Одновременные Долгосрочные Записи на двух этапах нейронов обработки своем поведении медоносных

Summary

Одновременные внеклеточных долгосрочной записи с двух разных neuropiles мозга или двух различных анатомических путей были созданы в пчел. Эти записи позволяют расследование временных аспектов нейронов обработки в различных областях мозга на одного нейрона, а также на ансамбль уровне в ведет себя животное.

Abstract

В обоих млекопитающих и насекомых нейронов информация обрабатывается в разных центрах выше и более низкого порядка мозга. Эти центры связаны через конвергентных и дивергентных анатомических соединений, включая корма вперед и обратной проводки. Кроме того, информация из того же происхождения частично отправлены через параллельных путей в разные, и иногда в тех же областях мозга. Чтобы понять эволюционные преимущества, а также вычислительные преимущества этих стратегий проводки и особенно их временных зависимостей друг на друга, необходимо иметь одновременный доступ к отдельных нейронов различных путей или neuropiles в том же препарата при высоким временным разрешением. Здесь мы сосредоточимся на пчел, демонстрируя уникальную внеклеточный долгосрочный доступ для записи мульти блок деятельность на двух последующих neuropiles ^1, антенной доле (AL), первой обонятельной стадии обработки и тела гриба (МБ), высшего порядка интеграции центральной инволюцииlved в процессе обучения и формирования памяти, или двух параллельных нейронных путей ² смежных Л. с МБ. Последний был выбран в качестве примера и будут описаны в полном объеме. В опорной видео демонстрируется строительство и постоянное введение гибких многопроводная канал электродов. Парные дифференциального усиления микро проволочный электрод каналов резко снижает шум и проверяет, что источник сигнала тесно связано с положением концом электрода. Механическая гибкость используемых проволочных электродов позволяет стабильные инвазивные долгосрочной записи в течение многих часов до дней, что является явным преимуществом по сравнению с обычными дополнительных и внутриклеточных в технике звукозаписи естественных условиях.

Introduction

Медоносные пчелы, как и большинство других насекомых во многом полагаются на обоняние. Среди прочего они используют обонятельные сигналы для ориентации, спаривания, общение с особями, и собирательством. Их хорошо разработаны обонятельная система способствует богатым репертуаром учебных поведения, связанных с цветочными запах раздражители. Такое поведение может быть легко изучены в контролируемых лабораторных условиях (см. обзор ^{3 - 5).} Их "мини мозги" (ср. ⁶⁾ с их относительно небольшого числа нейронов делает пчела хорошо подходит модельный организм для изучения обонятельной кодирование и обучения в ходе мониторинга нейронной активности.

Обонятельная система у насекомых, а также у млекопитающих показывает аналогичную организацию в значительной степени (см. обзор ^7,8). В пчел около 80000 нейронов рецепторов ^9, расположенные в сенсилл вдоль антенн ^10,11 перевести стимул окружающей запах в Neurнальных сигнал. Аксоны от обонятельных рецепторных нейронов иннервируют антенной доле (AL), который имеет клубочковой организацию, сопоставимую с позвоночных обонятельной луковице. AL включает в себя около 164 клубочков, соединенные друг с другом около 4000 местных интернейронов (LN) (см. обзор ^12). Особенно в медоносной пчелы было показано недавно, что LNs обеспечить пятнистый боковое подключение и что различные субпопуляции обладают элементарные и configural обонятельные свойства кодирования ^13,14. А.Л. было показано, что подразделяется на вентральной и дорсальной геми доли, явившихся основанием медиальной и боковой антенной доле тракта (м-и л-ALT; ранее назвал м-и л-APT для медиальной-и боковой антенной доле protocerebral урочищу ^{15 - 17).} Вот новая терминология тракта введен результате недавно проведенной работы по единой номенклатуре насекомых мозга будет использоваться ^18. Оба АЛТ (л-и м-ALT) объединить либо 410 (л-ALT) или 510 (м-ALT) uniglomerular Projeие нейроны (PN), соответственно ^15,16,19. ПШ обоих путей недавно было показано, что код запахов в параллельном ² (см. обзор ^17,20), и оба участки синаптически образуют расширяющееся связи с Kenyon клеток (КЦ), тело гриба (МБ) основных нейронов. Каждый Мб содержит около 172 000 крон ^{21 - 23.} МБС, как известно, участвует в интеграции стимула, обучение, а также формирования памяти. ОВБ дендриты крон формируют цветонос (стволовых гриба), который имеет два основных вывода регионы: Vertica или альфа-лепестков, а по горизонтальной или бета-доля ^22,24. Выход МБ сходится к всего около 400 внешних нейронов (EN) ^24. Энс ответственность за обонятельной обработки информации в основном иннервируют вентральной части вертикальной доли ^22. Недавно было показано, что ЕН записанные в этой области кодирования вознаграждение запах ассоциации ^25.

Временная какpects внутри обонятельной системы насекомых, а также позвоночных стали важным и значимым аспектом в качестве потенциального принципе ²⁶ кодирования ^{- 29.} Чтобы иметь возможность одновременно записывать несколько нейронов с разных сайтов с высоким временным разрешением, мы создали двойные многоканальный методы блок записи с помощью настраиваемых многопроводная канал электроды, введенные в различных целевых регионах в обонятельной системы пчелы. Такой подход позволяет анализировать и сравнивать временной обработки в системе обоняния пчел на уровне отдельных нейронов и популяций нейронов либо между параллельными обонятельных путей, двойной обонятельной пути ² или между различными последующих neuropils ^1. Недавно с подобным экспериментальным подходом в борьбе с саранчой обонятельной системы ^30, используя другую конфигурацию электродов смогли проанализировать пространственно-временной механизм кодирования для фона-инвариантной признания запаха ^31. Чтнам, установленные двойные записи позволяют собирать пространственную информацию о одновременных нейронных профилей деятельности.

По сравнению с более широком пространственном выборки, полученной из изображений кальция этот метод позволяет записывать полученные только из двух пятен. Однако преимущество по сравнению с методами визуализации кальция является высокая точность временной потенциала действия записей, которые не могут быть предоставлены либо в обычной ПЗС съемки изображения или приобретения 2-фотонов. В внеклеточные электроды, описанные здесь, постоянно имплантированы и фиксированной по отношению к мозгу и головной капсулы, избегая электрода дрейф. Это является явным преимуществом по сравнению с использованием острых внутриклеточных электродов. Еще одно преимущество по сравнению с внутриклеточных записей и изображений кальция является длительное время нейронная наблюдения от многих часов до суток. Это является важной предпосылкой для расследования нейронных коррелятов формирования обучения и памяти. Дополнительные мультиблок записи более подробно изложены в разделе обсуждения.

В этой методологической обзор изготовления процедура обычай проводов дизайн электродов будет показано, взято из ^32,33 и подходит для долгосрочных нескольких единичных записей в медоносной пчелы мозга. Кроме того, пример того, как эти типы электродов постоянно имплантированы на двух различных участках записи в пределах пчел обонятельной системы для записи одновременно L-и M-ALT в течение длительных периодов времени, чтобы позволить множество протоколов стимуляции показан ^2. Для проверки позиций записи в качестве примера и протокол для окрашивания и записи после визуализации записи сайтов предоставляется.

Protocol

1. Электрод Строительство (рис. 1)

1. Производство электродной адаптер, который подходит электродный интерфейсную плату коммерческого мульти систем канальный усилитель ^1,2,25.
   1. Используйте маленькую оргстекла пластины приклеены к разъему базы 18 Pin.
   2. Подключите базу с 3 коротких отрезков изолированного провода до 3 отдельных пайки наконечников навинчивают на оргстекла пластины (рис. 1 А1-А3).
   3. Вставьте паз на оргстекла пластины, в которой стеклянный капилляр легко передвигаться и удерживаться на месте с помощью винта (рис. 1 В1).
   4. Расширение стеклянный капилляр около 5 мм с помощью minutien штифт.
   5. Прикрепите микро выводы электрода вдоль minutien штифта и стеклянного капилляра, чтобы гарантировать стабилизацию и поддержку.
2. Многоканальный производство микро провод (принят от Ryuichy Окада ^32,33)
   1. Размах 3 микро провода (с полиуретановым покрытием медного провода, 15Диаметр мкм) таким образом, что они находятся рядом друг с другом (рис. 1 В2).
   2. Используйте 12 V пайки иглу распространять тонкую пленку с низкой температурой плавления зубных слепков (50 ° C) частично по проводам, чтобы склеить их вместе (конец электрода) (рис. 1 В3). Оставьте на несколько сантиметров слабины (конец электрода), а этот раздел будет использоваться в дальнейшем для подключения микро провода с адаптером электрода.
3. Подключите многоканальный микро провод к адаптеру электрода
   1. Снимите стеклянный капилляр из держателя и приложите его с minutien штифта до кончика электрода. Принесите его в положение, параллельное микро-электрода (Рисунок 1 B3).
   2. Клей кончик электрода в minutien штифта с использованием низкой температурой зубной воск и сократить микро электрода на кончике, выступающий на 2-3 см от minutien штифта и в конце электрода (маленькие стрелки Рисунок 1 B3).
   3. Слип капиллярную слightly обратно в адаптер электрода. Используйте винт, чтобы исправить это (рис. 1 В4).
   4. Припой свободные концы трех проводов к пайке наконечников с помощью паяльник с температурой около 360 ° С, чтобы обеспечить плавление изоляции (рис. 1 В4). После пайки, убедитесь, что имеется достаточно электрический контакт (~ 300 кОм).
   5. Установите один из электродов (Мастер) к электроду интерфейсной плате headstage и исправить другие мульти электрод канала (Slave) на отдельный адаптер. Подключите каналы ведомого к ведущему электрода (рис. 1 С1). Кроме того, припаять ссылку, а также мышечные электроды к главному электрода базы (рис. 1 С2).

2. Пчела Подготовка (рис. 2)

В этих экспериментах, описанных, пчелы (Apis Mellifera), который является беспозвоночных животныхи, следовательно, не требует конкретные этические разрешений на использование, используется.

1. Поймать пчелы комбайны (А. MELLIFERA) в улей входом в первой половине дня, как показано другими ^34,35.
2. Холод пчел на дробленый лед до иммобилизации (от 5 до 10 мин) и исправить один в стандартном держателе оргстекла или металлической трубки таким образом, чтобы голова подвергается (рис. 2). Для минимизации движения головы использовать легкоплавкого зубной воск (~ 50 ° C) и тщательно фиксировать голову к держателю вокруг основе сложных глаз и шеи.
3. Используйте легкоплавкий воск для фиксации scapi из антенн на головной капсулы (рис. 2 Б), не касаясь жгутик. Жгутик антенны необходимо отметить вперед. Убедитесь, что пчелы могут свободно перемещаться хоботок.
4. Бритье головы капсулу для обеспечения спокойного вид и доступ к верхней части головы.
5. Кормите пчелу с 30%-ным раствором сахарозы до saturatiна чтобы обеспечить достаточное увлажнение мозговой ткани и хорошую жизнеспособность животных (рис. 2 C).
6. Сделать осторожные надрезы вертикально вдоль границ сложных глаз и горизонтально над основания усиков, а также под глазками и удалить остатков кусок кутикулы (рис. 2 D).
7. Осторожно отложите гипофарингеальных желез и удалить трахею, чтобы обеспечить четкое представление и доступ к мозгу предварительного к электроду вставку (рис. 2E, 2F).

3. Электрод Вносимые

В случае примера, показанного на рисунке 2, один электрод расположен направленный на L-ALT, другая с целью на м-ALT ^2. Использование конкретных ориентиров, другие целевые регионы также возможны, например областей вывода AL и MB ^1.

1. Расположите электроды с помощью микроманипуляторами в интересующей области ( Рисунок 2G и 3А). Для целевой м-Alt поместите электрод между AL и кнутри от вертикальной доли Мб. Убедитесь, что место введения будучи выше разветвления медиолатеральной ALT PN. Выступать электрод в мозг с глубиной около 180 мкм (фиг. 2Е). Для л-ALT PN записи месте электрод ниже боковой protocerebrum (ЛГ) в середине воображаемой линии между боковой стороне вертикальной доли и середине AL. Вставьте электрод с глубиной примерно 300 мкм (фиг. 2Е)
2. Вставьте ссылку (серебряной проволоки, около 25 мкм в диаметре) в ипсилатеральную сложного глаза через небольшой разрез в кутикулы. Вставьте другой серебряной проволоки в область проекции мышцы ниже боковой глазков. ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости обучения поведение пчел можно контролировать с высоким временным точностью путем записи мышц M17, который участвует Iн ответ расширение хоботок (PER) пчелы ^36, как описано в ^25.
3. Чтобы прочно закрепить электроды в мозг и головной капсулы, охватывают все пространство над мозга с двухкомпонентной кремния (рис. 2H), который предохранит мозг от высыхания. Примечание: при записи может длиться в течение нескольких часов до суток, а пчелы могут быть, например, записаны во время классической методике воздуха (рис. 2H) или стимулировали с большой панели различных запахов.

4. Приобретение и предварительной обработки данных

1. Используйте соответствующее программное обеспечение сбора данных, который отвечает следующим требованиям: отбор проб скорость мин 25 кГц; аналог ^1,25 или цифровой ^{2 толчок} дифференциации между электродными каналов; полосовой фильтр от 300 Гц до 8000 Гц, чтобы извлечь шипованные события.
2. Используйте доступные шип сортировка программного обеспечения для извлечения блока деятельность одного, например TEMPLели, соответствующие методы, как включены в программное обеспечение Spike2 (рис. 3).
3. Для дальнейшего анализа использовать временные отметки извлеченных единиц вычислить единый блок в среднем ответов запах (рис. 4) или для вычисления векторов по народонаселению при разработке анализа главных компонент (PCA) (рис. 5) с использованием коммерчески доступного программного обеспечения. Для дальнейшего анализа единый блок и задержки отклика населения пожалуйста сравнить последних публикаций ^1,2,25.

5. Визуализация Относительная электрода Должность (рис. 4)

1. Dip электродов подсказки в раствор либо 5% Alexa гидразида 568 или 5% Alexa гидразида 488, который растворяют в 0,5 М растворе хлорида калия до экспериментов записи.
2. Удалите электроды и сопроводительное кремний тщательно после опытов, промыть мозг пчелы Ringer решения, удалить железы и трахеи и вставить крошечные кристаллы tetramethylrhodamiн декстран или вставить 5%-ный раствор решена в 1,0 М ацетата калия в AL для обозначения АЗЦ anterogradely. Выполните следующие действия в темноте.
3. Разрешить краситель, подлежащих обсуждению и транспортируется проекционных нейронов вдоль их аксонов путей (30-45 мин) (рис. 4А), до мытья мозг с пчелиным раствором Рингера три раза для другого 30-45 мин.
4. не Холод пчелу на льду до иммобилизации и осторожно удалите мозг от головной капсулы. Зафиксируйте мозг, промыв его в растворе 0,1 М PBS, содержащий 4% формальдегида и держать его в течение ночи при 4 ° С.
5. Подождите не менее 12 ч до мытья мозгу два раза в 0,1 М PBS (10 мин каждый).
6. Промыть 3 раза мозга в течение 20 мин в 0,2% Triton X-100 разводили в 0,1 М PBS перед дегидратацией его в спиртовом серии восходящего (30%, 50%, 70%, 90%, 95%, 3 x 100% этанола, 20 мин каждый шаг).
7. Вставить обезвоженную мозг в метилсалицилат на предметное стекло микроскопа и сEAL его с сопроводительным слайда.
8. Используйте конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и сканировать мозг как оптических срезов каждый 2-5 мкм с использованием гармонических соединение Plan Apochromat объективную (10X 0,4 Н.А. погружение). Excite ткани с использованием 568 нм для длины волны tetramethylrhodamin декстрана и длине волны 488 нм для положения электрода.
9. Реконструировать окрашенных структуры мозга и электродов пути из изображения стеков в 3D с программным обеспечением восстановления (например,. AMIRA или Фиджи) (рис. 4).

Results

"Настоящий протокол позволяет одновременных записей на двух разных стадиях обработки в отдельных пчел и дополнительно позволяет тестировать основные механизмы обучения и памяти с помощью, например,., ПЕР кондиционирования в сдержанных пчел." Это является необходимым условием для анализа временных аспектов нейронов обработки. Метод легко адаптируется для различных научных подходов разгадать нейронов сеть обонятельной системы пчелы. Например этот метод используется (I), чтобы проанализировать временную обработку PNs в двойной обонятельной пути от пчел, л-и м-ALT ПШ (рис. 5). В рисунке 5А одним из примеров л-ALT PN одновременно записанного с PN от м-ALT дается как десять пробного среднем и иллюстрирует свои силы реагирования и время задержки в отношении пяти различных концентрациях запах как цветной маркировкой тепла участка. В среднем на семь пчел с 11 л и 13 мАLT ПШ (фиг. 5В, 5С) показывает, что оба прочность ответ а также задержка ответа, до некоторой степени, отражает концентрацию одоранта. Таким образом ПШ в этом примере увеличить их прочность отклика в то время как с увеличением концентрации одоранта их задержки ответа отказался (Цифры 5В, 5С). Этот результат весьма ограничен и действует только для анализируемого одоранта, но по-прежнему соответствует последним вычислительных моделей AL ^37. Концентрация запаха кодирование в AL пчелы лежит ли нелинейные расчеты или лежит в основе других свойств кодирования еще необходимо проанализировать в будущем. Кроме того, метод может быть использован (II), чтобы сравнить временные аспекты в деятельности населения на двух последующих этапах обработки, AL-и МВ-вывода (рис. 6). Анализ основных компонентов (РСА) показывает, что вычисление запах продлевается и пережить всю презентацию запах на уровне PN тогда как в ENы только запах и выключать набора были представлены в деятельности в области народонаселения (рис. 6). Таким образом население EN достигли своего максимальную активность уже в момент времени, когда активность PN все еще ​​развивается (ср. Movie 1).

.. Рисунок 1 Производство трехканальный микро-проволочных электродов А1) Окончания трех проводов припаяны к контактным разъемом IC в Должности 11, 13 и 16 А2) Четыре пайки наконечники привинчен из плексигласа пластиковой опорной плите.; minutien штифт вставлен в наконечнике стеклянного капилляра, который затем прикрепленной к пластиковой пластины. A3) пластиковая пластина приклеенной на верхней части контактного разъема IC и свободного конца каждого провода припаивается к одному из верхней пайки наконечники. <сильный> B1) Для оснащения держатель электрода с тонкой медной проволоки, капиллярная должен быть вывезены еще раз. B2) Основание держателя затем фиксируется в обычай сделал совместив устройства. Три медные микро провода выравниваются по канавке и фиксированной с помощью клейкой ленты на каждом конце B3) Параллельные микро провода склеиваются с зубных слепков и капиллярная ставится на место (длинные стрелки).; проклеенные микро провода затем прикрепляется к капилляра с зубной воск и его концы отрезаны (короткие стрелки). B4) Три свободные концы медных проводов припаяны к трем выступами верхних пайки таким образом приведение их в электрическом контакте с контактный разъем IC. C1) Два полностью собранных электроды могут быть соединены друг с другом для использования с одной headstage. C2) для этой цели штифты одного электрода (влево, ведомый) соединены через изолированных проводов к другому электроду (справа, мачтаER), который подключен к голове сцены; headstage подключен электрод может также собирать ввод из мышцы (М17) и электродом сравнения (Ref).

Рисунок 2. Подготовка и постоянное введение электрода в пчелином мозга.) Пчелиный вставляется в держатель плексигласа после иммобилизации на льду. Усики с жгутика (Флорида) и скапус (SC) указаны. Б) голова и усики крепятся зубной воск. C) Головная капсула побрился и пчела питается сахарной водой. D) Головная капсула открыта. E) После удаления железы и трахеи из верхней части мозга, различные neuropiles и основные ориентиры легко могут быть выделены. Траектории АЗЦ указаны вместе сотметка, где электроды вставляются. (МБ: тела гриба, AL: Усиков лепестка, О. Л.: Оптический доли, α: Альфа доли или вертикальная лопасть, АЛТ: Усиков лепестка тракта, E1: вставка электрод сторона для м-ALT записей, E2: вставка электрод сторона для L-ALT записи). F) Ссылка (Ref) и мышечные электроды (M17) вставляются в головной капсулы через небольшие отверстия в кутикуле или сложного глаза. G) Проволочные электроды вставлены в мозг на соответствующих сайтах. H) После крепления электродов на месте с помощью двух компонентов кремний, пчела-прежнему показывает PER и может быть обусловлено (например., используя сахарную воду).

Рисунок 3. Внеклеточной записи на двух нейронных путей и добычи одной элементарной (шипованные сортировки). A Б) Одновременные записи из L-и м-ALT ПШ (зеленый и фиолетовый следы), показывая возбуждающие ответы на обоих путей к 500 мс запаха стимуляции меда в водном растворе с концентрацией 1:100 на 33 ° C. Каждый нанесены линия представляет дифференцированные каналы как цветной этикетке от электрода пайки наконечников в А. Бар:. 50 мкВ С) После процедур шип сортировки одиночные потенциалы действия сортируются и цветом. Наложение отсортированных единиц иллюстрирует разделение сигналов. D) Спайк интервал гистограммы указывает на качество сепарации отсортированных блоков в качестве доказательства надлежащего шип сортировки. Примечание нет всплеска в рефрактерный период устройства. Е) Два взгляда (E1, E2) от3D кластеризация отсортированного блок с анализа главных компонент, который указывает расстояние от отсортированных блоков друг с другом. Круги указать в 2,5 раза Махаланобиса расстояние, которое напоминает SD в пространстве и указывает на значительную дифференциацию кластеров в главных компонент пространства F) с цветовым кодом единиц изображают потенциалы действия, видимые в увеличении трех каналов с одного записи путей. Пожалуйста, нажмите здесь чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. Визуализация после записи и 3D-реконструкция в положение записи. А) вид Проекция орто-ломтиками вдоль Z-оси с максимальным выравнивания интенсивности переднеи ретроградная засыпка из uniglomerular проекционных нейронов, выступающих из AL в МБ и ЛГ. Внутриклеточный трассировщик Microruby (tetramethylrhodamin декстран) был вставлен в AL после опытов записи. Витражи клубочки внутри AL собственно доказательство PN окрашивание. Б) проецирование зрения орто ломтиками вдоль Z-оси с максимальным выравнивания интенсивности от окрашивания двумя электродами с Alexa гидразида 488 указывает размещение электродов для м-ALT (E1, стрелки ) и л-ALT (Е2, стрелка). Трассирующими Alexa Гидразид 488 мигрирует к электродной окружающие ткани и окрашивает вставки сайт электрода. Примечание, видный окрашивание в AL является поверхностным артефакт. C) 3D Перестройки окрашенных клеток-мишеней (PN) и электрод вставки сайт от А, В (правая сторона) вместе со схематическим обзор пчел обонятельной системы (слева сторона) с указанием л-и м-ALT траекторий. Обратите внимание, что только uniglomerулар PN участки показаны. : Усиков нерва, А. Л.: Усиков лепестка, Льюис Хэмилтон: боковая рог, MB: тела гриба, E1, E2: сайты встраивания электродов, м-ALT: медиальная усиков доли тракта, л-ALT: боковой усиков доли тракта, с: хвостовой, т: ростральная, м: медиальная, л:. боковая Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5. Пример запаха концентрации кодирования в двойной обонятельной пути. A) Тепловые графики иллюстрируют реакцию одного L-ALT (зеленый) и один м-ALT PN (фиолетовый) приобрел одновременно с индивидуальной пчелы в ответ на одоранта гексаналь при увеличении концентраций запаха (от 1: 10 ^-6 до 1:100). Каждая строка представляет собой среднее из десяти пробных стимавляет. Скорострельность показан как относительное изменение интенсивности, которая является расхода топлива по отношению к вычитается спонтанной активности. B) латентного ответ Популяция 11 л и 13 м-Alt ПШ от 7 записанных пчел. В каждом пчелы ПНС с обеих путей были записаны одновременно. Задержка ответа население показывает убывающую задержки с увеличением концентрации запаха в ПШ с обеих путей. Наступление ответ запах на антенн на 99 мсек был записан с помощью electroantennograms и вычитается из задержек реагирования PN. Обратите внимание, что при самых низких концентрациях ответы слишком слабы для задержки измерений и, следовательно, были исключены ответ С) населения. Скорострельность от тех же сетей портов, как в В. С увеличением концентрации запаха сила ответ ростом. Л-ALT показывает более сильную силу отклика. В B, C среднее и SD даны.

Рисунок 6. Сравнение активности населения на двух последующих этапах обработки вдоль обонятельного пути медоносных пчел в. Были данные, записанные в 20 животных, которые были стимулированных 1-гексанола и 2-октанон. A) Каждая строка представляет ложное цветовую маркировку средняя скорость стрельбы из одной проекции нейрон (PN), который рассчитывается по 10 запахов повторений 1-гексанола. Запах презентация начинается в момент времени 0 и длился три секунды. Б) показывает то же самое, что и в А), но для тела гриба внешних нейронов (EN). Матрица показано в позиции А) можно рассматривать в качестве вектора населения PN во запаха стимуляции 1-гексанола. Мы рассчитали такой же вектора населения во запаха стимуляции 2-октанон и используются оба вектора в главных компонент (PCA) сохраняя временную размерность. C) Первые три главные компоненты (PC1, 2 и 3) былизаговор против друг друга, чтобы проиллюстрировать отделение запах в ансамбле деятельности PN на усиков выходе лепестков. Время до запаха начала отмечен черным цветом. Активность в течение трех секунд стимуляции 1-гексанола показаны синим цветом. Деятельность во время стимуляции с 2-октанол отображается красным цветом. Кроме того, мы покажем 1,5 секунды (Post) своей деятельности после запахом множества 1-гексанола (светло-голубой) и 2-octanonen (розовый). Обратите внимание, что в ансамбле уровне PN, оба запахи, вызывающие очень четкие траектории поселиться в "неподвижной точки", которые дольше, чем весь период запах стимуляция. Только после запаха смещение траектории вернуться к базовой деятельности без запаха стимуляции. D) То же анализ был проведен в EN ансамбля уровне, представляющего активность на выходе гриб тела. По сравнению с PN деятельности запахи вызывают меньше четкую траекторию. Кроме того "фиксированная точка" не наблюдается. Первоначально запах индуцированные траектории инrmingle с базовой деятельности хотя запах по-прежнему присутствует. Только запах смещение вызвало дополнительный траекторию.

. Фильм 1 Время решен оценку запах индуцированной траектории после анализа главных компонент вектора PN-населения (слева) и населения вектора EN. (справа;. ф Рисунок 6) Верхние части включают первый из трех основных компонентов (PC1, 2 и 3) нанесены друг на друга. Нижние панели иллюстрируют оценку PC1, 2 и 3 с течением времени. Запах стимуляции отмечен серой панели. Все панели были синхронизированы. Обратите внимание, что население активность EN начинается немного раньше деятельности населения PN, это явление, которое, кажется, contraintuitive но может быть объяснено связи и свойств входящих в них слоев, который обсуждали ранее ^1.

Discussion

В этой статье показано производство и использование специально созданных многоканальных микро проволочных электродов. Описанные электроды подходят для записи как единое целое и активность населения, что особенно полезно для задержки измерений и других временных свойств реагирования различных нейронов и различных neuropils в пределах одного образца (подробнее см. ^1,2,25). Кроме того, мы показали, как постоянно осуществлять микро проволочных электродов, чтобы стабильные долгосрочные записи в себя пчел, которые длятся в течение нескольких часов до суток.

Внеклеточные многоквартирных записи стал благоприятным инструментом для достижения высокой временное разрешение в сочетании с пространственной информацией. В нашем случае, это либо параллельные нейронные тракты ² или два разных neuropils ^1. Несколько нейроны могут быть записаны и проанализированы на одном уровне нейронов параллельно и на высоким временным разрешением. Нескольких аппаратов записьIngs были впервые применены в млекопитающих ^38, а затем и у насекомых ^{39 - 41.} Существенный прогресс был достигнут с развитием и совершенствованием внеклеточных методов записи многоканальных ^42,43. Это, например, включает в себя разработку новых электродов ⁴⁴ или новых шип сортировки и кластеризации алгоритмов ^45. Общие методы внеклеточных методов записи многоквартирных хорошо описываются ^{46 - 48.} С собственной встроенной электродам, показанным в этом видео дополнительно могут быть адаптированы, добавляя больше микропроводов на электроде или микро провода могут быть скручены, чтобы получить измеримых постоянные расстояния между кончиками. Обе процедуры, однако, привести к снижению гибкости и увеличением толщины электрода.

По сравнению с зондов кремния, обычно используемых для внеклеточных записи в гораздо больших насекомых, как ястреб моли, саранчи и тараканов ^{40,49 - 51} описанные микро проволочные электроды имеют меньшие размеры, гибкий и легко могут справиться с потенциальными движений мозга и, таким образом, может быть надежно использован в малых социальных насекомых, таких как пчелы и муравьи, которые показывают намного более широкий поведенческий репертуар. Большинство силиконовые зонды имеют острые хвостовик как структуры режущих аксоны и нервную ткань вдоль их вставки канала, в то время как описанные микро провода круглые, гибкие и меньше и, следовательно, менее вредны для окружающей ткани, которая является явным преимуществом, если цель состоит в изучении долго срок пластичность в здоровом и ведет себя животное. Еще одно преимущество микро проволочных электродов является их низкая себестоимость и простота в использовании. Вместо того, чтобы тщательно очистки дорогой силиконовый зонд электродные проволоки свежесрезанных перед введением головного мозга и, следовательно, отсутствие проблем перегрузки. Кроме того, можно использовать более одного микро проволочного электрода в том же препарате или вставленной в различных neuropiles ¹ Oг участки ^2, как мы показываем здесь. Этот подход особенно благоприятен для анализа и сравнения временные аспекты, как задержки реагирования и взаимодействия при различных нервных уровней обработки.

Мы отдаем себе отчет в том, что внеклеточный записанный сигнал не отражает деятельность одной клетки сами по себе. Это всегда соединение активности напряжения вокруг наконечника электрода. Чтобы определить источник сигнала разность двух соседних микроканалов проволоки внутри одного электрода всегда компьютерной. Таким образом, источником для шип сигналов, используемых для извлечения блока деятельность одного всегда были очень близко к любой из них или другого канала электрода, в результате чего легко различимых шип сигналов. Сигналы от дальше, как мышечной активности или активности соседних neuropils, достигают оба электрода в то же время, напоминающей аналогичные формы и амплитуды и будет отброшен этой процедурой. Используя соответствующий шаблон технику Spike2,мы уверены, чтобы получить единичную активность, которая является не то же самое, но очень близко к одной нейронной активности. Тем не менее, вопрос о шип сортировки можно было бы избежать с помощью внутриклеточных методы записи.

Единичных клеток записи с либо резких электродов или патч-пипеток позволяют углубленное знание о физиологических свойств одного нейрона. Однако из-за небольшого размера нейронов насекомых и их невриты (например., Менее 1 мкм для пчел ПШ ⁵²⁾ только краткосрочные записи являются управляемыми. Кроме того, внутриклеточных записей может быть агрессивным и может повредить ячейки, которая, возможно, еще одна причина для временных ограничений. IN VIVO внутриклеточных записей в насекомых редко дольше одного часа. Временное окно, которое было достаточно для пионерской работы Мартина Молот ^53, который записал внутриклеточные из одного идентифицированного нейрона, брюшной непарного maxilar нейрона # 1 (VUMmx1). Он мог лчернила свою деятельность непосредственно на вознаграждение пути. Юлиане Mauelshagen ⁵⁴ зарегистрировано внутриклеточно активность идентифицированного тела гриба внешней нейрона, pedunculus внешняя нейрон № 1 (PE1) во время классического обусловливания. То же нейрон был в центре внимания Менцеля и Манц ^55, когда они нашли LTP после электрической стимуляции Kenyon клеток. Тем не менее, Окада и его коллеги ⁵⁶ может использовать внутри клетки хорошо охарактеризованы пики шаблон (двойные и тройные шипы) для идентификации PE1 во внеклеточных записи. Ведь сочетание обоих методов, внутриклеточных записей из выявленных нейронов и внеклеточных долгосрочных записей может быть мощным инструментом для дальнейших исследований.

Однако, используя острые электроды для записи нескольких ячеек (единиц) одновременно на различных уровнях обработки в течение многих часов до дней, чтобы проанализировать их временные соотношения реагирования и / или даже пластиковые изменений япрактически невозможно.

С первым визуализации кальция подходов в пчел ^57,58 помощью кальция чувствительных красителей анализ пространственных структур ответов запаха были доступны ^{59 - 62.} Тем не менее, во многих случаях кальция чувствительные красители должны быть введены в мозговой ткани через инвазивных манипуляций, которые снова ограничивают продолжительность жизни пчелы и внутренние свойства анализируемых клеток. Этот вопрос преодоления в других модельных организмов как fruitfly использованием генетически введенные датчики кальция ^63,64. Однако, в общем, датчики кальция может вводить другие ограничения, поскольку они могут выступать в качестве буферов кальция, которые, вероятно, влияют на временные свойства реакций запах. Одновременные внутриклеточных записей в сочетании с изображениями кальция или вычислительных подходов может оказаться надлежащее временное разрешение изображений обрабатывает ^65,66. Тем не менее, временное разрешение самого процесса формирования изображения является стремительныйг ограничено. Оптические системы сбора обычно используют ПЗС-изображений с временным разрешением 5-20 Гц ^67, хотя 2-Фотон-Imaging могли бы приобрести более быстрые последовательности ^68. Однако увеличение частоты дискретизации всегда идет вместе с потерей в пространственным разрешением. Кроме того кальциевые чувствительных красителей, используемых в медоносной пчелы пройти отбеливание, которая также сокращает время сбора ^69.

По сравнению с другими физиологическими методами записи в насекомых наши гибкие многоканальные микро-проволочные электроды гарантируют долгий времени доступ к одной единице и нейронной активности населения в себя пчел.

Мы показали, как использовать два из этих электродов на различных этапах обработки в того же животного, что облегчает анализ временных аспектов кодирования между различными сайтов записи. В зависимости от задачи исследования и модели насекомых основного метода электрода здания продемонстрировали здесь легко расширитьсостоянии и / или могут быть адаптированы. Например, это возможно использовать более трех отдельных проводов производить многоканальные электродов. Кроме того, количество сайтов записи может быть продлен и наблюдая временные аспекты более двух путей или neuropils возможно. Мы надеемся, что этот метод будет вдохновлять многих ученых и внесет позитивный вклад в понимание сложной нейронной обработки в небольших мозгов.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Парафиновое масло	Fluka	76235
Ароматизаторы	Sigma Aldrich
PBS			pH 7,2
4% формальдегид	ThermoScientific	28908	без метанола
Triton X	BioChemica	A1388
метилсалицилат	Roth	4529,1
тетраметилродамина декстран, 10 000 МВт (микрорубин)	Invitrogen	D7162	keep dark
Alexa 488 гидразид	Invitrogen	A-10436	keep dark
Alexa 568 гидразид	Invitrogen	A-10437	keep dark
Bee Ringer Solution	см. Brill et al.2
Медная проволока с полиуретановым покрытием	Elektrisola	15 µ m диаметр & Утеплитель
Стоматологический воск	Densply Detrey	64103015S1	умеренная температура плавления
Стоматологический воск	Flexaponal	124-202-00	Низкоплавкий воск
KWIK SIl	WPI	03L 18-контактная
головка	Conrad Electronic	189634-62
Клей горячего плавления	Conrad Electronic	827673
Игла для пайки	Conrad Electronics	830283	12 В
Наконечник для пайки	Conrad Electronic	531901
Glaselectrodes	WPI	1B100F-3
Миниатюрные булавки	Fine Science Tools	26002-20	V2A 0,2 x 12 мм
Переключаемый модуль подключения пульта	Tucer Davis Technologies	SH16
Модуль подключения пульта	NPI	INT-03M
Модуль усилителя	NPI	PDA-2F
Платы сбора данных	National Instruments	NI-6123, Ni-6143
Программное обеспечение для сбора данных	National Instruments	Lab View 8.2	по индивидуальному заказу
Spike-Sorting	CED	Spike 2 v7.11
Matlab	Mathworks	R2008B
Микроманипулятор	Leitz		инструкция
AG-провода	WPI	AGT05100
Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп	Leica	TCS SP2 AOBS
AMIRA	Mercury Computer Systems	05.02.2000