Моделирование Астроцитома Патогенез In Vitro И В Vivo Использование кортикальной астроциты или нервные стволовые клетки из условного, генной инженерии мышей

Астроцитомы наиболее распространенной первичной опухоли головного мозга и глиобластомы (GBM), IV астроцитома класса, является наиболее распространенным и агрессивным подтипом при медиане выживаемости 12-15 месяцев ^1,2. Вторжение диффузных астроцитом, в частности GBM, исключает полное хирургическое удаление, ограничивает эффективность адъювантной терапии, и неизбежно приводит к рецидиву после лечения ^3. Пациенты, изначально присутствующие либо с De Novo (первичной) GBM или с более низкими астроцитом класса, что неизбежно прогрессирует в (вторичной) GBM ^4. GBM является геномно неоднородна и характеризуется взаимоисключающих и сопутствующих мутаций в генах, которые регулируют три основных сигнальных путей: G ₁ / S (Rb) клеточного цикла контрольных точек, рецептора тирозинкиназы (RTK), и TP53 дорожками ^5-7. GBM состоит из четырех геномных подтипов с различными профилями экспрессии, которые напоминают различные типы клеток мозга, предполагая, что GBM подтип ВЛИянием его клетки происхождения ^6,8,9. Лучшие модели астроцитома обязаны определить роль конкретных комбинаций мутаций в определенные клеточные типы во астроцитому патогенезе. Используя эти модели для более эффективного развития доклинических наркотиков в конечном итоге поможет улучшить результаты лечения пациентов. Современные модели астроцитома включают установлены клеточные линии человека, пациента происходит ксенотрансплантаты (PDX), генетически модифицированные нормальные человеческие астроциты и нервные стволовые клетки (НСК) и генно-инженерных мышей (GEM) ^10-14. Мы разработали альтернативный, не-зародышевой линии GEM (nGEM) модель ¹⁵ с использованием первичных клеток мозга - коры астроциты и NSC - найденным GEM, несущего различные комбинации floxed онкогенных аллелей. Целью было генерации моделей Астроцитома с генетически определенных клеток, которые могут быть фенотипически характеризующихся как в пробирке и в естественных и потенциально используемых для доклинической разработки лекарственных средств в Immune-компетентные мышей.

Штатные клеточные линии человека являются наиболее часто используется модель патогенеза астроцитому и ответ наркотиков в пробирке и в естественных условиях. Они технически прямо вперед, широко доступны, и определили кинетики и онкогенность на ортотопического ксенотрансплантации в иммунодефицитных мышей ^10,11,16-18 . Их недостатки включают неспособность генерировать установленные клеточные линии из низкосортных астроцитом, ограничивая исследование только к высокой астроцитом; Отсутствие определенной ячейке происхождения; наличие сложных геномных нарушений, часто с геномных профилей, которые заметно отличаются от оригинального образца пациента; и восприимчивость к фенотипической и генотипической дрейфа во серийного культуры в сыворотке ^11,17,19-22. Фенотипические последствия отдельных онкогенных мутаций в установленных клеточных линий человека GBM может маскироваться множества нарушений, которые на самом деле присутствует, которые часто исключает elucidation прямых последствий генотип-фенотип.

PDX генерируются через подкожной прохождения пациентом изолированы клетках астроцитомы в иммунодефицитных мышей или через их культуры как неадгезивных сфероидов в определенном, сыворотки среде до ортотопического инъекции в мозг иммунодефицитных мышей ^12,23. PDX более точно поддерживать геномной ландшафт человека астроцитомы, но аналогично установленных клеточных линий человека, фенотипический эффект отдельных онкогенных мутаций могут быть замаскированы в связи с их геномной сложности ^19,24. Чтобы определить фенотипические последствия конкретных онкогенных мутаций, особенно в ответ на новые методы лечения, панели, установленные клеточных линий или PDX человека часто используются, чтобы установить генотип-фенотип корреляции, показать обобщения, и свести к минимуму вероятность линии конкретных эффектов клеток. В то время как PDX точно воспроизводят гистопатологические признаки человеческой астроцитомы, IncЛУДИНГ вторжение, Ортотопическая ксенотрансплантаты из установленных клеточных линий человека вообще не ^21,23,25. Кроме того, нормальные человеческие астроциты и НСК были генной инженерии с определенными онкогенных мутаций моделировать Астроцитома туморогенез в пробирке и в естественных ^13,14,26. Эти клетки имеют геномную сложность установленных клеточных линий и PDX человека и точно воспроизводят человеческую Астроцитома гистопатологию, но требуют ксенотрансплантации в иммунодефицитных грызунов в естественных условиях. Потому что все модели клеток человека требуют иммунодефицитом грызунов для предотвращения иммунной опосредованного отторжения ксенотрансплантата, эти модели не резюмировать родные опухоли стромы взаимодействия сингенной системы и не имеют интактную иммунную систему, ограничивая доклинические исследования стромы целенаправленной и иммунной-модуляторных виды терапии, ^10,11.

GEM разрешение экспертиза фенотипических последствий заранее определенных комбинаций онкогенного Мутания в естественных условиях в течение на месте туморогенеза. В то время как не-условное GEM есть мутаций внутри всех тканях в течение всего развития, условно GEM уже floxed онкогенные аллели, которые позволяют адресности мутаций путем ограничения Cre-опосредованной рекомбинации определенными типами клеток путем использования типоспецифических промоутеров клеток ^10,11,15,18. Условный астроцитома GEM были использованы для выяснения функциональные роли онкогенных мутаций в различных типах клеток в интактным мозгом ^11. Доклинические полезность на месте gliomagenesis помощью условного GEM ограничивается рядом факторов, включая 1) Отсутствие коррелят в пробирке, 2) трудности в формировании большие когорты мышей со сложными генотипов, 3) с длительным латентным периодом в развитии опухоли Ситу , 4) и стохастического прогрессирование опухоли. Поскольку на месте канцерогенез отсутствует модель, соответствующую в пробирке, тестирование препарата в пробирке не может быть выполнена WIth обычные условные модели GEM. В отличие от других видов рака, условные модели GEM астроцитомы редко, индуцированный отдельных онкогенных мутаций ^11. Таким образом, сложные схемы размножения требуются для создания условного GEM с несколькими онкогенных мутаций. Кроме того, астроцитома инициация происходит с переменной пенетрантностью после длительного латентного в этих моделях, в то время как прогрессирование до высокого астроцитом обычно происходит в неоднородном, стохастического образом и в конечном итоге приводит к опухоли со сложными геномных пейзажей и стремительных кинетики роста ^{27, 28.} Переменная пенетрантность и стохастический характер злокачественной прогрессии в условных моделей GEM требует, чтобы отдельные мышей быть экранированы рентгенографии для обнаружения присутствия и местоположения высокого астроцитом до их зачисления в доклинических испытаний лекарств. Взятые вместе, эти ограничения препятствуют поколения и тестирование крупных когорт условного GEM, необходимое для прeclinical тестирование на наркотики.

GEM система RCAS-тва, которые использует птичьего ретровирусов (Rcas) векторы заразить GEM инженерии выразить вирусный рецептор (TVA) по конкретным нейронных типов клеток, широко используется для моделирования Астроцитома туморогенез ^11. В отличие от условного GEM, эта модель система позволяет введение нескольких онкогенных мутаций в определенных типах клеток без необходимости сложных схем селекции. Тем не менее, она ограничена переменной пенетрантностью, требование для активно делящихся клеток для достижения вирусного интеграции, и случайной вставки трансгенов в геном хозяина ^29.

Номера для зародышевой линии GEM (nGEM) модели, которые используют клетки, полученные из GEM, становятся все более важными, потому что они преодолеть многие из ограничений других модельных систем ^15. Роль инициирования типа клеток и сопутствующих мутаций в астроцитому патогенезе трудно сдерживатьшахта с использованием установленных клеточных линий GBM человека или PDX, потому что они являются производными от терминальной стадии опухоли, которые накопились обширные генетические мутации в неопределенных типов клеток в ходе злокачественной прогрессии. В отличие от этого, все сорта астроцитомы могут быть смоделированы с помощью nGEM путем индукции определяется генетические мутации в определенных очищенных типы клеток мозга ^11,30. Таким образом, влияние специфических генетических мутаций и типа клеток на клеточном и молекулярном фенотипов может быть определена в пробирке и в естественных условиях. Как и в установленных клеточных линий человека GBM, начальная пробирке тестирования на наркотики при помощи nGEM могут быть использованы по приоритетам препараты для тестирования в естественных условиях, использующие одни и те же клетки. Опухолей ин виво может быть определена путем аллотрансплантации nGEM клетки ортотопически в мозг иммунокомпетентных сингенных помета ^30. Эти Ортотопическая модели аллотрансплантатов поэтому позволяют в естественных условиях тестирования не только обычных цитотоксической ай целевой терапии, но иммунная-модуляторный и строме ориентированные виды терапии, а также. И, наконец, роль микроокружения на инициации и прогрессирования опухоли могут быть определены путем сравнения результатов между nGEM и обычные модели GEM с использованием тех же мутации в тех же типах клеток.

Мы и другие разработали Астроцитома nGEM использованием первичных клеток - астроцитов, NSC или клетки-предшественники олигодендроцитов (OPC) - найденным GEM ^30-34. Обоснованием разработке астроцитомой nGEM было создать модель для определения фенотипические последствия онкогенных мутаций в специфические типы клеток, которые потенциально могут быть использованы для доклинических испытаний препарата в пробирке и в естественных в иммунокомпетентных животных. Мы собрали фенотипически WT корковых астроциты и NSC от не-Cre выражающие, условное GEM поддерживается на> 94% C57 / BL6 фоне с floxed РБ пути - Rb1 ^{LoxP / LoxP} или TgGZT121 - и floxed RTK / РАН / PI3K пути - nf1 ^{LoxP / LoxP,} Крас ^G12D, PTEN ^{LoxP / LoxP} - гены в различных комбинациях ^35-39. Мы индуцированной генетической рекомбинации в пробирке с помощью аденовирусные векторы, кодирующие Cre рекомбиназу. Поскольку корковые астроцитов урожаи содержат смесь типов клеток, мы использовали Ad5GFAPCre векторы или доминирующие онкогенные трансгены, такие как TgGZT ₁₂₁ приводится в движение от промотора GFAP человека, для обогащения GFAP ⁺ кортикальных астроцитов в этих культурах. Мы определили фенотипические последствия G ₁ / S (РБ), MAPK, и пути PI3K мутаций в корковых астроциты и НСК в пробирке и в естественных условиях. МАРК и PI3K пути активированные G1 / S-неполноценные астроциты молекулярно передразнил человек пронейральный GBM и, по ортотопического инъекции, образованные опухоли в заранее определенном месте с единых кинетики роста, короткие задержки, и гистологическиеаль отличительными чертами человеческого GBM ^30. Продольный контроль роста опухоли в естественных условиях помогает доклинические испытания препарата через нормализации лечения когорт и количественного анализа роста опухоли в ответ на лечение ^40. Мы определили кинетики роста опухоли по продольной биолюминесценции визуализации мышей, которым вводили люциферазы выражая корковых астроциты. Поэтому корковых астроциты и НСК, полученные из условного GEM обеспечить послушный модельную систему для определения функциональных последствий астроцитомы мутаций, связанных и потенциального модельной системы для доклинической разработки лекарств.

Все исследования на животных были одобрены Университета Северной Каролины Уходу за животными и использованию комитета.

1 Культивирование Кортикальная Астроциты от новорожденных мышей

1. Подготовка
   1. Crumple 2-3 тонких тканей задач и поместить в нижней части колбу, содержащую 70% этанола. Поместите рассекает ножницы, изогнутые щипцы и 2 пары прямых микро щипцов в этой колбе. Ткани используются, чтобы избежать изгиба микро щипцы.
   2. Добавить 1 мл HBSS до 60 мм блюдо культуры ткани. Подготовьте отдельный блюдо для каждого животного и поддерживать блюда на льду.
   3. Обезболить животных на институциональных правил.
   4. Теплый 7 мл среды DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина (полное DMEM) для каждого животного в водяной бане при 37 °. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 5 мышей, шаги 1.1.1-1.1.4 займет ~ 15 мин.
2. Ткань Урожай
   1. Жертвоприношение новорожденных мыши (1-3 день) за institutiOnal правила.
   2. Удалить рассекает ножницы из этанола, позволяют им капать сухие, и сделать сагиттальный разрез в коже над черепа от спинного мозга к носу.
   3. Сделайте надрез в черепе вдоль стреловидного шва, начиная от спинного мозга и расширение мимо обонятельных луковиц. Следите, чтобы кончики ножницами вблизи внутренней поверхности черепа, чтобы свести к минимуму повреждения головного мозга ткани.
   4. Использование изогнутых щипцов, аккуратно чистить каждое полушарие черепа вбок от мозга.
   5. Использование прямых микро щипцы, осторожно зажать от спинной части каждого коркового полушарии и поместите его в блюдо культуры ткани, содержащей HBSS. Позаботьтесь, чтобы избежать мозжечок и обонятельной луковицы. Не берите любую ткань ниже мозолистого тела.
   6. Использование рассекает микроскоп и 2 пары микро щипцы, осторожно удалите мозговые оболочки от каждого коркового полушарии. не Верните блюдо культуры ткани на лед, пока, начиная тканей homogenizatioн.
   7. Повторите шаги 1.2.1 через 1.2.6 для каждого дополнительного животного. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 5 мышей, шаги 1.2.1-1.2.7 займет ~ 30 мин.
3. Ткань усреднении
   1. Используя чистую лезвие, мелко нарезать кубиками корковых полушария и переместить пластину к капот культуры ткани.
   2. Трансфер нарезанный кубиками ткани в стерильный 15 мл коническую трубку. Промыть пластины с 1 мл ледяной ССРХ и передать в пробирку, содержащую ткани.
   3. Подождите, пока ткань не оседает на дне пробирки, затем осторожно удалить избыток HBSS с помощью пипетки.
   4. Добавить 2 мл комнатной температуры трипсина / ЭДТА. Внесите ~ 10x с 1 мл пипетки для дальнейшего отмежеваться клетки.
   5. Инкубируйте клеточной суспензии при 37 ° С в течение 15 - 20 мин. Тщательно перемешать инверсии каждые 5 мин.
   6. Добавить 3 мл полной DMEM ингибировать трипсин. Внесите ~ 10x с 1 мл пипетки для смешивания раствора.
   7. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
   8. Удалитьсупернатант с 1 мл пипетки. Не аспирации среды, потому что осадок может быть потеряно.
   9. Ресуспендируют осадок в 4 мл 37 ° С завершить DMEM. Передача клеточной суспензии до 75 см с завинчивающейся крышкой колбу культуры тканей. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 5 мышей, шаги 1.3.1-1.3.9 займет ~ 50 мин.
   10. Около 16 ч после сбора урожая астроцитов, мыть колбы с 4 мл 37 ° C ССРХ, затем добавить 4 мл 37 ° C завершить DMEM. Поддержание корковых астроцитов при 37 ° С в 5% СО _2. ПРИМЕЧАНИЕ: стадия промывки важна для удаления неадгезивных клеток и мусора с блюдо культуры.
   11. Когда культура ~ 95% сливной, встряхивали в течение ночи при 37 ° С в 5% СО _2, удалить СМИ содержащие отдельные клетки, затем промыть колбу с 4 мл 37 ° C ССРХ. Добавить 4 мл 37 ° C завершить DMEM и поддерживать клетки при 37 ° С в 5% СО _2. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг важен для обогащения культур для корковых астроцитов, как загрязнение микроглии иКлетки-предшественники олигодендроцитов отсоединения с этой процедурой, и удаляются из культуры ^41.
   12. Повторите шаги 1.3.1-1.3.11 для каждого животного.
4. Индукция генетической рекомбинации
   1. 24 часа после завершения шага 1.3.11, заменить жидкость с 2 мл 37 ° C завершить DMEM. Добавьте 1 мл 37 ° C СКМ, содержащие 1 мкл> 10 ¹⁰ БОЕ / мл Ad5CMVCre или Ad5GFAPCre. Выдержите в течение 6 ч при 32 ° С в 5% СО ₂ .CAUTION: Использование BSL2 меры безопасности при обращении с рекомбинантного аденовируса.
   2. Удалить вирус, содержащие медиа и добавьте 37 ° C полной DMEM без вируса корковых астроцитов. ВНИМАНИЕ: Использование BSL2 меры безопасности при обращении с рекомбинантные аденовирусы и выбросьте вируссодержащей диск на институциональных правил. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 5 астроцитов культур, шаги 1.4.1 - 1.4.3 займет ~ 15 мин исключая 6 ч инкубации.
   3. Развернуть корковых культур астроцитов для впробирке и в естественных характеристик. Примечание: определения наличия мутации следующую CRE-рекомбинации с помощью ПЦР с праймерами, специфичными для рекомбинации гена или иммуноблотах либо для конкретного мутантного белка или его последствий сигнализации. Время, необходимое для фенотипической стабилизации корковых культур астроцитов после Cre-рекомбинации будет зависеть от мутаций, используемых и должно быть определено опытным путем (Рисунок 2).

2. Культивирование нервные стволовые клетки из новорожденных мышей

1. Подготовка
   1. Перед началом вскрытия, подготовки 4 мл пищеварения раствора на мозге, добавив 3,1 мг папаин и 1,3 мг цистеин к 4 мл диссоциации среды - 98 мм Na ₂ SO _4, 30 мМ K ₂ SO _4, 5,8 мМ MgCl _2, 0,25 мМ CaCl ₂ , 1 мМ HEPES (от 1 М HEPES рН 7,4 складе) 20 мМ глюкозы, 0,001% фенола красного и 0,125 мМ NaOH. Добавление папаини цистеин диссоциации среде получится желтый раствор.
   2. Инкубировать в 37 ° С на водяной бане в течение 15 мин. Смешайте периодически переворачивая.
   3. Добавить 0,1 М NaOH по каплям, пока пищеварение решение не возвращает зажечь красный цвет.
   4. В капот культуры ткани, стерильный фильтр переваривание решение с использованием шприцевой фильтр (0,22 мкм размер пор). Держите пищеварения решение на льду.
   5. Подготовка 50 мл стволовых клеток среднего (SCM) путем смешивания 44,5 мл НСК базальной среды, 5 мл НСК добавки, 0,5 мл пенициллина-стрептомицина, 50 мкл 0,2% гепарина, 10 мкл 100 мкг / мл EGF, и 10 мкл 100 мкг / мл bFGF. СКМ стабилен в течение 1 недели при хранении при 4 ° С.
   6. Подготовить полное HBSS (cHBSS) путем смешивания 50 мл 10х HBSS, 1,25 мл 1 М HEPES (рН 7,4), 15 мл 1 М Д-глюкоза, 5 мл 100 мМ CaCl _2, 5 мл 100 мМ MgSO _4, и 2 мл 1 М NaHCO _3. Принесите общий объем до 500 мл с DDH ₂ O.
   7. Фильтр стерилизовать cHBSS остроумиеха-фильтр размер 0,2 мкм пор и хранят при температуре 4 ° С.
   8. Crumple 2-3 тонких тканей задач и поместить в нижней части колбу, содержащую 70% этанола. Поместите рассекает ножницы, изогнутые щипцы, и 2 пары прямых микро щипцов в этой колбе. Ткани используются, чтобы избежать изгиба микро щипцы. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 5 мышей, шаги 2.1.1-2.1.8 займет ~ 45 мин.
2. Ткань Урожай
   1. Жертвоприношение новорожденных (день 1-3) мышей на институциональных правил.
   2. Удалить рассекает ножницы из 70% этанола, позволяют им капать сухие, и сделать сагиттальный разрез в коже над черепа от спинного мозга к носу.
   3. Сделайте надрез в черепе вдоль стреловидного шва, начиная от спинного мозга и расширение мимо обонятельных луковиц. Следите, чтобы кончики ножницами вблизи внутренней поверхности черепа, чтобы свести к минимуму повреждения головного мозга ткани.
   4. Использование изогнутых щипцов, аккуратно чистить каждое полушарие черепа с боков отмозг.
   5. Аккуратно удалите весь мозг и место в ледяной cHBSS.
   6. Использование рассечение микроскоп, осторожно удалите мозговые оболочки из мозга с мелкими инструментами рассечение.
   7. Поместите мозг на его нижней поверхности и удалить мозжечок / задний мозг и обонятельной луковицы / лобной коры с вертикальной (корональной) режет с размером 11 скальпелем.
   8. Поверните оставшийся мозг на 90 °, чтобы поместить его на каудальной части, создавая таким образом корональной вид мозга. Найдите боковые желудочки.
   9. Вырежьте кубической раздел, содержащий субвентрикулярной зоне (СВЗ).
   10. Трансфер СВЗ содержащие ткани на 60 мм блюдо культуры ткани с свежим ледяной cHBSS и фарша ткани с размером 11 скальпелем.
   11. Передача Измельченную ткань в стерильную пробирку на 15 мл. Поместите пробирку на льду.
   12. Вымойте Петри с 1-2 мл ледяной cHBSS. Передача промывочного раствора в пробирку, содержащую ткани.
   13. Повторите шаги 2.2.1-2.2.12 с дополнительной neonataл мышей при необходимости. Перенесите все 15 мл пробирок на капот культуры ткани в течение оставшейся части протокола. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 5 мышей, шаги 2.2.1 - 2.2.13 займет ~ 45 мин.
3. Ткань усреднении
   1. Поместите пищеварения решение (полученного на стадии 2.1.1) в водяной бане при 37 ° в течение 5 мин. Кроме того, теплая 2 мл СКМ за мозга в водяной бане при 37 °.
   2. Осторожно удалите супернатант из фарша ткани с 1 мл пипетки. Не аспирации.
   3. Добавить 2 мл 37 ° C пищеварения раствора на 15 мл трубки и аккуратно перемешать переворачиванием.
   4. Инкубировать в 37 ° С на водяной бане в течение 15 мин. Смешайте по инверсии каждые 5 мин.
   5. Добавить еще 2 мл 37 ° С раствору пищеварения в каждую пробирку и повторите шаг 2.3.4.
   6. Разрешить клетки оседают на дне пробирки под действием силы тяжести, а затем удалить супернатант из сброженных ткани с использованием 1 мл пипетки.
   7. Добавить 2 мл 10 мкМ E-64, разведенного в cHBSS и аккуратно перемешать переворачиванием.
   8. Разрешить клетки оседают на дне пробирки под действием силы тяжести, а затем удалить супернатант из сброженных ткани.
   9. Добавьте 1 мл 37 ° C cHBSS и гомогенизации с наконечником в 1 мл пипетки (~ 20 ударов). Избегайте инъекционных пузырьков воздуха в течение ткани гомогенизации.
   10. Проходят тканевого гомогената через ситечко размер пор клеток 40 мкм, затем смойте сетчатый фильтр с 5 мл 37 ° C cHBSS.
   11. Центрифуга тканевого гомогената при 125 х г в течение 5 мин.
   12. Удалить 95% супернатанта с 1 мл пипетки, не нарушая осадок клеток. Тщательно ресуспендируют осадок клеток в 200 мкл 37 ° C СКМ при пипетки 200 мкл.
   13. Добавить 1,8 мл 37 ° C SCM и передачи клеточной суспензии на лунку стерильного 6-луночного планшета. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 5 мышей, шаги 2.3.1-2.3.14 займет ~ 75 мин.
4. Neural стволовых клеток Культура
   1. Пополнять среду после 3-х дней, добавив еще 2 мл 37 °C СКМ.
   2. После 7 дней, передать нейросферы в 15 мл пробирку и пусть нейросферы поселиться под действием силы тяжести в течение> 5 мин.
   3. Удалить супернатант и добавить 2 мл 37 ° C SCM.
   4. Перенесите нейросферы на новый колодец 6-луночного планшета с.
   5. Добавить 2 мл 37 ° C СКМ каждые 3-4 дня, и изменить среду полностью каждые 7 дней.
   6. Если нейросферы> 100 мкм в диаметре, тщательно отделить раствором стволовых клеток диссоциации и replate НСК при желаемой плотности клеток.
5. Индукция генетической рекомбинации
   1. Добавьте 1 мл 37 ° C СКМ, содержащие 1 мкл> 10 ¹⁰ БОЕ / мл Ad5CMVCre или Ad5GFAPCre в 2 мл СКМ в настоящее время на клетки. ВНИМАНИЕ: Использование BSL2 меры безопасности при обращении с рекомбинантного аденовируса.
   2. Инкубировать в течение 6 ч при 32 ° С в 5% СО _2.
   3. Трансфер SCM с нейросферы в 15 мл пробирку и пусть сферы поселиться под действием силы тяжести в течение 5 мин.
   4. Удалить супернатант сначала с 1 мл пипетки, а затем с 200 мкл пипетки. ВНИМАНИЕ: Использование BSL2 меры безопасности при обращении с рекомбинантные аденовирусы и выбросьте вируссодержащей диск на институциональных правил.
   5. Добавить 2 мл 37 ° C СКМ без вируса к НСК, а затем перенести в 6-луночного планшета с. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 5 культур НСК, шаги 2.5.1-2.5.5 займет ~ 15 мин исключая 6 ч инкубации.
   6. На следующий день повторите шаги 2.5.1-2.5.5, затем нейросфера пассажей при необходимости. Сферы теперь может быть расширена за 2-3 проходов до характеризации в пробирке и ортотопического инъекции в мозг мыши в естественных условиях. Примечание: определения наличия мутации следующую CRE-рекомбинации с помощью ПЦР с праймерами, специфичными для рекомбинации гена или иммуноблотах либо для конкретного мутантного белка или его последствий сигнализации. Время, необходимое для стабилизации фенотипической культур NSC после CRE-рекомбинации будет зависетьна мутаций, используемых и должно быть определено эмпирически (фиг.2 и 3).

3 Ортотопическая впрыска рекомбинированных клеток в мозг получателя Iimmunocompetent мышей

1. Получение 5% метилцеллюлозы
   1. Растворить 5 г 15 сП метилцеллюлозы в деионизированной водой до конечного объема 50 мл в 100 мл завинчивающейся крышкой бутылки. Добавьте порошок медленно при перемешивании при 4 ° С для предотвращения образования комков. Это может занимать до 24 часов перемешивания при 4 ° С в течение всего метилцеллюлоза, чтобы ввести раствор.
   2. Взвесьте бутылку и записать вес.
   3. Автоклав 5% растворе метилцеллюлозы. После того, как в автоклаве, метилцеллюлоза станет полутвердые гель.
   4. Взвесьте бутылку и рассчитать вес потерял во время обработки в автоклаве.
   5. Соблюдая правила асептики, добавьте 1 мл стерильной воды на каждый грамм веса потерял.
   6. Поместите на льду и добавляют 50 мл охлажденного льдом 2x DMEM. </ LI>
   7. Смешайте в течение ночи с использованием магнитной мешалки при 4 ° С. С помощью стерильной техники разделить на 5% растворе метилцеллюлозы в 20 мл аликвоты. Храните аликвоты при 4 ° С в течение до шести месяцев или до 2x DMEM истекает. Примечание: Получение 5% раствора метилцеллюлозы в шагах 3.1.1-3.1.7 будет ~ 2,5 дней.
2. Подготовка корковых астроциты для инъекций
   1. Урожай корковых астроциты когда ~ 90% сливающиеся.
   2. Для уборки, аспирата полное DMEM и мыть тарелки с равным объемом 37 ° C ССРХ.
   3. Добавьте достаточно трипсин, чтобы покрыть пластину. Осторожно наклоните и постучите по планшету, пока клетки начинают отделяться.
   4. Деактивировать трипсин с равным объемом 37 ° С завершить DMEM.
   5. Трансфер клетки к 50 мл коническую трубку и мыть тарелку с таким же объемом 37 ° C полной DMEM, используемой в 3.2.4.
   6. Трансфер стирки СМИ в пробирку, содержащую клетки. Центрифуга при 200 х г в течение 3 мин.
   7. Аспирируйте сupernatant и ресуспендирования клеток в 1 мл 37 ° С завершить DMEM.
   8. Количество суспензии клеток с помощью гемоцитометра или другого соответствующего счетчика клеток, чтобы определить количество клеток / мкл.
   9. Передача требуемое количество клеток к новому 15 мл коническую пробирку. Центрифуга при 200 х г в течение 3 мин.
   10. Ресуспендируют клеток в 800 мкл 37 ° C завершить DMEM. Определить объем клеточного осадка (общий объем клеточной суспензии - 800 мкл). ПРИМЕЧАНИЕ: Это необходимо для достижения точной концентрации клеток для инъекций. Таким образом, объем клеточного осадка должен быть определен на этом этапе для того, чтобы рассчитать объем 5% метилцеллюлозы, чтобы добавить в шаге 3.2.12.
   11. Передача клеток в стерильную 1,5 мл микроцентрифужных трубки, а затем центрифугируют при 200g в течение 3 мин.
   12. Аспирируйте супернатант от осадка клеток и ресуспендируют корковых астроцитов в соответствующем объеме охлажденного льдом 5% метилцеллюлозы (желательно общий объем - объемОсадок клеток), чтобы получить нужное количество клеток / мкл.
   13. Поместите клетки на льду до инъекции.
   14. Поместите 250 мкл стеклянный шприц в повторяющуюся антигена Диспенсер затем поместить тупой 18 G иглу на шприц.
   15. Вывод на поршень медленно с иглой в корковой астроцитов ходовой части; будет пузырьков воздуха над клетками, которые должны быть удалены, поскольку пузырьки воздуха будет сжимать и уменьшить объем фактически впрыскивается в головном мозге.
   16. Держите кончик иглы чуть выше коркового астроцитов подвески и толкать поршень в быстро. Воздушный пузырь будет двигаться быстрее, чем суспензии клеток и в основном будет выслан.
   17. Повторите шаг 3.2.16, пока все пузырьки воздуха удаляются из иглы.
   18. Заполните шприц к о ~ 200 мкл, а затем, удерживая иглу и вытяните поршень назад до упора. Маленькие пузырьки воздуха могут быть удалены путем проведения Наконечник иглы вверх и быстро толкает поршень в приблизительно 50 мкл затем медленно снятия на полную мощность.
   19. Держите кончик в вертикальном положении и повторите шаг 3.2.18 4-5x.
   20. Выбросьте иглу 18 калибра и соответствовать 27 G иглу на шприц.
   21. Нажмите кнопку на антиген дозатора до жидкость не будет выливаться из иглы. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 1 линии астроцитов клеток, шаги 3.2.1-3.2.21 займет ~ 60 мин.
3. Подготовка НСК для инъекций
   1. Когда нейросферы> 100 мкм в диаметре, трансфер в 15 мл пробирки и пусть нейросферы поселиться под действием силы тяжести для> 5 мин.
   2. Удалить супернатант и диссоциируют нейросферы с нежным диссоциации реагента, например раствора диссоциации стволовых клеток или Accutase соответствии с инструкциями изготовителя или с% 0,05 трипсин-ЭДТА, как описано ^42.
   3. Запрет диссоциации реагентов в соответствии с инструкциями изготовителя, не подвергая НСК в сыворотке. Центрифуга при 100 мкг в течение 5 мин.
   4. Количество клеток с использованием гемоцитометра или другого соответствующего счетчика клеток для определения количества клеток / мкл.
   5. Передача требуемое количество NSC к новому 15 мл коническую пробирку. Центрифуга при 100 мкг в течение 5 мин.
   6. Ресуспендируют клеток в 800 мкл 37 ° C HBSS. Определить объем клеточного осадка (общий объем клеточной суспензии - 800 мкл). ПРИМЕЧАНИЕ: Это необходимо для достижения точной концентрации клеток для инъекций. Таким образом, объем клеточного осадка должен быть определен на этом этапе для того, чтобы рассчитать объем 5% метилцеллюлозы, чтобы добавить в шаге 3.3.9.
   7. Передача клеток в стерильную 1,5 мл микроцентрифужных трубки, а затем центрифугируют при 100 х г в течение 5 мин.
   8. Аспирируйте супернатант и завершить подготовку клетки для ортотопического инъекции как в 3.2.12-3.2.21. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 1 НБК клеточной линии, шаги 3.3.1-3.3.9 будет ~ 60 мин.
4. Подготовка Mouse для инъекций
   1. Обезболить животного-реципиента с помощью инъекций IP 250 мг / кг Avertin (2,2,2 Tribromoethanol) или 100 мг / кг кетамина плюс 10 мг / кг ксилазина, в институциональных принципов IACUC. ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые здесь являются мыши в 3-6 месячном возрасте в качестве аллотрансплантата хозяев. Мыши в разном возрасте могут быть использованы для изучения влияния микросреды развивающего возрасте мозга на туморогенеза.
   2. Бритье головы над разреза с садовыми ножницами или ножницами.
   3. Стерилизовать места операции с 3 чередующихся смывах 70% этанола и бетадином.
   4. Применить глазной мази для глаз, чтобы предотвратить любые повреждения, вызванные потерей мигательного рефлекса.
   5. Оцените глубину анестезии педаль отмены (пальца щепоткой) рефлекса. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 5 мышей, шаги 3.4.1-3.4.5 займет ~ 15 мин.
5. Ортотопическая Имплантация
   1. Безопасность животных в стереотаксической рамы.
   2. Макэлектронной надрез над сагиттального шва длиной около 0,5 см между ушами и глазами.
   3. Найдите пересечение фронтальной и сагиттальной швов (брегмы), а также пересечение ламбдовидного и сагиттальной швов (лямбда). Убедитесь, что темени и лямбда находится в одной горизонтальной плоскости.
   4. Прикрепите шприц, содержащий клеточной суспензии и повторяющийся антиген дозатор для стереотаксической рамы над головой. Принесите кончик 27 G иглы в контакт с брегмы. Это источник, который будет использоваться для манипуляций с трехмерными координатами.
   5. Поднимите иглу немного от поверхности черепа и переместить 2 мм боковые и 1 мм рострально от брегмы.
   6. Осторожно опустите иглу через череп к месту назначения 4 мм от брюшного брегмы. ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали эти стереотаксические координаты целевой базальных ганглиев. Различные стереотаксических координаты могут быть использованы для изучения влияния микросреды различныхучастки мозга на туморогенеза.
   7. Введите 5 мкл клеточной суспензии путем активации повторного набора антигена раздаточном время. Оставьте иглу на месте в течение 2 мин, чтобы позволить внутричерепное давление, чтобы уравновесить.
   8. Вывести иглы медленно в течение 30 сек. Используйте ватный тампон, чтобы оказать давление на любое кровотечение, что может произойти.
   9. Приблизительная краев раны и закрыть разрез с помощью клея ткани. Администрирование 20 мкл Лидокаин подкожно в месте разреза. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 5 мышей, шаги 3.5.1-3.5.9 займет ~ 50 мин. UNC IACUC одобрил послеоперационную использование только местной анестезии. Консультации с местных институциональных IACUC рекомендуется в отношении требований к послеоперационной анальгетиков после этой процедуры.
6. Послеоперационный уход
   1. Поместите животных в чистой, теплой клетке, чтобы оправиться. Животные не должны быть размещены непосредственно в постельных принадлежностях, как может произойти случайно стремление.
   2. Соблюдайтеживотные для возобновления нормального поведения, такие как уход, ел, и дефекации. ПРИМЕЧАНИЕ: Возобновление нормального поведения может занять ~ 60 мин.

Мы разработали модель системы nGEM с корковых астроциты и НСК найденным новорожденных GEM укрывательство floxed условные онкогенные аллели, которые могут быть фенотипически характеризующиеся в пробирке и в естественных (Рисунок 1). Для того чтобы исследовать последствия онкогенных мутаций специально корковой астроцитов в пробирке, очень важно, чтобы сначала обогащения астроцитов. Кортикальные астроцитов урожаи содержат смесь микроглии, астроциты, олигодендроциты, OPC, и нейронов, но механические и генетические методы могут помочь в обогащении астроцитов. В то время как нейроны умирают при нормальных условиях культивирования, микроглии и олигодендроциты могут быть удалены путем встряхивания в течение ночи 41,43. Кроме того, генетическая рекомбинация floxed, онкогенных аллелей, направленных на GFAP + астроциты с использованием Ad5GFAPCre может обогатить для астроцитов. Мы использовали этот метод, чтобы заразить корковых урожаи от Rb1 LoxP / LoxP GEM щенков с флофиксированная Nf1 LoxP / LoxP и / или Pten LoxP / LoxP аллели. Ad5GFAPCre инфекция, вызванная пролиферативного преимущество в рекомбинированного GFAP + астроцитов, что увеличило чистоту астроцитов с 59% до> 90% через 5 - 9 мест в культуре (2А и 2В). Кроме того, мы обогащенные для астроцитов путем экспрессии T 121 под контролем промотора GFAP, чтобы индуцировать пролиферативное преимущество в астроцитах найденным TgGZT 121 мышей (фиг.2С). В то время как астроциты коры растут прилегает к культуральной чашке (фиг.2С), НСК расти, как неадгезивных нейросферах в пробирке (фиг.3А). Оба WT НСК и НСК с рекомбинации, floxed онкогенные аллели - TgGZT 121 (T), Крас G12D (R), и гомозиготной Pten делеционные (P - / -), называют ГТО- / - - Выразить маркера Sox2 НСК, в то время как только НСК собирают из GEM, содержащей TgGZT 121 выразить T 121 после Cre-опосредованной рекомбинации (Рисунок 3В).

Чтобы определить, как G 1 / S (Rb), МАРК и / или пути PI3K изменения повлиять на рост GFAP + астроциты в пробирке, распространение исследовали с помощью двух методов. МТС и подсчет клеток показал, что экспрессия Т 121 и Крас G12D увеличена пролиферацию кортикальных астроцитов (фиг.4А и 4В). Аналогичным образом, гомозиготные Rb1 (Rb) и Nf1 (Н), удаление в сочетании с гетерозиготной Pten (P +/-) удаление также повышенную пролиферацию астроцитов коры головного мозга (фиг.4С). Трансформированные клетки имеют неограниченный способность к пролиферации. Трансформирующей эффекты мутаций может быть измерена в пробирке с помощью ColONY анализы образования. Поэтому мы протестировали трансформирующие эффекты T 121 и Крас G12D выражения и гомозиготной Pten удаления в ГТО - / - корковых астроцитов на формирование анализе колонии, как описано выше 44. В то время как WT астроциты не образуют колоний, T астроциты формируется колонии на эффективности 1,03%. Следует отметить, что ГТО - / - астроциты были наивысшей эффективности образования колоний на 6,40% (Таблица 1). Для того, чтобы быть пригодным для доклинических испытаний лекарственных средств, важно, чтобы в пробирке моделях опухолей легко манипулировать генетически. Дополнительные генетические изменения могут быть стабильно введена в кортикальных астроцитов плазмидой или вирусных векторов. В качестве примера, мы стабильно трансдуцированных ген люциферазы в ГТО - / - астроциты (ГТО - / - Luc) с использованием VSV-pseudotyped pMSCV ретровирусный вектор. Экспрессия люциферазы увеличена люминесценции ~ 1000 раз по сравнению с родительскими клетками ( в пробирке. Ранее нами было показано, что лечение с низкой дозы PI-103, ингибитора двойного МРМ / PI3K, ингибирует PI3K сигнализацию, не затрагивая жизнеспособность клеток 30. Тем не менее, цитостатические / цитотоксические эффекты высших ПИ-103 доз не были определены. Таким образом, мы проверили, может ли PI-103 снизить ГТО - рост астроцитов в пробирке - /. PI-103 вызвало максимальное снижение 88% в ГТО - роста астроцитов (Рисунок 4E) - /. Ранее мы уже использовали Ортотопическая аллотрансплантаты из ГТО - / - астроциты, чтобы проверить другие клинически значимых терапевтических в естественных условиях (Шмид и др, рукопись представлена.) 45,46. Эти данные позволяют предположить, что трансформированные корковых астроциты, полученные из условного GEM может обеспечить гибкую модель системы, в которой для выполнения доклинических испытаний препарата в иммунной компетентным микрофономэ.

Ксенотрансплантаты из установленных клеточных линий и PDX человека требуют иммунодефицитом. В отличие от PDX, многие известные клеточные линии человека GBM не Повторим гистологические особенности GBM. Например, U87MG Ортотопическая ксенотрансплантаты формируется ограниченных опухолей, которые не вторгаются нормального мозга (Рисунок 5A). В противоположность этому, введение ГТО - / - астроциты в мозгах иммунокомпетентных, сингенных мышей дали инвазивных опухолей, которые перечислил гистологические особенности и их человеческие аналоги, в частности вторжения нормального мозга (Рисунок 5Б). Для количественной оценки ГТО в продольном направлении - / - рост аллотрансплантата, мышей умерщвляли через каждые 5 дней после инъекции клеток опухоли и нагрузка была определена путем количественного области опухоли на Н & Е-окрашенных срезов головного мозга. Опухоль площадь увеличивается экспоненциально с течением времени (Рисунок 5C). Ортотопическая введения 10 5 ГТО - / - астроциты на гecipient мозги привело к неврологическим заболеваемости, с медианой выживаемости 22 дней (Рисунок 5D). В дополнение к корковых астроцитов, мы провели Ортотопическая инъекции, используя TRP - / - НСК. TRP - / - NSC-производные опухоли были Т 121 положительный, пролиферативной, и поддерживается экспрессию маркера Sox2 NSC (фиг.6). Следует отметить, что инъекции кортикальных астроцитов и НСК найденным WT мышей C57BL / 6, а также фенотипически дикого типа корковых астроцитов или NSC с непрорекомбинировавших, floxed онкогенные аллели от условной GEM не вызывали образование опухолей в течение этого периода времени (данные не показаны). Продольный изображения в естественных был использован для контроля кинетики роста опухоли в ответ на медикаментозного лечения 40. Таким образом, ГТО - / - LUC астроциты были введены в мозг иммунокомпетентных сингенных помета и роста опухоли определяли путем серийного изображений биолюминесценции. Биолюминесценция увеличился в 15 раз в течение 16 дней(7А и 7В). Мы показали, что корковых астроциты и НСК, собранные с условной GEM может быть генетически модифицированы и фенотипически отличается в пробирке и в естественных условиях для определения генетики и клеточной биологии астроцитому патогенезе и могут быть использованы для доклинической разработки лекарств.

Рис.1 Схема корковой астроцитов и урожая НСК от nGEM. Фенотипически WT корковых астроциты и НСК собирали из GEM с условными онкогенных аллелей. Генетической рекомбинации индуцировали в пробирке с вектором AdCre. Трансформированные клетки фенотипически отличается в пробирке с помощью различных методов и в естественных условиях по ортотопического инъекции в мозг иммунокомпетентных,сингенные помета.

Рисунок 2 Обогащение GFAP + астроциты от серийного пассирования в пробирке. Представительства иммунофлуоресцентные изображения, показывающие GFAP + астроциты найденным Rb1 LoxP / LoxP GEM щенки с НФ1 LoxP / LoxP и / или Pten LoxP / LoxP в котором генетическая рекомбинация индуцировали Ad5GFAPCre и клетки пассированные раз X (PX) (A). Количественное определение обогащения GFAP + астроцитов в панели A. Столбцы показывают стандартную ошибку из 3-24 повторов (B). Представитель иммунофлюоресценции (сверху) и фазового контраста (внизу) изображения прилипшие корковых астроцитов найденным TgGZT 121 GEM щенков, которые выражают T 121 от GFAP промоутер в проходе9 лет после рекомбинации с Ad5CMVCre в пробирке (C). Астроциты были количественно как количество GFAP + (зеленый) клеток, деленное на общее количество DAPI-окрашенных ядер (синий) в любом другом прохода. Изображения были приняты на 10-кратным оригинальной увеличении (A, C). Шкала баров представляют 100 мкм (A, C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3 WT и рекомбинации НСК собирают из ГТО - / - GEM. Представительства фазового контраста изображения фенотипически WT (вверху) и ГТО - / - (внизу) НСК выросла как нейросферы в пробирке (). Представитель иммунофлюоресценции окрашивание на Т 121 (зеленый) и Sox2(Красный) выражение в WT (верхней) и ГТО - / - (нижней) нейросферы (B). Шкала баров представляют 100 мкм (A, B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. Характеристика корковых астроцитов в пробирке. Рост WT и TR кортикальных астроцитов была определена путем подсчета клеток на 1-7 дней (A). Относительная оптической плотности (ОП) и WT TR кортикальных астроцитов была определена МТС (B). Относительная рост WT и рекомбинации Rb1 - / -; Nf1 - / -; Pten +/- (РЗУ +/-) астроциты определялась МТС (C). Свечение родительской ГТО - / - и Люциферомазы выражая ГТО - / - астроциты (ГТО - / - Люк) (D). Относительная ОП ГТО - / - астроциты, обработанные PI103 в течение 5 дней, как определено МТС (E). Пролиферация и доза ответ была рассчитана с использованием показательного уравнения роста в GraphPad Prism 5. Бары представляют стандартную ошибку от 6 повторов в состоянии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5 В естественных условиях gliomagenesis. Представитель Н & Е окрашивали сечение U87MG ксенотрансплантата показывает дискретные краев опухоли (а). Представитель H & E окрашенных сечение ГТО - / - аллотрансплантата показывает диффузное вторжение нормального мозга (Б). Шкала баров в левой и правой H & E изображений представляют 1 мм и 100 мкм соответственно. Опухоль площадь была определена путем анализа H & E окрашенных срезах, фиксированных формалином, парафин мозги от иммунокомпетентных, сингенным помета, которым вводили 10 5 ГТО - / - астроциты и пожертвовал на 5-дневными интервалами после инъекции. (С). Анализ Каплана-Мейера выживание ГТО - / - Аллотрансплантация мышей в возрасте до заболеваемости показывает среднюю выживаемость 22 дней (D).

Рисунок 6 Иммунофлуоресценции ГТО аллотрансплантатов +/- НБК. Представительства иммунофлуоресцентные снимках видно, что ГТО +/- НСК вводили в мозг иммунокомпетентных, сингенным помета выразить T 121 (зеленый) и Sox2 (белый) и размножаются, как определяется Эду (красный) включения. Мышей озарен EDU и пожертвовал 6 недель после инъекции и свои мозги озарен параформальдегида. Шкала бар представляет 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7 Продольная томография ГТО - / - LUC аллотрансплантаты. Представительства биолюминесценции изображения (A) и количественное люциферазной потока с течением времени (B) показывает рост ГТО - / - аллотрансплантаты в иммунокомпетентных, сингенных мышей вводили 10 5 ГТО - / - Люк корковых астроцитов и отображаемого при указанных дней пост впрыска.г "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1 Colony формирование корковых астроцитов. WT, T и ГТО - / - корковых астроциты высевали в трех экземплярах в 4000, 2000, и 250 клеток / лунку соответственно. Колонии окрашивали кристаллическим фиолетовым через 14 дней после посева, отображаемого, и соunted использованием ImageJ. Покрытие эффективность рассчитывали как число колоний, деленная на количество посеянных клеток.

Авторам нечего раскрывать.