4028
CP-C (высокосортная диспластическая клеточная линия)	ATCC	CRL-4029
CP-D (высокосортная диспластическая клеточная линия)	ATCC	CRL-4030
кератиноцит-SFM (1x), Liquid	Life Technologies	17005-042
0,25% Трипсин-ЭДТА (1х), Фенол Ред	Life Technologies	25200056
Сыворотка для плода крупного рогатого скота, сертифицированная, HI	Life Technologies	10438026
смесь антибиотиков PSN	Life Technologies	15640
PBS - фосфатно-солевой буфер	Life Technologies	10010049
пролонгированным золотым реагентом Antifade с DAPI	Life Technologies	P36931
Круглое стеклянное покровное стекло 18 мм	Fisher Scientific	15-183-86
β-катенин Первичное антитело (кролик)	Клеточная сигнализация	9562S
Alexa Fluor 488 (козья анти-кролиха)	Life Technologies	A11008
10 см TC обработанная PS чашка, стерильная	США Scientific	CC7682-3394
12-луночный ТС обработанный PS планшет, стерильный	США Научный	5666-5180
ДМСО	Сигма-Олдрич	276855
Параформальдегид	Сигма-Олдрич	P6148
Хлорид аммония	Сигма-Олдрич	A9434
Сапонин	Сигма-Олдрич	47036
Бычий сывороточный альбумин - фракция V	Sigma-Aldrich	85040C
SKI-606 (Босутиниб)	Selleck Chemicals	S1014
Квадратная чашка для биопроб	Thermo Scientific	240835
Parafilm	VWR	82024-546
Одноразовые пипетки Пастера, кремневое стекло	VWR	14672-380
Nexcelom Счетчик мини-ячеек	Nexcelom
Счетные камеры для целлометра	Nexcelom	CHT4-SD100-014
Zeiss Apotome микроскоп	Цейсс