Живая съемка<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Личиночные нейробласты

Краткое содержание

Этот протокол детали обтекаемый метод, используемый для проведения изображений живых клеток в контексте интактной личиночной мозга. Подходы изображений живых клеток имеют неоценимое значение для изучения асимметричных делений нейронных стволовых клеток, а также других нейрогенных и развития процессов, последовательно раскрывая механизмы, которые ранее были замечены.

Аннотация

Стволовые клетки делятся асимметрично для создания двух потомство клеток с неравной судьба потенциала: в самообновляющейся стволовых клеток и дифференциации клетки. Учитывая их актуальность для развития и болезни, понимание механизмов, которые регулируют деление асимметричный стволовых клеток была надежной областью исследования. Потому что они генетически послушный и пройти последовательных раундов деления клеток примерно раз каждый час, стволовые клетки Drosophila центральной нервной системы, или нейробластах, являются незаменимыми моделями для изучения деления стволовых клеток. Около 100 нервные стволовые клетки находятся вблизи поверхности каждого из двух личинок долей головного мозга, что делает эту модель система особенно полезна для живых изображений микроскопических исследований. В этой работе мы рассмотрим несколько подходов, широко используемые для визуализации стволовых клеток подразделения, и мы обращаемся относительные преимущества и недостатки этих методов, которые используют диссоциированных против здоровых тканей мозга. Мы также подробно наш simplifIED протокол, используемый для эксплантата целые мозги от третьего возраста личинок для изображений живых клеток и приложений фиксированных анализа.

Введение

Стволовые клетки поддерживать баланс дифференциации и самообновление генерировать сотовой разнообразие во время раннего развития и заменить поврежденные клетки во взрослых тканях. Регулирование этого гомеостаза предотвращает как потери и над-расширение популяции стволовых клеток, что может привести к вредным дегенерации тканей или опухолей.

Нейробластов (NBS) являются широко изучены нервные стволовые клетки Drosophila центральной нервной системы (рис. 1А), что первые формы во время эмбриональных стадий ^{1, 2.} NBs пройти неоднократные вспышки асимметричных клеточных делений (ACD) для получения двух неравномерно суждено клетки: самообновлению стволовых клеток и дифференциации клеток. ACD руководствуется центросомах, не-мембранных органелл, которые действуют как микротрубочки организующих центрах большинства клеток ^3. Во время митоза, NB центросомы организовать и ориентировать биполярного митотическое веретено вдоль апикально-базальной полярнаяОсь ность. При отщеплении разделяющей NB, верхушечные судьба детерминанты, определяющие судьбу стволовых клеток и базальных судьба детерминанты, определяющие дифференциацию, выделяются в неравных дочерних клеток.

В личиночной центральной мозга, два типа NBs можно отличить по их числу, должность, выражения фактора транскрипции, и клеточной линии (рис. 1А) ^4-6. Тип I NBs являются наиболее распространенными, и около 90 из них заполнить переднюю и заднюю стороны каждого зрительного доли головного мозга ^7. Эти NBs выразить транскрипционный фактор Asense (ASE), и они характерно разделить на одной самообновляющейся NB и один меньше ганглий материнская клетка (GMC; рис. 1В). Каждый GMC подвергается одной дивизии терминала генерировать два нейрона или глии (рис. 1b). В отличие от этого, НБС восемь Type II, которые населяют заднюю сторону каждой оптической доле хватает ASE выражение ^5. Они проходят ACDДля производства одного самообновлению NB и один промежуточный нейронной прародителя (ИЯФ).

ИЯФ, в свою очередь, делит асимметрично три-пять раз. Каждый из этих отделов приводит к регенерации ИЯФ и производства одного GMC ^4. В совокупности конкретных идентичность NB и временной порядок GMC рождения приводит к поразительному разнообразию нейронов взрослого центральной нервной системы.

Понимание клеточной биологии, что лежит в основе NB ACD была значительно улучшена за счет использования живых методов визуализации клеток. Опубликованные протоколы, используемые исследователями к фото живых NBs варьироваться в широких пределах. В целом, однако, эти методы могут быть сгруппированы в две основные категории, отличающихся личиночной мозг остается ли нетронутыми или механически диссоциируют. Оба метода имеют свои преимущества и недостатки в зависимости от применения исследователя.

Ранние сообщения, раскрывающие живой NB клеток DIVIsions подразумевают некоторую степень ручного диссоциации личиночной мозга. Эти протоколы деталь размазывая ⁸ или дразнить друг от друга ⁹ мозг, чтобы расти краткосрочные первичных культур НБС на покровные стекла. Для улучшения визуализации, круглые NBs обычно сжатая с покровные с либо стеклах ⁸ или геле колодки ^9. Хотя уплощенных клеток улучшили оптику, эти методы часто приводят к NB митотических дефектов, в том числе регрессии щели расхождения и невозможности разделить более чем один раз. Таким образом, протоколы, связанные как ручной диссоциации и физическое искажение личиночной мозговой ткани, как правило, только подходит для очень краткосрочные (т.е.., Один клеточный цикл или меньше) приложения. Кроме того, полу-недопустимыми или полностью уплощение неповрежденные мозги между стеклах и покровные ограничивает время можно потратить с изображениями данного образца к примерно 30-минутного периода ^10. Несмотря на это ограничение, Тхис подход успешно используется ^11-14.

Недавние усилия, чтобы жить изображений в отрыве предел NBS физическое искажение изолированных клеток. Эти методы особенно полезны для приложений, где необходимо поддерживать клеточных культур для нескольких циклов деления клеток. Например, диспергированные клетки из диссоциированных вручную мозга может быть частично встроен в сгусток, изготовленного из смеси фибриногена и тромбина ¹⁵ для долгосрочного изображений ^16. Кроме того, эксплантированной мозг может быть сначала химически диссоциирует с ферментом коллагеназой, следующий вручную путем многократного нарушенного прохождении через концом пипетки, а затем высевали на поли-L-лизин покрытием со стеклянным дном блюда ^{17, 18.} Покрытие стеклянной посуды либо фибриногена или поли-L-лизина способствует прикреплению и небольшое распространение круглых клеток, в результате чего их как можно ближе к покровным как можно без больших физических искажений. В дополнительна эти способы включают культивирование НБС в среде, которая может быть легко обменены на фармакологических экспериментов возмущений ^18. В целом, непосредственно покрытие разошлись NBs улучшает изображений оптики без ущерба для долгосрочных возможности визуализации. В последнее время это протокол, описывающий долгосрочную культивирование диссоциированном NBs был подробно описан ^19.

Однако этот подход не лишен ограничений. Есть несколько предостережений, чтобы изображений живых разложенных NBs. В поле диспергированных клеток, например, трудно определить конкретные NB клоны, которые пространственно организованных в интактном мозге ^1. Кроме того, различия типа я против Тип NBS II в рамках диссоциированном ткани также представляет значительную проблему без выражения клона индикаторов или подтипа конкретных трансгенов, таких как worniu-GAL4, asense-GAL80 ^20. Хотя эти трансгены весьма полезны для некоторых применений, они ограничивают исследователей тех трансгенов экспрессуют под контролем энхансера UAS элемента ²¹ и требуют более сложных схем генетические. Исследования, которые касаются пространственного или временного развитие NBs, следовательно, требуют в естественных изображений в контексте интактной ткани.

Более того, исследования диссоциированных эмбриональных NBs показывают, что физический контакт соседних клеток имеет решающее значение для интерфаза локализация ключевых полярности детерминанты ^{22, 23.} Эти исследования показывают, полностью изолированы NBs больше не поддерживать инвариант ось митотического веретена. Вместо этого, эти клетки отображать более рандомизированных оси шпинделя и широкие углы разделения между последовательными почек GMC, возможно, связано с потерей апикальной центросом позиционирования ^22. Хотя отношения между личиночной NBs и их соседних клеток не была изучена, стоит учесть, что личинок микросреда стволовых клеток может посягать на клеточной полярности или другихповедения. Для поддержания физиологического контекст личиночной NBs, мы изображение ACD из цельных мозгов.

Учитывая присущие ограничения, связанные с изображениями в отрыве NBs, наша лаборатория и другие разработали протоколы для изображения последовательных раундов NB ACD из целых личинок мозгов. Методы к изображению мозга интактных часто заменять жесткой поверхности стекла на одной стороне культуральной камере с гибкой мембраны, чтобы предотвратить искажение ткани или повреждений и позволяют для газообмена. Некоторые способы включают монтажа эксплантированной мозги в смеси с насекомыми культивирования среды, сыворотка, и аскорбиновой кислоты с жиром органов, выделенных из десять личинок ^24. Выделенные жира тела добавляются, потому что они выделяют митоген известно, стимулирует NB деление клеток ^25. Этот протокол сохраняет целостность ткани свыше 3 часов, а, следовательно, поддаются долгосрочному изображений ^{24, 26-28.} В последнее время это протокол, описывающий долготаг-термин изображений интактных личинок мозга в присутствии аскорбиновой кислоты, сыворотки и жировых тел была подробно ^29. Важно отметить, что, так как ткань не является ни подвергается ни стопорится, такой подход является менее полезны для приложений, где происходит обмен культивирование среднего (например, исследований наркотиков, immunodepletion и др.).

Наша лаборатория упростил всю подготовку монтирования живых личинок мозгов для долгосрочного изображений ^{30, 31.} Главное преимущество нашего протокола над другими является его простота: наши наблюдения показывают, ни сыворотку, аскорбиновую кислоту, инсулин, ни жира тела являются необходимые добавки к фото последовательных раундов NB ACD. Хотя добавки, такие как инсулин, были полезны для длительного визуализации стволовых клеточных делений ³² и коллективной миграции клеток в дрозофилы яичников ^33, они, кажется, безразличен для NB ACD, как наш изображений среда состоит из простой смеси станцийndard насекомое культивирования клеток, дополненной антибиотика-противогрибкового для предотвращения загрязнения. Благодаря использованию многоразовых газопроницаемой или стеклянным дном чашки для культивирования, мы были в состоянии выдержать несколько раундов последовательных NB ACDS. Те же образцы эксплантированной легко может быть использован для иммунофлуоресценции и других процедур с фиксированной ткани. В этом протоколе, мы подробно рассечение интактных личинок мозгов, а также подготовка мозги как для живой и фиксированной анализа.

Протокол

1. Подготовка материалов для эксплантата третьего возраста личинок Brains

1. Подготовьте инструменты, необходимые для микродиссекции.
   1. Кузница два рассекает инструменты (скальпель и крюк), разместив один рассекает штифт в каждого держателя контактный. Закрепите флажки плотно вручную или с помощью плоскогубцев (рис. 1в).
   2. Используйте пару старых щипцов согнуть одну рассекает штифт к примерно 120 углом °. Сделайте это при вскрытии микроскопом, чтобы убедиться, что верхняя половина штифта находится квартира, когда держатель штифт в руке. Этот инструмент будет использоваться в качестве скальпелем провести вниз или срез через ткань.
   3. Используйте пару старых щипцов согнуть второй палец в крюк, который будет использоваться для хранения и соскрести ткани.
   4. Обложка каждого рассекает инструмент с кончика пипетки, чтобы защитить инструмент от повреждений. С осторожностью, хорошо сформированные инструменты могут быть использованы для рассечения до бесконечности. Замените поврежденные или деформированные флажки по мере необходимости.
2. Подготовка рассекает среду.
   1. В капот культуры ткани, разбавить антибиотик противогрибкового дополнение в культивирования среды в Шнайдера. Вихревой СМИ включить дополнение.
   2. Подготовьте несколько 5 мл аликвоты дополненных средствами массовой информации. Храните все средства массовой информации при 4 ° С до готовности к использованию.
   3. Теплый в 5 мл аликвоты дополненной среде до комнатной температуры. Нарисуйте среду в стерильный 5 мл шприц и винт на стерильной шприцевой фильтр 0,2 мкм.
3. Выберите личинок для вскрытия. Используйте рассекает зонд для выбора ползком третий личинок Instar как мозг будет легче анализировать. Дополнительно: депозит личинки на виноград агаром.
   Примечание: Не используйте чрезмерно переполненные флаконы или бутылки с «мокрой пищи", как они, как правило, чтобы заставить вторую или первую личинок возраста в выползти преждевременно.
   Примечание: Некоторые генетические фоны потребует использования более молодых личинок. Это не влияет на протокол, но сделать дissection сложнее.

2. Рассечение центральной нервной системы

1. На одном стекле, создать два 50 мл пулы теплых рассекая сред, разделенных примерно на 3 см.. Один бассейн будет использоваться для валового вскрытия и других, используемых для тонкой вскрытия (рис. 1в).
2. Передавать несколько личинок к одному из капель информации.
3. Перемещение покровное с личинок вскрытии микроскопом. Увеличить в бассейне, содержащей личинки такое, что передняя и задняя концы личинок заметны.
4. Используйте пары щипцов понять середине область одной личинки. Возьмите вторую пару щипцов, с другой стороны и понять личинку близко к той же области. Потяните две пары щипцов на части, чтобы аккуратно оторвать личинку в два раза. Повторите эти два шага для всех личинок на покровное.
5. Утилизировать задних половин тела личинки, переводя их в ткани.
6. Осмотрите личинки так, чтобы йе передние mouthhooks четко видны. Используйте обе пары щипцов для создания небольшой разрез, или вырез, на противоположных сторонах личиночной mouthhooks между третьим грудной и первых передних зубец полос.
7. Возьмитесь за mouthhooks пинцетом в не доминантной рукой. Используйте пинцет в другой стороны, чтобы мягко удаляйте кутикулу в направлении вперед-назад на-задней. Продолжайте медленно удаляйте кутикулу, пока центральная нервная система не подвергается.
8. Изолируйте на центральную нервную систему от остальной части личинки на разрыв тканей с щипцами. Будьте осторожны, чтобы не нарушить на центральную нервную систему.
   Критический шаг: Не тащить на центральную нервную систему! Откажитесь поврежденные образцы с разорванной брюшной нервной (рис. 2А) или искаженных оптических долях (рис. 2В и 2В ").
9. Повторите эти два шага для всех личинок на покровное. Перенести здоровый эксплантированной ткани, чтобыВторой (чистый) бассейн среды на покровное для тонкой стадии вскрытия.
10. Используйте вскрытие контактов инструменты, чтобы убрать периферических тканей (например, глазные, крыло, и ног дисков) от мозга. Вставьте скальпель между хотел (мозга) и нежелательного ткани, прижав соединительной ткани в покровного стекла. Используйте крюк, чтобы мягко дразнить от нежелательного ткани, одновременно нажав скальпель, чтобы покровное древесными как движений.
11. Критический шаг: Работа медленно и сознательно, чтобы извлечь все диски из каждого мозга. Будьте осторожны, чтобы не нарушить морфологию мозга. Здоровый мозг будет иметь неповрежденный брюшной нервной и симметрично, круглые оптические доли (рис. 2в).

3. Монтаж эксплантированных Мозги для живых изображений

1. Переверните 50 мм газопроницаемую культуры блюдо с прозрачной пленкой вверх (рис. 2, г). Нажмите шприц для нанесения небольшую каплю (около 30 мкл) среды на тон центр блюда.
2. Перенесите отдельные мозги, по одному за раз, к падению среды на блюдо. Используйте инструмент крюк, чтобы зачерпнуть мозг под зрительных долях. Также можно использовать щипцы понять аксоны выступающие из брюшной нервной мозга.
3. Соберите 5-10 мозги в капле среды. Submerge мозги с помощью вскрытие выводов инструментов толкать отдельные мозги, чтобы в нижней части капли среде, как многие из них будут в ловушке у мениска (рис. 2Е).
4. Расположите мозги с помощью вскрытие контактов инструменты для выравнивания мозги в зависимости от NBs для включения в образ (рис. 3А). Для изображения спинной НБС, разместить брюшной нервной вниз (вдоль мембраны). Чтобы изображение на anterio-вентральной НБС, разместить мозги с брюшной нервной стороной вверх (по направлению от мембраны). Совместите мозги так, чтобы все брюшные нервные стволы указывают в том же направлении в плоскости ху.
5. С помощью шприца или пластиковую передачи рipette разместить 4 галоидуглерода (HC) капель масла (около 30 мкл каждый) на мембрану газа. Объем каждой капли масла должны быть эквивалентны друг другу и каплю среды. Космические капель масла, чтобы соответствовать четырем углам покровным центром вокруг капли культивирования среды. После завершения пять капель (четыре капли масла и одну каплю среды в центре) будет напоминать пять граней на западном стиле кости (рис. 3В).
6. Опустите # 1.5 22 мм покровное на сборке, так что она попадает все 5 капель в то же время. Поддержание равномерное давление по всей образцов снижает вероятность, что они будут нарушены. Подождите около 3 мин, как масло и среднего разгона под весом покровного стекла. Кросс-образную форму носителя будет образовывать (цифры 3С и 3D).
7. Критический шаг: Опустите покровное на поверхность мозга путем удаления избытка СМИ использовании тонкой бумаги фитиль (FIGUповторно 3C). Сделайте это во время просмотра образца под рассекает сферу. Как СМИ удаляется, покровное снизит. Стоп раз покровное касается мозги. Не более-фитиль, так как это вызовет искажения ткани или мозга взрывы.
8. Если изображения спинной NBS (Рисунок 3E), переходите к шагу 3.9. Если визуализации anterio-вентральной НБС, покровное должны быть немного смещены (осторожно подталкивая его пинцетом) в направлении вентральной советы нерва мозга. Это заставляет мозг вращаться, который приносит долей головного мозга в непосредственном контакте с покровным для облегчения визуализации (рис. 3F).
9. Уплотнение камеры на окружающий покровное с небольшими количествами фторо-углеродное масло (рис. 3D). Излишки масла сочилась из покровного стекла должны быть сведены к минимуму и смыл прочь с ткани.

4. Живая съемка Central Brain нейробласты

Примечание: Для этой работы, Nikon Eclipse Ti прядильно-дискконфокальной микроскопии (Инвертированный микроскоп) был использован для живого изображения; Подробная информация о нашей установке были ранее опубликованы ^31. Кроме того, образец может быть отображены с помощью вертикально системы.

1. Добавить каплю иммерсионного масла для покровного стекла чуть выше установленных мозгов. Это поможет центру цели непосредственно над образцом.
2. Критический шаг: Поддержание мозги при постоянной температуре 25 ° С с этапа инкубатора. Аккуратно поместите установленный образец в стадии инкубатора и самого камеру вместе с крышкой.
3. Найдите центральные NBs мозга с помощью проходящего света, сосредоточив внимание на крупных, круглых клеток, которые находятся в центральных и медиальных областях зрительных долей, не используйте эпи-флуоресценции. Это становится легче с практикой. Это очень важно подвергнуть образец с наименьшим количеством света, насколько это возможно. Не тратьте мозги визуализации времени, которые были повреждены.
4. Как только на месте, принимать быстрые воздействия с помощью конфокальной копределить правильное место и глубину. Ограничьте глубину до первого 10-15 мкм. Отрегулируйте при необходимости, и взять другой тестового изображения.
   1. Необязательный шаг: Соберите тестовый фильм брюшной нервной обеспечить нет ху дрейф. Если дрейф обнаруживается, подождите 15-30 минут для образца, чтобы обосноваться. Если дрейф не оседает в 30 мин, подготовить новый образец. Основные дрейф обычно можно проследить до того избытка нефти, или неравное размер капель масла в процессе монтажа.
5. Для устранения осевого дрейф (г-дрейф) использовать непрерывную автоматическую фокусировку устройство, которое использует инфракрасный светодиод. Кроме того, вручную исправить в фокальной плоскости.
6. После того, как NB интерес идентифицируется, продолжить режим визуализации. Как и во всех живых клеток изображений, количество лазерного света, время экспозиции, камеры биннинга, объективного увеличения, времени и / или г-ступенчатой ​​интервала все должны быть эмпирически оптимизированы для конкретного эксперимента, чтобы ответить на вопрос, под рукой. Цель состоит в том, чтобы свести к минимуму световое плотинувозраст, все еще собирая полезные данные. См. обсуждение для дополнительных указаний.
   1. Изображение весь объем НБ путем сбора 12-14 фотографий расположенные на 1 мкм оси. Настройте разрешение времени, чтобы захватить один или несколько циклов клеточные одного и того же NB. В качестве общей рекомендации, использовать 10-30 сек интервалы для одного изображения клеточного цикла и 1-3 минутные интервалы для нескольких клеточных циклов.
7. Критический шаг: Убедитесь, что образец является здоровым путем мониторинга продолжительность митоза. Если митоза занимает более 15 минут, перейти на другой мозг. Здоровый мозг покажет много NBs в том же поле зрения проходит несколько раундов митоза. Заметим, что каждый клеточный цикл немного длиннее, чем предыдущий из-за легкого повреждения.
8. После того, как изображения завершена, разбирать инкубационный камеру, и отбросить все, кроме газопроницаемыми культивирования блюд. Промыть поверхность культуральной чашке с 95%-ным этанолом и хорошо протереть ткани. Повторите еще два раза.

5. Подготовка Мозги для иммунофлуоресценции

1. Сбор 20 или более эксплантированной мозги в 1,5 мл пробирку, содержащую приблизительно 0,2 мл дополненной среде.
2. Удаление среды из трубки и промыть мозги раз с 0,5 мл PBSTx (забуференный фосфатом физиологический раствор, ЗФР с 0,3% тритона Х-100). Пусть мозги оседают на дне пробирки между всеми обмена жидкости. Triton X-100 моющее средство используется для проницаемыми ткани. Промывка обычно занимает менее 30 сек; просто удалите PBSTx раз мозги, собралась на дне пробирки.
3. Замените решение с 0,5 мл 9% электронной микроскопии класса параформальдегиде разведенного в PBSTx. Инкубировать с нутации в течение 15 мин при комнатной температуре.
4. Утилизировать фиксатором в соответствии с правилами опасных отходов.
5. Промыть образцов с 0,5 мл PBSTx течение 15 мин. Повторите шаг мыть пресной PBSTx еще два раза.
6. Заменить раствор с 0,5 мл PBT (PBS, 1% Бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,1% Твин-20). Инкубировать с нутации в течение 1 часа при комнатной температуре. Этот шаг блоки неспецифического связывания антител к ткани.
7. Заменить раствор с 0,5 мл первичным антителом, разведенным в PBT с добавлением 4% нормальной козьей сывороткой (NGS). Выдержите с нутации в течение ночи при 4 ° С.
8. Выбросьте или сохранить разбавленный первичного антитела.
9. Промыть образцов с 0,5 мл PBT течение 15 мин. Повторите шаг мыть пресной PBT еще два раза.
10. Заменить раствор 0,5 мл модифицированной PBT (PBS, 2% BSA, 0,1% Твин-20 и 4% NGS). Инкубировать с нутации в течение 1 часа при комнатной температуре.
11. Заменить раствор с 0,5 мл вторичного антитела, разбавленного в модифицированной PBT. Инкубировать с нутации в течение 2 часов при комнатной температуре.
12. Заменить раствор 0,5 мл PBST (PBS с 0,1% твина-20). Инкубировать с нутации в течение 15 мин при комнатной температуре. Повторите шаг мыть пресной ЗФРТ еще два раза.

6. Монтажные Образцы для иммунофлуоресценции

1. Тщательно передачи образцов в виде капли на предметное стекло, ограничивая падение в направлении слева от центра слайда.
2. Добавить большого перепада (около 2 см в диаметре) из монтажной среды (например, Aqua-Poly/Mount) к центру слайда. Избегайте пул PBST, которое влево.
3. Используйте пинцет для передачи мозги из пула PBST в пул монтажной среды. Добавление монтажную среду непосредственно сверху мозга может нарушить их ориентацию и его следует избегать.
4. Под световым микроскопом, организовать образцов в монтажную среду с той стороны, которая будет изображена вверх.
5. С ползуна под световым микроскопом, медленно опускают # 1,5 покровным стеклом поверх образцов. Необязательный шаг: Выбить незначительные пузырьки воздуха, слегка нажав на покровное.
6. Разрешить гистологическая среда для полимеризации в течение нескольких часов, или на ночь, лежа слайды плоские, светло-защищены, при комнатной температуре.
7. Слайды могут быть отображены на следующий день, или храниться до визуализации.

Результаты

Онлайн визуализация выяснены ряд механизмов, которые регулируют NB ACD. До захвата изображений, необходимо определить оптимальные условия визуализации. Необходимо сбалансировать скорость захвата кадров с продолжительностью изображений живых клеток. Для тонкой клеточной анализа, например, увеличение временного и может потребоваться оптическое разрешение. При визуализации единого NB клеточный цикл (рис. 4А), скорость, с которой изображения будут захвачены может быть увеличена без введения фотоповреждения....

Обсуждение

Изображений живых клеток является бесценным подход, используемый для изучения механизмов, которые регулируют ACD стволовых клеток, дифференцировку клеточных клонов, и морфогенез сложных тканей. Хотя исследовательские группы исторически использовали различные методы, чтобы визуализировать NB ACD, эти подходы в целом можно разделить на две категории, которые, прежде всего, отличаются по отношению к ткани мозга остается ли нетронутыми или в отрыве.

Изображений в отрыве NBs есть свои плюсы. С од...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Чашка для культуры тканей Lumox 50 x 12 мм	Sarstedt	94.6077.410	Многоразовая чашка для культуры с газопроницаемой и оптически прозрачной пленочной основой.
Schneider's S2 Medium	Invitrogen	21720-024
Gibco Антибиотик-антимикотик (100x)	Invitrogen	15240-062	Добавка, содержащая пенициллин (10,000 Ед/мл), стрептомицин (10,000 μ г/мл) и амфотерицин B (25 μ г/мл), который добавляется в среду Schneider S2 для предотвращения бактериального и грибкового загрязнения.
Стеклянные покровные стекла, #1.5 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-541-B
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898	Высоковязкое инертное масло, прозрачное и бесцветное.
Пара никелированных держателей штифтов, длина 17 см	Fine Science Tools	26018-17
Пара щипцов Dumont #5	Fine Science Tools	11252-20
Игла/зонд для препарирования с пластиковой ручкой	Fisher Scientific	08-965-A
Шприц-фильтр, 0.22 μ m размер пор	Fisher Scientific	09-719A
Шприц, 5 мл	BD Biosciences	309646
Пластиковая переводная пипетка	Fisher	Scientific S30467-1
Параформальдегид, 32% EM-класс	Электронная микроскопия Sciences	15714	ВНИМАНИЕ: Формальдегид токсичен; его следует обрабатывать в вытяжном шкафу. Следуйте рекомендациям MSDS по безопасному обращению.
DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид	Invitrogen	D1306	Краситель, который маркирует ДНК и возбуждается ультрафиолетовым светом.

)