Методическая статья

Моделирование Астроцитома Патогенез In Vitro И В Vivo Использование кортикальной астроциты или нервные стволовые клетки из условного, генной инженерии мышей

DOI:

10.3791/51763

⸱

12 августа 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine, 3Division of Neuropathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina School of Medicine, 5Biological and Biomedical Sciences Program, University of North Carolina School of Medicine, 6Department of Radiation Oncology, Emory University School of Medicine, 7Department of Neurology, Neurosciences Center, University of North Carolina School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фенотипически дикие астроциты и нейральные стволовые клетки, собранные у мышей, сконструированных с помощью флоксированных, условных онкогенных аллелей и преобразованных с помощью вирусной Cre-опосредованной рекомбинации, могут быть использованы для моделирования патогенеза астроцитомы in vitro и in vivo путем ортотопической инъекции трансформированных клеток в мозг сингенных, иммунокомпетентных однопометников.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Современные модели астроцитомы ограничены в своей способности определять роль онкогенных мутаций в конкретных типах клеток мозга во время патогенеза заболевания и их полезность для доклинической разработки лекарств. Для того, чтобы разработать более совершенную модельную систему для этих приложений, были собраны и выращены в культуре фенотипически дикие корковые астроциты дикого типа и нейральные стволовые клетки (НСК) от условных, генетически модифицированных мышей (GEM), которые содержат различные комбинации флоксированных онкогенных аллелей. Генетическую рекомбинацию индуцировали in vitro с использованием аденовирусной Cre-опосредованной рекомбинации, что привело к экспрессии мутировавших онкогенов и делеции генов-супрессоров опухолей. Фенотипические последствия этих мутаций были определены путем измерения пролиферации, трансформации и лекарственного ответа in vitro. Для определения роли онкогенных мутаций и типа клеток в онкогенезе in vivo были разработаны модели ортотопических аллотрансплантатов, посредством которых трансформированные клетки стереотаксически вводятся в мозг иммунокомпетентных сингенных однопометников. В отличие от большинства установленных ксенотрансплантатов клеточной линии глиобластомы человека, инъекция трансформированных кортикальных астроцитов, полученных из GEM, в мозг иммунно-компетентных однопометников приводила к образованию астроцитом, в том числе к наиболее агрессивному подтипу, глиобластоме, которая повторяла гистопатологические признаки астроцитомы человека, включая диффузную инвазию нормальной паренхимы мозга. Биолюминесцентная визуализация ортотопических аллотрансплантатов из трансформированных астроцитов, сконструированных для экспрессии люциферазы, использовалась для мониторинга роста опухоли in vivo с течением времени. Таким образом, модели астроцитомы с использованием астроцитов и НСК, собранных из ГЭМ с условными онкогенными аллелями, обеспечивают интегрированную систему для изучения генетики и клеточной биологии патогенеза астроцитомы in vitro и in vivo и могут быть полезны при доклинической разработке лекарств от этих разрушительных заболеваний.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Астроцитомы наиболее распространенной первичной опухоли головного мозга и глиобластомы (GBM), IV астроцитома класса, является наиболее распространенным и агрессивным подтипом при медиане выживаемости 12-15 месяцев 1,2. Вторжение диффузных астроцитом, в частности GBM, исключает полное хирургическое удаление, ограничивает эффективность адъювантной терапии, и неизбежно приводит к рецидиву после лечения 3. Пациенты, изначально присутствующие либо с De Novo (первичной) GBM или с более низкими астроцитом класса, что неизбежно прогрессирует в (вторичной) GBM 4. GBM является геномно неоднородна и характеризуется взаимоисключающих и сопутствующих мутаций в генах, которые регулируют три основных сигнальных путей: G 1 / S (Rb) клеточного цикла контрольных точек, рецептора тирозинкиназы (RTK), и TP53 дорожками 5-7. GBM состоит из четырех геномных подтипов с различными профилями экспрессии, которые напоминают различные типы клеток мозга, предполагая, что GBM подтип ВЛИянием его клетки происхождения 6,8,9. Лучшие модели астроцитома обязаны определить роль конкретных комбинаций мутаций в определенные клеточные типы во астроцитому патогенезе. Используя эти модели для более эффективного развития доклинических наркотиков в конечном итоге поможет улучшить результаты лечения пациентов. Современные модели астроцитома включают установлены клеточные линии человека, пациента происходит ксенотрансплантаты (PDX), генетически модифицированные нормальные человеческие астроциты и нервные стволовые клетки (НСК) и генно-инженерных мышей (GEM) 10-14. Мы разработали альтернативный, не-зародышевой линии GEM (nGEM) модель 15 с использованием первичных клеток мозга - коры астроциты и NSC - найденным GEM, несущего различные комбинации floxed онкогенных аллелей. Целью было генерации моделей Астроцитома с генетически определенных клеток, которые могут быть фенотипически характеризующихся как в пробирке и в естественных и потенциально используемых для доклинической разработки лекарственных средств в Immune-компетентные мышей.

Штатные клеточные линии человека являются наиболее часто используется модель патогенеза астроцитому и ответ наркотиков в пробирке и в естественных условиях. Они технически прямо вперед, широко доступны, и определили кинетики и онкогенность на ортотопического ксенотрансплантации в иммунодефицитных мышей 10,11,16-18 . Их недостатки включают неспособность генерировать установленные клеточные линии из низкосортных астроцитом, ограничивая исследование только к высокой астроцитом; Отсутствие определенной ячейке происхождения; наличие сложных геномных нарушений, часто с геномных профилей, которые заметно отличаются от оригинального образца пациента; и восприимчивость к фенотипической и генотипической дрейфа во серийного культуры в сыворотке 11,17,19-22. Фенотипические последствия отдельных онкогенных мутаций в установленных клеточных линий человека GBM может маскироваться множества нарушений, которые на самом деле присутствует, которые часто исключает elucidation прямых последствий генотип-фенотип.

PDX генерируются через подкожной прохождения пациентом изолированы клетках астроцитомы в иммунодефицитных мышей или через их культуры как неадгезивных сфероидов в определенном, сыворотки среде до ортотопического инъекции в мозг иммунодефицитных мышей 12,23. PDX более точно поддерживать геномной ландшафт человека астроцитомы, но аналогично установленных клеточных линий человека, фенотипический эффект отдельных онкогенных мутаций могут быть замаскированы в связи с их геномной сложности 19,24. Чтобы определить фенотипические последствия конкретных онкогенных мутаций, особенно в ответ на новые методы лечения, панели, установленные клеточных линий или PDX человека часто используются, чтобы установить генотип-фенотип корреляции, показать обобщения, и свести к минимуму вероятность линии конкретных эффектов клеток. В то время как PDX точно воспроизводят гистопатологические признаки человеческой астроцитомы, IncЛУДИНГ вторжение, Ортотопическая ксенотрансплантаты из установленных клеточных линий человека вообще не 21,23,25. Кроме того, нормальные человеческие астроциты и НСК были генной инженерии с определенными онкогенных мутаций моделировать Астроцитома туморогенез в пробирке и в естественных 13,14,26. Эти клетки имеют геномную сложность установленных клеточных линий и PDX человека и точно воспроизводят человеческую Астроцитома гистопатологию, но требуют ксенотрансплантации в иммунодефицитных грызунов в естественных условиях. Потому что все модели клеток человека требуют иммунодефицитом грызунов для предотвращения иммунной опосредованного отторжения ксенотрансплантата, эти модели не резюмировать родные опухоли стромы взаимодействия сингенной системы и не имеют интактную иммунную систему, ограничивая доклинические исследования стромы целенаправленной и иммунной-модуляторных виды терапии, 10,11.

GEM разрешение экспертиза фенотипических последствий заранее определенных комбинаций онкогенного Мутания в естественных условиях в течение на месте туморогенеза. В то время как не-условное GEM есть мутаций внутри всех тканях в течение всего развития, условно GEM уже floxed онкогенные аллели, которые позволяют адресности мутаций путем ограничения Cre-опосредованной рекомбинации определенными типами клеток путем использования типоспецифических промоутеров клеток 10,11,15,18. Условный астроцитома GEM были использованы для выяснения функциональные роли онкогенных мутаций в различных типах клеток в интактным мозгом 11. Доклинические полезность на месте gliomagenesis помощью условного GEM ограничивается рядом факторов, включая 1) Отсутствие коррелят в пробирке, 2) трудности в формировании большие когорты мышей со сложными генотипов, 3) с длительным латентным периодом в развитии опухоли Ситу , 4) и стохастического прогрессирование опухоли. Поскольку на месте канцерогенез отсутствует модель, соответствующую в пробирке, тестирование препарата в пробирке не может быть выполнена WIth обычные условные модели GEM. В отличие от других видов рака, условные модели GEM астроцитомы редко, индуцированный отдельных онкогенных мутаций 11. Таким образом, сложные схемы размножения требуются для создания условного GEM с несколькими онкогенных мутаций. Кроме того, астроцитома инициация происходит с переменной пенетрантностью после длительного латентного в этих моделях, в то время как прогрессирование до высокого астроцитом обычно происходит в неоднородном, стохастического образом и в конечном итоге приводит к опухоли со сложными геномных пейзажей и стремительных кинетики роста 27, 28. Переменная пенетрантность и стохастический характер злокачественной прогрессии в условных моделей GEM требует, чтобы отдельные мышей быть экранированы рентгенографии для обнаружения присутствия и местоположения высокого астроцитом до их зачисления в доклинических испытаний лекарств. Взятые вместе, эти ограничения препятствуют поколения и тестирование крупных когорт условного GEM, необходимое для прeclinical тестирование на наркотики.

GEM система RCAS-тва, которые использует птичьего ретровирусов (Rcas) векторы заразить GEM инженерии выразить вирусный рецептор (TVA) по конкретным нейронных типов клеток, широко используется для моделирования Астроцитома туморогенез 11. В отличие от условного GEM, эта модель система позволяет введение нескольких онкогенных мутаций в определенных типах клеток без необходимости сложных схем селекции. Тем не менее, она ограничена переменной пенетрантностью, требование для активно делящихся клеток для достижения вирусного интеграции, и случайной вставки трансгенов в геном хозяина 29.

Номера для зародышевой линии GEM (nGEM) модели, которые используют клетки, полученные из GEM, становятся все более важными, потому что они преодолеть многие из ограничений других модельных систем 15. Роль инициирования типа клеток и сопутствующих мутаций в астроцитому патогенезе трудно сдерживатьшахта с использованием установленных клеточных линий GBM человека или PDX, потому что они являются производными от терминальной стадии опухоли, которые накопились обширные генетические мутации в неопределенных типов клеток в ходе злокачественной прогрессии. В отличие от этого, все сорта астроцитомы могут быть смоделированы с помощью nGEM путем индукции определяется генетические мутации в определенных очищенных типы клеток мозга 11,30. Таким образом, влияние специфических генетических мутаций и типа клеток на клеточном и молекулярном фенотипов может быть определена в пробирке и в естественных условиях. Как и в установленных клеточных линий человека GBM, начальная пробирке тестирования на наркотики при помощи nGEM могут быть использованы по приоритетам препараты для тестирования в естественных условиях, использующие одни и те же клетки. Опухолей ин виво может быть определена путем аллотрансплантации nGEM клетки ортотопически в мозг иммунокомпетентных сингенных помета 30. Эти Ортотопическая модели аллотрансплантатов поэтому позволяют в естественных условиях тестирования не только обычных цитотоксической ай целевой терапии, но иммунная-модуляторный и строме ориентированные виды терапии, а также. И, наконец, роль микроокружения на инициации и прогрессирования опухоли могут быть определены путем сравнения результатов между nGEM и обычные модели GEM с использованием тех же мутации в тех же типах клеток.

Мы и другие разработали Астроцитома nGEM использованием первичных клеток - астроцитов, NSC или клетки-предшественники олигодендроцитов (OPC) - найденным GEM 30-34. Обоснованием разработке астроцитомой nGEM было создать модель для определения фенотипические последствия онкогенных мутаций в специфические типы клеток, которые потенциально могут быть использованы для доклинических испытаний препарата в пробирке и в естественных в иммунокомпетентных животных. Мы собрали фенотипически WT корковых астроциты и NSC от не-Cre выражающие, условное GEM поддерживается на> 94% C57 / BL6 фоне с floxed РБ пути - Rb1 LoxP / LoxP или TgGZT121 - и floxed RTK / РАН / PI3K пути - nf1 LoxP / LoxP, Крас G12D, PTEN LoxP / LoxP - гены в различных комбинациях 35-39. Мы индуцированной генетической рекомбинации в пробирке с помощью аденовирусные векторы, кодирующие Cre рекомбиназу. Поскольку корковые астроцитов урожаи содержат смесь типов клеток, мы использовали Ad5GFAPCre векторы или доминирующие онкогенные трансгены, такие как TgGZT 121 приводится в движение от промотора GFAP человека, для обогащения GFAP + кортикальных астроцитов в этих культурах. Мы определили фенотипические последствия G 1 / S (РБ), MAPK, и пути PI3K мутаций в корковых астроциты и НСК в пробирке и в естественных условиях. МАРК и PI3K пути активированные G1 / S-неполноценные астроциты молекулярно передразнил человек пронейральный GBM и, по ортотопического инъекции, образованные опухоли в заранее определенном месте с единых кинетики роста, короткие задержки, и гистологическиеаль отличительными чертами человеческого GBM 30. Продольный контроль роста опухоли в естественных условиях помогает доклинические испытания препарата через нормализации лечения когорт и количественного анализа роста опухоли в ответ на лечение 40. Мы определили кинетики роста опухоли по продольной биолюминесценции визуализации мышей, которым вводили люциферазы выражая корковых астроциты. Поэтому корковых астроциты и НСК, полученные из условного GEM обеспечить послушный модельную систему для определения функциональных последствий астроцитомы мутаций, связанных и потенциального модельной системы для доклинической разработки лекарств.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все исследования на животных были одобрены Университета Северной Каролины Уходу за животными и использованию комитета.

1 Культивирование Кортикальная Астроциты от новорожденных мышей

  1. Подготовка
    1. Crumple 2-3 тонких тканей задач и поместить в нижней части колбу, содержащую 70% этанола. Поместите рассекает ножницы, изогнутые щипцы и 2 пары прямых микро щипцов в этой колбе. Ткани используются, чтобы избежать изгиба микро щипцы.
    2. Добавить 1 мл HBSS до 60 мм блюдо культуры ткани. Подготовьте отдельный блюдо для каждого животного и поддерживать блюда на льду.
    3. Обезболить животных на институциональных правил.
    4. Теплый 7 мл среды DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина (полное DMEM) для каждого животного в водяной бане при 37 °. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 5 мышей, шаги 1.1.1-1.1.4 займет ~ 15 мин.
  2. Ткань Урожай
    1. Жертвоприношение новорожденных мыши (1-3 день) за institutiOnal правила.
    2. Удалить рассекает ножницы из этанола, позволяют им капать сухие, и сделать сагиттальный разрез в коже над черепа от спинного мозга к носу.
    3. Сделайте надрез в черепе вдоль стреловидного шва, начиная от спинного мозга и расширение мимо обонятельных луковиц. Следите, чтобы кончики ножницами вблизи внутренней поверхности черепа, чтобы свести к минимуму повреждения головного мозга ткани.
    4. Использование изогнутых щипцов, аккуратно чистить каждое полушарие черепа вбок от мозга.
    5. Использование прямых микро щипцы, осторожно зажать от спинной части каждого коркового полушарии и поместите его в блюдо культуры ткани, содержащей HBSS. Позаботьтесь, чтобы избежать мозжечок и обонятельной луковицы. Не берите любую ткань ниже мозолистого тела.
    6. Использование рассекает микроскоп и 2 пары микро щипцы, осторожно удалите мозговые оболочки от каждого коркового полушарии. не Верните блюдо культуры ткани на лед, пока, начиная тканей homogenizatioн.
    7. Повторите шаги 1.2.1 через 1.2.6 для каждого дополнительного животного. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 5 мышей, шаги 1.2.1-1.2.7 займет ~ 30 мин.
  3. Ткань усреднении
    1. Используя чистую лезвие, мелко нарезать кубиками корковых полушария и переместить пластину к капот культуры ткани.
    2. Трансфер нарезанный кубиками ткани в стерильный 15 мл коническую трубку. Промыть пластины с 1 мл ледяной ССРХ и передать в пробирку, содержащую ткани.
    3. Подождите, пока ткань не оседает на дне пробирки, затем осторожно удалить избыток HBSS с помощью пипетки.
    4. Добавить 2 мл комнатной температуры трипсина / ЭДТА. Внесите ~ 10x с 1 мл пипетки для дальнейшего отмежеваться клетки.
    5. Инкубируйте клеточной суспензии при 37 ° С в течение 15 - 20 мин. Тщательно перемешать инверсии каждые 5 мин.
    6. Добавить 3 мл полной DMEM ингибировать трипсин. Внесите ~ 10x с 1 мл пипетки для смешивания раствора.
    7. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    8. Удалитьсупернатант с 1 мл пипетки. Не аспирации среды, потому что осадок может быть потеряно.
    9. Ресуспендируют осадок в 4 мл 37 ° С завершить DMEM. Передача клеточной суспензии до 75 см с завинчивающейся крышкой колбу культуры тканей. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 5 мышей, шаги 1.3.1-1.3.9 займет ~ 50 мин.
    10. Около 16 ч после сбора урожая астроцитов, мыть колбы с 4 мл 37 ° C ССРХ, затем добавить 4 мл 37 ° C завершить DMEM. Поддержание корковых астроцитов при 37 ° С в 5% СО 2. ПРИМЕЧАНИЕ: стадия промывки важна для удаления неадгезивных клеток и мусора с блюдо культуры.
    11. Когда культура ~ 95% сливной, встряхивали в течение ночи при 37 ° С в 5% СО 2, удалить СМИ содержащие отдельные клетки, затем промыть колбу с 4 мл 37 ° C ССРХ. Добавить 4 мл 37 ° C завершить DMEM и поддерживать клетки при 37 ° С в 5% СО 2. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг важен для обогащения культур для корковых астроцитов, как загрязнение микроглии иКлетки-предшественники олигодендроцитов отсоединения с этой процедурой, и удаляются из культуры 41.
    12. Повторите шаги 1.3.1-1.3.11 для каждого животного.
  4. Индукция генетической рекомбинации
    1. 24 часа после завершения шага 1.3.11, заменить жидкость с 2 мл 37 ° C завершить DMEM. Добавьте 1 мл 37 ° C СКМ, содержащие 1 мкл> 10 10 БОЕ / мл Ad5CMVCre или Ad5GFAPCre. Выдержите в течение 6 ч при 32 ° С в 5% СО 2 .CAUTION: Использование BSL2 меры безопасности при обращении с рекомбинантного аденовируса.
    2. Удалить вирус, содержащие медиа и добавьте 37 ° C полной DMEM без вируса корковых астроцитов. ВНИМАНИЕ: Использование BSL2 меры безопасности при обращении с рекомбинантные аденовирусы и выбросьте вируссодержащей диск на институциональных правил. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 5 астроцитов культур, шаги 1.4.1 - 1.4.3 займет ~ 15 мин исключая 6 ч инкубации.
    3. Развернуть корковых культур астроцитов для впробирке и в естественных характеристик. Примечание: определения наличия мутации следующую CRE-рекомбинации с помощью ПЦР с праймерами, специфичными для рекомбинации гена или иммуноблотах либо для конкретного мутантного белка или его последствий сигнализации. Время, необходимое для фенотипической стабилизации корковых культур астроцитов после Cre-рекомбинации будет зависеть от мутаций, используемых и должно быть определено опытным путем (Рисунок 2).

2. Культивирование нервные стволовые клетки из новорожденных мышей

  1. Подготовка
    1. Перед началом вскрытия, подготовки 4 мл пищеварения раствора на мозге, добавив 3,1 мг папаин и 1,3 мг цистеин к 4 мл диссоциации среды - 98 мм Na 2 SO 4, 30 мМ K 2 SO 4, 5,8 мМ MgCl 2, 0,25 мМ CaCl 2 , 1 мМ HEPES (от 1 М HEPES рН 7,4 складе) 20 мМ глюкозы, 0,001% фенола красного и 0,125 мМ NaOH. Добавление папаини цистеин диссоциации среде получится желтый раствор.
    2. Инкубировать в 37 ° С на водяной бане в течение 15 мин. Смешайте периодически переворачивая.
    3. Добавить 0,1 М NaOH по каплям, пока пищеварение решение не возвращает зажечь красный цвет.
    4. В капот культуры ткани, стерильный фильтр переваривание решение с использованием шприцевой фильтр (0,22 мкм размер пор). Держите пищеварения решение на льду.
    5. Подготовка 50 мл стволовых клеток среднего (SCM) путем смешивания 44,5 мл НСК базальной среды, 5 мл НСК добавки, 0,5 мл пенициллина-стрептомицина, 50 мкл 0,2% гепарина, 10 мкл 100 мкг / мл EGF, и 10 мкл 100 мкг / мл bFGF. СКМ стабилен в течение 1 недели при хранении при 4 ° С.
    6. Подготовить полное HBSS (cHBSS) путем смешивания 50 мл 10х HBSS, 1,25 мл 1 М HEPES (рН 7,4), 15 мл 1 М Д-глюкоза, 5 мл 100 мМ CaCl 2, 5 мл 100 мМ MgSO 4, и 2 мл 1 М NaHCO 3. Принесите общий объем до 500 мл с DDH 2 O.
    7. Фильтр стерилизовать cHBSS остроумиеха-фильтр размер 0,2 мкм пор и хранят при температуре 4 ° С.
    8. Crumple 2-3 тонких тканей задач и поместить в нижней части колбу, содержащую 70% этанола. Поместите рассекает ножницы, изогнутые щипцы, и 2 пары прямых микро щипцов в этой колбе. Ткани используются, чтобы избежать изгиба микро щипцы. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 5 мышей, шаги 2.1.1-2.1.8 займет ~ 45 мин.
  2. Ткань Урожай
    1. Жертвоприношение новорожденных (день 1-3) мышей на институциональных правил.
    2. Удалить рассекает ножницы из 70% этанола, позволяют им капать сухие, и сделать сагиттальный разрез в коже над черепа от спинного мозга к носу.
    3. Сделайте надрез в черепе вдоль стреловидного шва, начиная от спинного мозга и расширение мимо обонятельных луковиц. Следите, чтобы кончики ножницами вблизи внутренней поверхности черепа, чтобы свести к минимуму повреждения головного мозга ткани.
    4. Использование изогнутых щипцов, аккуратно чистить каждое полушарие черепа с боков отмозг.
    5. Аккуратно удалите весь мозг и место в ледяной cHBSS.
    6. Использование рассечение микроскоп, осторожно удалите мозговые оболочки из мозга с мелкими инструментами рассечение.
    7. Поместите мозг на его нижней поверхности и удалить мозжечок / задний мозг и обонятельной луковицы / лобной коры с вертикальной (корональной) режет с размером 11 скальпелем.
    8. Поверните оставшийся мозг на 90 °, чтобы поместить его на каудальной части, создавая таким образом корональной вид мозга. Найдите боковые желудочки.
    9. Вырежьте кубической раздел, содержащий субвентрикулярной зоне (СВЗ).
    10. Трансфер СВЗ содержащие ткани на 60 мм блюдо культуры ткани с свежим ледяной cHBSS и фарша ткани с размером 11 скальпелем.
    11. Передача Измельченную ткань в стерильную пробирку на 15 мл. Поместите пробирку на льду.
    12. Вымойте Петри с 1-2 мл ледяной cHBSS. Передача промывочного раствора в пробирку, содержащую ткани.
    13. Повторите шаги 2.2.1-2.2.12 с дополнительной neonataл мышей при необходимости. Перенесите все 15 мл пробирок на капот культуры ткани в течение оставшейся части протокола. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 5 мышей, шаги 2.2.1 - 2.2.13 займет ~ 45 мин.
  3. Ткань усреднении
    1. Поместите пищеварения решение (полученного на стадии 2.1.1) в водяной бане при 37 ° в течение 5 мин. Кроме того, теплая 2 мл СКМ за мозга в водяной бане при 37 °.
    2. Осторожно удалите супернатант из фарша ткани с 1 мл пипетки. Не аспирации.
    3. Добавить 2 мл 37 ° C пищеварения раствора на 15 мл трубки и аккуратно перемешать переворачиванием.
    4. Инкубировать в 37 ° С на водяной бане в течение 15 мин. Смешайте по инверсии каждые 5 мин.
    5. Добавить еще 2 мл 37 ° С раствору пищеварения в каждую пробирку и повторите шаг 2.3.4.
    6. Разрешить клетки оседают на дне пробирки под действием силы тяжести, а затем удалить супернатант из сброженных ткани с использованием 1 мл пипетки.
    7. Добавить 2 мл 10 мкМ E-64, разведенного в cHBSS и аккуратно перемешать переворачиванием.
    8. Инкубировать в течение 3 мин при комнатной температуре.
    9. Разрешить клетки оседают на дне пробирки под действием силы тяжести, а затем удалить супернатант из сброженных ткани.
    10. Добавьте 1 мл 37 ° C cHBSS и гомогенизации с наконечником в 1 мл пипетки (~ 20 ударов). Избегайте инъекционных пузырьков воздуха в течение ткани гомогенизации.
    11. Проходят тканевого гомогената через ситечко размер пор клеток 40 мкм, затем смойте сетчатый фильтр с 5 мл 37 ° C cHBSS.
    12. Центрифуга тканевого гомогената при 125 х г в течение 5 мин.
    13. Удалить 95% супернатанта с 1 мл пипетки, не нарушая осадок клеток. Тщательно ресуспендируют осадок клеток в 200 мкл 37 ° C СКМ при пипетки 200 мкл.
    14. Добавить 1,8 мл 37 ° C SCM и передачи клеточной суспензии на лунку стерильного 6-луночного планшета. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 5 мышей, шаги 2.3.1-2.3.14 займет ~ 75 мин.
  4. Neural стволовых клеток Культура
    1. Пополнять среду после 3-х дней, добавив еще 2 мл 37 °C СКМ.
    2. После 7 дней, передать нейросферы в 15 мл пробирку и пусть нейросферы поселиться под действием силы тяжести в течение> 5 мин.
    3. Удалить супернатант и добавить 2 мл 37 ° C SCM.
    4. Перенесите нейросферы на новый колодец 6-луночного планшета с.
    5. Добавить 2 мл 37 ° C СКМ каждые 3-4 дня, и изменить среду полностью каждые 7 дней.
    6. Если нейросферы> 100 мкм в диаметре, тщательно отделить раствором стволовых клеток диссоциации и replate НСК при желаемой плотности клеток.
  5. Индукция генетической рекомбинации
    1. Добавьте 1 мл 37 ° C СКМ, содержащие 1 мкл> 10 10 БОЕ / мл Ad5CMVCre или Ad5GFAPCre в 2 мл СКМ в настоящее время на клетки. ВНИМАНИЕ: Использование BSL2 меры безопасности при обращении с рекомбинантного аденовируса.
    2. Инкубировать в течение 6 ч при 32 ° С в 5% СО 2.
    3. Трансфер SCM с нейросферы в 15 мл пробирку и пусть сферы поселиться под действием силы тяжести в течение 5 мин.
    4. Удалить супернатант сначала с 1 мл пипетки, а затем с 200 мкл пипетки. ВНИМАНИЕ: Использование BSL2 меры безопасности при обращении с рекомбинантные аденовирусы и выбросьте вируссодержащей диск на институциональных правил.
    5. Добавить 2 мл 37 ° C СКМ без вируса к НСК, а затем перенести в 6-луночного планшета с. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 5 культур НСК, шаги 2.5.1-2.5.5 займет ~ 15 мин исключая 6 ч инкубации.
    6. На следующий день повторите шаги 2.5.1-2.5.5, затем нейросфера пассажей при необходимости. Сферы теперь может быть расширена за 2-3 проходов до характеризации в пробирке и ортотопического инъекции в мозг мыши в естественных условиях. Примечание: определения наличия мутации следующую CRE-рекомбинации с помощью ПЦР с праймерами, специфичными для рекомбинации гена или иммуноблотах либо для конкретного мутантного белка или его последствий сигнализации. Время, необходимое для стабилизации фенотипической культур NSC после CRE-рекомбинации будет зависетьна мутаций, используемых и должно быть определено эмпирически (фиг.2 и 3).

3 Ортотопическая впрыска рекомбинированных клеток в мозг получателя Iimmunocompetent мышей

  1. Получение 5% метилцеллюлозы
    1. Растворить 5 г 15 сП метилцеллюлозы в деионизированной водой до конечного объема 50 мл в 100 мл завинчивающейся крышкой бутылки. Добавьте порошок медленно при перемешивании при 4 ° С для предотвращения образования комков. Это может занимать до 24 часов перемешивания при 4 ° С в течение всего метилцеллюлоза, чтобы ввести раствор.
    2. Взвесьте бутылку и записать вес.
    3. Автоклав 5% растворе метилцеллюлозы. После того, как в автоклаве, метилцеллюлоза станет полутвердые гель.
    4. Взвесьте бутылку и рассчитать вес потерял во время обработки в автоклаве.
    5. Соблюдая правила асептики, добавьте 1 мл стерильной воды на каждый грамм веса потерял.
    6. Поместите на льду и добавляют 50 мл охлажденного льдом 2x DMEM.
    7. Смешайте в течение ночи с использованием магнитной мешалки при 4 ° С. С помощью стерильной техники разделить на 5% растворе метилцеллюлозы в 20 мл аликвоты. Храните аликвоты при 4 ° С в течение до шести месяцев или до 2x DMEM истекает. Примечание: Получение 5% раствора метилцеллюлозы в шагах 3.1.1-3.1.7 будет ~ 2,5 дней.
  2. Подготовка корковых астроциты для инъекций
    1. Урожай корковых астроциты когда ~ 90% сливающиеся.
    2. Для уборки, аспирата полное DMEM и мыть тарелки с равным объемом 37 ° C ССРХ.
    3. Добавьте достаточно трипсин, чтобы покрыть пластину. Осторожно наклоните и постучите по планшету, пока клетки начинают отделяться.
    4. Деактивировать трипсин с равным объемом 37 ° С завершить DMEM.
    5. Трансфер клетки к 50 мл коническую трубку и мыть тарелку с таким же объемом 37 ° C полной DMEM, используемой в 3.2.4.
    6. Трансфер стирки СМИ в пробирку, содержащую клетки. Центрифуга при 200 х г в течение 3 мин.
    7. Аспирируйте сupernatant и ресуспендирования клеток в 1 мл 37 ° С завершить DMEM.
    8. Количество суспензии клеток с помощью гемоцитометра или другого соответствующего счетчика клеток, чтобы определить количество клеток / мкл.
    9. Передача требуемое количество клеток к новому 15 мл коническую пробирку. Центрифуга при 200 х г в течение 3 мин.
    10. Ресуспендируют клеток в 800 мкл 37 ° C завершить DMEM. Определить объем клеточного осадка (общий объем клеточной суспензии - 800 мкл). ПРИМЕЧАНИЕ: Это необходимо для достижения точной концентрации клеток для инъекций. Таким образом, объем клеточного осадка должен быть определен на этом этапе для того, чтобы рассчитать объем 5% метилцеллюлозы, чтобы добавить в шаге 3.2.12.
    11. Передача клеток в стерильную 1,5 мл микроцентрифужных трубки, а затем центрифугируют при 200g в течение 3 мин.
    12. Аспирируйте супернатант от осадка клеток и ресуспендируют корковых астроцитов в соответствующем объеме охлажденного льдом 5% метилцеллюлозы (желательно общий объем - объемОсадок клеток), чтобы получить нужное количество клеток / мкл.
    13. Поместите клетки на льду до инъекции.
    14. Поместите 250 мкл стеклянный шприц в повторяющуюся антигена Диспенсер затем поместить тупой 18 G иглу на шприц.
    15. Вывод на поршень медленно с иглой в корковой астроцитов ходовой части; будет пузырьков воздуха над клетками, которые должны быть удалены, поскольку пузырьки воздуха будет сжимать и уменьшить объем фактически впрыскивается в головном мозге.
    16. Держите кончик иглы чуть выше коркового астроцитов подвески и толкать поршень в быстро. Воздушный пузырь будет двигаться быстрее, чем суспензии клеток и в основном будет выслан.
    17. Повторите шаг 3.2.16, пока все пузырьки воздуха удаляются из иглы.
    18. Заполните шприц к о ~ 200 мкл, а затем, удерживая иглу и вытяните поршень назад до упора. Маленькие пузырьки воздуха могут быть удалены путем проведения Наконечник иглы вверх и быстро толкает поршень в приблизительно 50 мкл затем медленно снятия на полную мощность.
    19. Держите кончик в вертикальном положении и повторите шаг 3.2.18 4-5x.
    20. Выбросьте иглу 18 калибра и соответствовать 27 G иглу на шприц.
    21. Нажмите кнопку на антиген дозатора до жидкость не будет выливаться из иглы. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 1 линии астроцитов клеток, шаги 3.2.1-3.2.21 займет ~ 60 мин.
  3. Подготовка НСК для инъекций
    1. Когда нейросферы> 100 мкм в диаметре, трансфер в 15 мл пробирки и пусть нейросферы поселиться под действием силы тяжести для> 5 мин.
    2. Удалить супернатант и диссоциируют нейросферы с нежным диссоциации реагента, например раствора диссоциации стволовых клеток или Accutase соответствии с инструкциями изготовителя или с% 0,05 трипсин-ЭДТА, как описано 42.
    3. Запрет диссоциации реагентов в соответствии с инструкциями изготовителя, не подвергая НСК в сыворотке. Центрифуга при 100 мкг в течение 5 мин.
    4. Аспирируйте супернатант, то ресуспендирования клеток в 1 мл 37 ° C cHBSS для генерации суспензии отдельных клеток.
    5. Количество клеток с использованием гемоцитометра или другого соответствующего счетчика клеток для определения количества клеток / мкл.
    6. Передача требуемое количество NSC к новому 15 мл коническую пробирку. Центрифуга при 100 мкг в течение 5 мин.
    7. Ресуспендируют клеток в 800 мкл 37 ° C HBSS. Определить объем клеточного осадка (общий объем клеточной суспензии - 800 мкл). ПРИМЕЧАНИЕ: Это необходимо для достижения точной концентрации клеток для инъекций. Таким образом, объем клеточного осадка должен быть определен на этом этапе для того, чтобы рассчитать объем 5% метилцеллюлозы, чтобы добавить в шаге 3.3.9.
    8. Передача клеток в стерильную 1,5 мл микроцентрифужных трубки, а затем центрифугируют при 100 х г в течение 5 мин.
    9. Аспирируйте супернатант и завершить подготовку клетки для ортотопического инъекции как в 3.2.12-3.2.21. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 1 НБК клеточной линии, шаги 3.3.1-3.3.9 будет ~ 60 мин.
  4. Подготовка Mouse для инъекций
    1. Обезболить животного-реципиента с помощью инъекций IP 250 мг / кг Avertin (2,2,2 Tribromoethanol) или 100 мг / кг кетамина плюс 10 мг / кг ксилазина, в институциональных принципов IACUC. ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые здесь являются мыши в 3-6 месячном возрасте в качестве аллотрансплантата хозяев. Мыши в разном возрасте могут быть использованы для изучения влияния микросреды развивающего возрасте мозга на туморогенеза.
    2. Бритье головы над разреза с садовыми ножницами или ножницами.
    3. Стерилизовать места операции с 3 чередующихся смывах 70% этанола и бетадином.
    4. Применить глазной мази для глаз, чтобы предотвратить любые повреждения, вызванные потерей мигательного рефлекса.
    5. Оцените глубину анестезии педаль отмены (пальца щепоткой) рефлекса. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 5 мышей, шаги 3.4.1-3.4.5 займет ~ 15 мин.
  5. Ортотопическая Имплантация
    1. Безопасность животных в стереотаксической рамы.
    2. Макэлектронной надрез над сагиттального шва длиной около 0,5 см между ушами и глазами.
    3. Найдите пересечение фронтальной и сагиттальной швов (брегмы), а также пересечение ламбдовидного и сагиттальной швов (лямбда). Убедитесь, что темени и лямбда находится в одной горизонтальной плоскости.
    4. Прикрепите шприц, содержащий клеточной суспензии и повторяющийся антиген дозатор для стереотаксической рамы над головой. Принесите кончик 27 G иглы в контакт с брегмы. Это источник, который будет использоваться для манипуляций с трехмерными координатами.
    5. Поднимите иглу немного от поверхности черепа и переместить 2 мм боковые и 1 мм рострально от брегмы.
    6. Осторожно опустите иглу через череп к месту назначения 4 мм от брюшного брегмы. ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали эти стереотаксические координаты целевой базальных ганглиев. Различные стереотаксических координаты могут быть использованы для изучения влияния микросреды различныхучастки мозга на туморогенеза.
    7. Введите 5 мкл клеточной суспензии путем активации повторного набора антигена раздаточном время. Оставьте иглу на месте в течение 2 мин, чтобы позволить внутричерепное давление, чтобы уравновесить.
    8. Вывести иглы медленно в течение 30 сек. Используйте ватный тампон, чтобы оказать давление на любое кровотечение, что может произойти.
    9. Приблизительная краев раны и закрыть разрез с помощью клея ткани. Администрирование 20 мкл Лидокаин подкожно в месте разреза. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 5 мышей, шаги 3.5.1-3.5.9 займет ~ 50 мин. UNC IACUC одобрил послеоперационную использование только местной анестезии. Консультации с местных институциональных IACUC рекомендуется в отношении требований к послеоперационной анальгетиков после этой процедуры.
  6. Послеоперационный уход
    1. Поместите животных в чистой, теплой клетке, чтобы оправиться. Животные не должны быть размещены непосредственно в постельных принадлежностях, как может произойти случайно стремление.
    2. Соблюдайтеживотные для возобновления нормального поведения, такие как уход, ел, и дефекации. ПРИМЕЧАНИЕ: Возобновление нормального поведения может занять ~ 60 мин.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы разработали модель системы nGEM с корковых астроциты и НСК найденным новорожденных GEM укрывательство floxed условные онкогенные аллели, которые могут быть фенотипически характеризующиеся в пробирке и в естественных (Рисунок 1). Для того чтобы исследовать последствия онкогенных мутаций специально корковой астроцитов в пробирке, очень важно, чтобы сначала обогащения астроцитов. Кортикальные астроцитов урожаи содержат смесь микроглии, астроциты, олигодендроциты, OPC, и нейрон...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наиболее важные шаги для обеспечения надлежащего урожай и культуру корковых астроциты 1), чтобы вырезать кору, не принимая ткани ниже мозолистого тела, 2) для удаления оболочки мозга, 3), чтобы тщательно отделить клетки, и 4) для обогащения GFAP + астроциты. Хотя мы использовали механический (встряхивания) и генетический (ограничение генетической рекомбинации с вектором Ad5GFAPCre или использования доминирующего преобразующей трансгена (TgGZT 121) под контролем промотора GFAP) мет...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRM — клинический исследователь Деймона Раньона-Genentech. Эта работа была поддержана, в частности, грантами CRM от Фонда исследования рака Деймона Раньона (CI-45-09), Министерства обороны (W81XWH-09-2-0042) и Фонда исследования рака Университета Северной Каролины (UCRF). Авторы выражают благодарность Даниэлю Роту за помощь в выращивании мышей. Авторы также хотели бы поблагодарить Ханну Чэ, Картера Маккормика, Деми Канутас, Стефани Джиллетт и Сюзанну Кром за помощь в культивировании тканей и иммунофлуоресценции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Модифицированную Eagle Medium (DMEM) (1X)Invitrogen11995065DMEM также можно приобрести у других поставщиков, включая GIBCOSigma и Cellgro
Фетальная бычья сыворотка, RegularCellgro35-010-CV
Пенициллин-стрептомицинInvitrogen15140122
остроконечные ножницы для препарированияFisher Scientific08-395
Хрящевые щипцы для большого пальца, изогнутыеFisher Scientific1631
Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Щипцы, тонкие, 4милтекса17-301
этанол (200 пруф)Decon Labs2710
Бритвенные лезвияVWR55411-050
Сбалансированный раствор соли Хэнкса (HBSS) (1x), жидкийInvitrogen14175-095
TrypLE Express (1x), Фенол КрасныйИнвитроген12605-010Другие растворы трипсина также подходят для кортикальных астроцитов и культур Чашка
для культуры, 60 x 15 ммThomas Scientific9380H77
15 мл ПробиркиBD Biosciences352096
50 мл ПробиркиBD Biosciences352070
Аденовирус стокПеренос генов Vector Core, U. IowaAd5CMVCreStore in 5 & micro; Опасно. Используйте меры предосторожности Bsl2
Сульфат натрия (Na2SO4) Сигма-Олдрич238597
Сульфат калия (K2SO4)Sigma-Aldrich221325
Хлорид магния (MgCl2)Sigma-AldrichM8266
Хлорид кальция (CaCl2)Sigma-Aldrich746495
HEPES калийная сольСигма-ОлдричH0527
D-(+)- глюкозаСигма-ОлдричG8270 
Фенол красныйSigma-AldrichP3532
Гидроксид натрия (NaOH)Sigma-AldrichS5881
PapainWorthingtonLS003127
L-Cysteine-HClSigma-AldrichC1276
Шприцевой фильтр (0.22 &микро; m размер пор)MilliporeSLGP033NS
набор для пролиферации Neurocult, мышиныйStemcell Technologies5702Этот набор содержит базальную среду NeuroCult NSC и добавку NeuroCult NSC, необходимую для культуры NSC
0,2% раствор гепаринаStemcell Technologies7980
EGF ИнвитрогенPMG8041
bFGF InvitrogenPHG0261
сбалансированный раствор соли Хэнкса (HBSS) (10x)Invitrogen14185-052
Сульфат магния (MgSO4)Sigma-AldrichM7506
Бикарбонат натрия (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761
E-64Sigma-AldrichE3132Сделайте 10 mM stock in ДМСО, хранить при -20 °°; C
6-луночные планшетыFisher Scientific07-200-83
Клеточный фильтр (40 & микро; m размер пор)Corning352340
Раствор для диссоциации стволовых клетокStemcell Technologies5707В качестве альтернативы используйте щадящие растворы ферментов, такие как Accutase
Methyl целлюлоза 15 cPSigma-AldrichM7027
Dulbecco's Modified Eagle's Media 2xMilliporeSLM-202-BДля приготовления 5% раствора метилцеллюлозы
1,7 мл Snap Cap Микроцентрифужная пробиркаCorning3620
Шприц Hamilton, 250 и микро; l LT без иглыFisher Scientific14-815-92
PB600-1 Дозатор антигенаHamilton  83700
Иглы одноразовые 18 гFisher ScientificNC9015638
27 га 1/2" игла с люэровским наконечникомFisherScientific 14-826-48
2,2,2-трибромэтанол (Авертин)Sigma-AldrichT48402
БетадинFisher ScientificNC9386574
Puralube Офтальмологическая мазьFisher Scientific
Стереотаксическая рама модели 900Kopf Instruments
VETBONDFisher ScientificNC9259532 Тканевый адгезив 
Лидокаин ShopMedVetRXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQueous One Solution Анализ пролиферации клеток (MTS)PromegaG3580
Anti-Sox2MilliporeAB5603
Поликлональный кролик антиглиальный фибриллярный кислый белок (GFAP)DakoZ0334 
IVIS KineticPerkinElmerДля in vivo визуализация
D-люциферин - K+ соль биолюминесцентный субстратPerkinElmer122796Для биолюминесцентной визуализации in vivo биолюминесцентная визуализация
EdU Imaging KitInvitrogenC10340
MSCV Luciferase PGK-hygroAddgene18782
NC9689910

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dolecek, T. A., Propp, J. M., Stroup, N. E., Kruchko, C. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009. Neuro Oncol. 14, suppl 5 1-49 (2012).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal Of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  3. Giese, A., Bjerkvig, R., Berens, M. E., Westphal, M. Cost of migration: invasion of malignant gliomas and implications for treatment. J. Clin. Oncol. 21 (8), 1624-1636 (2003).
  4. Miller, C. R., Perry, A. Glioblastoma. Arch. Pathol. Lab. Med. 131 (3), 397-406 (2007).
  5. Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), Cancer Genome Atlas Research Network. 1061-1068 (2008).
  6. Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
  7. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  8. Phillips, H. S., et al. Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis. Cancer Cell. 9 (3), 157-173 (2006).
  9. Vitucci, M., Hayes, D. N., Miller, C. R. Gene expression profiling of gliomas: merging genomic and histopathological classification for personalised therapy. Br. J. Cancer. 104 (4), 545-553 (2011).
  10. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
  11. Schmid, R. S., Vitucci, M., Miller, C. R. Genetically engineered mouse models of diffuse gliomas. Brain Res. Bull. 88 (1), 72-79 (2012).
  12. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
  13. Sonoda, Y., et al. Formation of intracranial tumors by genetically modified human astrocytes defines four pathways critical in the development of human anaplastic astrocytoma. Cancer Res. 61 (13), 4956-4960 (2001).
  14. Mao, X. G., et al. LIN28A facilitates the transformation of human neural stem cells and promotes glioblastoma tumorigenesis through a pro-invasive genetic program. Oncotarget. 4 (7), 1050-1064 (2013).
  15. Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat. Rev. Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
  16. Miller, C. R., Williams, C. R., Buchsbaum, D. J., Gillespie, G. Y. Intratumoral 5-fluorouracil produced by cytosine deaminase/5-fluorocytosine gene therapy is effective for experimental human glioblastomas. Cancer Res. 62 (3), 773-780 (2002).
  17. Becher, O. J., Holland, E. C. Genetically engineered models have advantages over xenografts for preclinical studies. Cancer Res. 66 (7), 3355-3358 (2006).
  18. Huse, J. T., Holland, E. C. Genetically engineered mouse models of brain cancer and the promise of preclinical testing. Brain Pathol. 19 (1), 132-143 (2009).
  19. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  20. Li, A., et al. Genomic changes and gene expression profiles reveal that established glioma cell lines are poorly representative of primary human gliomas. Mol. Cancer Res. 6 (1), 21-30 (2008).
  21. Vries, N. A., Beijnen, J. H., van Tellingen, O. High-grade glioma mouse models and their applicability for preclinical testing. Cancer Treat. Rev. 35 (8), 714-723 (2009).
  22. Clark, M. J., et al. U87MG decoded: the genomic sequence of a cytogenetically aberrant human cancer cell line. PLoS Genet. 6 (1), (2010).
  23. Carvalho, A. C., et al. Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo. Stem Cells. 28 (2), 181-190 (2010).
  24. Yost, S. E., et al. High-resolution mutational profiling suggests the genetic validity of glioblastoma patient-derived pre-clinical models. PLoS One. 8 (2), (2013).
  25. Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 7 (2), 164-176 (2005).
  26. Rich, J. N., Guo, C., McLendon, R. E., Bigner, D. D., Wang, X. F., Counter, C. M. A genetically tractable model of human glioma formation. Cancer Res. 61 (9), 3556-3560 (2001).
  27. Chow, L. M., et al. Cooperativity within and among Pten, p53, and Rb pathways induces high-grade astrocytoma in adult brain. Cancer Cell. 19 (3), 305-316 (2011).
  28. Song, Y., et al. Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).
  29. Werder, A., Seidler, B., Schmid, R. M., Schneider, G., Saur, D. Production of avian retroviruses and tissue-specific somatic retroviral gene transfer in vivo using the RCAS/TVA system. Nat. Protoc. 7 (6), 1167-1183 (2012).
  30. Vitucci, M., et al. Cooperativity between MAPK and PI3K signaling activation is required for glioblastoma pathogenesis. Neuro Oncol. 15 (10), 1317-1329 (2013).
  31. Yahanda, A. M., Bruner, J. M., Donehower, L. A., Morrison, R. S. Astrocytes derived from p53-deficient mice provide a multistep in vitro model for development of malignant gliomas. Mol. Cell. Biol. 15 (8), 4249-4259 (1995).
  32. McEllin, B., et al. PTEN loss compromises homologous recombination repair in astrocytes: implications for glioblastoma therapy with temozolomide or poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors. Cancer Res. 70 (13), 5457-5464 (2010).
  33. Kim, H. S., et al. Gliomagenesis arising from Pten- and Ink4a/Arf-deficient neural progenitor cells is mediated by the p53-Fbxw7/Cdc4 pathway, which controls c-Myc. Cancer Res. 72 (22), 6065-6075 (2012).
  34. Radke, J., Bortolussi, G., Pagenstecher, A. Akt and c-Myc induce stem-cell markers in mature primary p53(-)/(-) astrocytes and render these cells gliomagenic in the brain of immunocompetent mice. PLoS One. 8 (2), (2013).
  35. Marino, S., Vooijs, M., Der Gulden, H. van, Jonkers, J., Berns, A. Induction of medulloblastomas in p53-null mutant mice by somatic inactivation of Rb in the external granular layer cells of the cerebellum. Genes Dev. 14 (8), 994-1004 (2000).
  36. Zhu, Y., et al. Ablation of NF1 function in neurons induces abnormal development of cerebral cortex and reactive gliosis in the brain. Genes Dev. 15 (7), 859-876 (2001).
  37. Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
  38. Xiao, A., Wu, H., Pandolfi, P. P., Louis, D. N., Van Dyke, T. Astrocyte inactivation of the pRb pathway predisposes mice to malignant astrocytoma development that is accelerated by PTEN mutation. Cancer Cell. 1 (2), 157-168 (2002).
  39. Xiao, A., Yin, C., Yang, C., Di Cristofano, A., Pandolfi, P. P., Van Dyke, T. Somatic induction of Pten loss in a preclinical astrocytoma model reveals major roles in disease progression and avenues for target discovery and validation. Cancer Res. 65 (12), 5172-5180 (2005).
  40. Neill, K., Lyons, S. K., Gallagher, W. M., Curran, K. M., Byrne, A. T. Bioluminescent imaging: a critical tool in pre-clinical oncology research. J. Pathol. 220 (3), 317-327 (2010).
  41. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  42. Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. (47), (2011).
  43. Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J. Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
  44. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  45. Miller, C. R., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K. A genetically-defined, orthotopic allograft model system of glioblastoma: Pathological features and experimental therapeutics. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69 (5), 522(2011).
  46. Bash, R., et al. Concurrent temozolomide-external beam radiation therapy is effective for experimental glioblastomas in an orthotopic, genetically engineered syngeneic mouse allograft model system. Neuro Oncol. 11 (5), 638(2009).
  47. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J. Neurosci. Meth. 150 (1), 128-137 (2006).
  48. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
  49. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
  50. Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).
  51. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu. Rev. Physiol. 75, 685-705 (2013).
  52. Sirko, S., et al. Reactive glia in the injured brain acquire stem cell properties in response to sonic hedgehog. Cell stem cell. 12 (4), 426-439 (2013).
  53. Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis. Nat. Rev. Neurosci. 12 (2), 88-104 (2011).
  54. Burrell, K., Agnihotri, S., Leung, M., Dacosta, R., Hill, R., Zadeh, G. A novel high-resolution in vivo imaging technique to study the dynamic response of intracranial structures to tumor growth and therapeutics. J. Vis Exp. e50363 (76), (2013).
  55. Sottoriva, A., et al. Intratumor heterogeneity in human glioblastoma reflects cancer evolutionary dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4009-4014 (2013).
  56. Snuderl, M., et al. Mosaic amplification of multiple receptor tyrosine kinase genes in glioblastoma. Cancer Cell. 20 (6), 810-817 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Cre

Похожие статьи