Tissue-моделирования Фантомы для оценки потенциального ближней инфракрасной флуоресценции визуализации приложений в хирургии рака молочной железы

С сохранением молочной железы хирургия (BCS) с последующей лучевой терапией является стандартом лечения для больных раком молочной железы с Т ₁ -T ₂ карциномы молочной железы ^1,2. Неточности в интраоперационной оценки степени результате операции в положительного хирургического края в 20 до 40% пациентов, перенесших БКС, требуя дополнительного хирургического вмешательства или лучевой терапии ^3,4,5. Хотя обширная резекция прилегающей здоровой ткани молочной могут уменьшить частоту положительного хирургического края, это также будет препятствовать косметический результат и увеличить коморбидности ^6,7. Новые методы Поэтому требуются обеспечить интраоперационной обратную связь на месте первичной опухоли и степени хирургии. Оптический изображений, в частности в ближней инфракрасной флуоресценции (NIRF) изображений, может уменьшить частоту положительного хирургического края следующих БКС, предоставляя хирургу инструмент для предварительного и интраоперационного локализации опухоли в гEAL времени. В последнее время наша группа сообщила о первом в-человеческие суда над опухолью целевой флуоресцентных изображений в больных раком яичников, показывая возможности этой техники для обнаружения первичных опухолей и метастазов интраперитонеальные с высокой чувствительностью ^8. Прежде чем приступить к клинических исследований у пациентов с раком молочной железы, однако, возможность различных NIRF приложений обработки изображений опухолевых-мишенью в БКС может уже быть оценены доклинического использованием фантомов.

Следующий протокол исследования описывает использование изображений NIRF в ткани-моделирования груди фантомов, содержащих флуоресцентные опухолевых-моделирования включений ^9. Призраки обеспечить недорогой и универсальный инструмент для моделирования до и интраоперационная локализация опухоли, в режиме реального времени NIRF наведением резекция опухоли, оценку состоянии хирургического края, и обнаружение остаточного заболевания. В желатиновых фантомы имеют упругие свойства, аналогичные ткани человека, и могут быть сокращены с использованием обычного Surgical инструменты. В моделируемой хирургической процедуры, хирург ориентируется на тактильной информации (в случае пальпируемых включений) и визуального осмотра на операционном поле. Кроме того, изображения NIRF применяется, чтобы обеспечить хирургу в режиме реального времени интраоперационной обратной связи о масштабах операции.

Следует подчеркнуть, что изображения NIRF требуется использование флуоресцентных красителей. В идеале, флуоресцентные красители должны быть использованы, что испускают фотоны в ближней инфракрасной области спектра (650 - 900 нм), чтобы свести к минимуму поглощение и рассеяние фотонов молекул физиологически обильными в тканях (например, гемоглобин, липиды, эластин, коллаген, и вода) ^10,11. Кроме того, аутофлюоресценция (т.е. собственная флуоресценция активность в тканях за счет биохимических реакций в живых клетках) сводится к минимуму в ближней инфракрасной области спектра, в результате чего оптимальных соотношениях опухоли до-фоне ^11. По конъюгации NIRF красители для опухоли-щитомTed фрагменты (например, моноклональные антитела), направленной доставки флуоресцентных красителей могут быть получены для применения интраоперационной визуализации.

Как человеческий глаз нечувствителен к свету в ближней инфракрасной области спектра, высокочувствительным камеры требуется устройство для работы с изображениями NIRF. Несколько системы визуализации NIRF для интраоперационной использования были разработаны до сих пор ^12. В текущем исследовании, мы использовали обычай строить систему формирования изображения NIRF, который был разработан для интраоперационной применения в сотрудничестве с Техническим университетом Мюнхена. Система позволяет одновременно приобретение цветных изображений и флуоресценции изображений. Для повышения точности флуоресценции изображений, схема коррекции реализуется для изменения интенсивности света в ткани. Подробное описание обеспечивается Themelis соавт. ¹³

1 Создать Силиконовые формы для опухолевых-моделирования включений

1. Сбор твердых предметы нужной формы и размера, которые могут служить в качестве моделей для опухолевых-моделирования включений, например, бисером или мрамора.
2. Тщательно очистите моделей опухолей. Чтобы обеспечить легкое удаление из силиконовые формы, модели опухоли могут быть распылены с антипригарным спреем или покрытые тонким слоем вазелина или пчелиный воск.
3. Поместите каждую модель в отдельном тонкостенных квадратного (пластиковую) коробки с гладкой поверхностью. При необходимости зафиксировать модель на дне коробки, чтобы держать его на месте. Используйте коробку, которая немного больше, чем модели опухоли самого, чтобы не тратить чрезмерное количество силикона.
4. Налейте необходимое количество силиконового компонента А в миске и добавить силикон компонент В в соотношении 10: 1 по весу. Смешайте оба компонента тщательно. По желанию, вакуумный насос может быть использован, чтобы удалить пузырьки воздуха из силиконовой смеси.
5. Аккуратно роур силиконовую смесь в пластиковой коробке, чтобы предотвратить образования пузырьков. Силиконовая смесь должна быть обработана в течение 45 мин для получения оптимальных результатов.
6. Пусть силиконовой смеси затвердеть в течение по крайней мере 6 часов перед резкой формы и удаление модели опухоли. Необязательно, силиконовые формы может быть сокращена в зигзагообразным образом, чтобы позволить ему, чтобы соответствовать вместе чисто. Максимальная сила силикона получается через 3 дня.

2 Создание трис-буферный солевой раствор

1. Создание трис-буферный солевой раствор (TBS) раствор путем добавления 6,1 г (50 ммоль) Трис и 8,8 г (150 мМ NaCl) до 800 мл деионизированной воды.
2. Добавить 1,0 г (15 ммоль) NaN _3, чтобы блокировать кислородом гемоглобина (шаг 3.3 и 4.4) и ингибировать рост бактерий. ВНИМАНИЕ: NaN ₃ является сильный яд. Это может быть смертельным при контакте с кожей или проглатывании. Токсичность этого соединения сравнима с растворимых щелочных цианидов и летальной дозы для взрослого человекасоставляет около 0,7 г. Всегда следуйте инструкции по технике безопасности, как это предусмотрено заводом-изготовителем.
3. Отрегулируйте рН до 7,4 и довести объем до 1000 мл деионизованной воды.

3 Создание Флуоресцентные включений

1. Добавить 2 г агарозы 50 мл TBS с шага 2 выше точки плавления агарозы по сравнению с желатином (шаг 4.2) будет препятствовать включений из растворения и утечка флуоресцентный краситель при размещении в топленом желатина. Дополнительно, количество добавленного агарозы может быть изменена до 1 или 3 г, чтобы получить более мягкие или ощутимые включений опухолевые, соответственно.
2. Нагреть агарозном суспензии с использованием микроволновой печью, пока температура кипения не будет достигнута. Тщательно перемешайте, пока агарозном полностью не растворится.
3. Добавить 1,1 г (17 мкмоль) гемоглобин и 5 мл 20% Intralipid, растворенного в 50 мл TBS в агарозном смеси при постоянном перемешивании, чтобы походить на оптические характеристики окружающей ткани молочной железы фантомным (этап 4).
4. Добавить 20,0 мг (250,8 мкмоль) флуоресцентным красителем индоцианина зеленого в 83,8 мл деионизированной воды. Убедитесь, что краситель полностью не растворится.
5. Внесите 5,0 мл от этого решения и добавить его в агарозном смеси с получением конечной концентрации 14 мкМ. При желании, другие флуоресцентные красители, чем МКГ может быть использован при желании с их собственной оптимальной концентрации.
6. Аккуратно заполнить силиконовые формы, созданные на шаге 1 с горячей агарозном смеси с помощью шприца (рисунок 1А). Повторите этот процесс, пока все формы не заполнены.
7. Пусть флуоресцентные включений затвердеть при комнатной температуре в течение приблизительно одного часа. Защитите включений из света, покрывая всю форму алюминиевой фольгой.
8. После застывания, аккуратно откройте форму и выдавите включение (Рисунок 1В). При желании, использовать наконечник шприца для применения небольших капель расплавленного агарозном смеси на поверхности включения. Повторяя эту процедуру несколько раз на том же месте, небольшой туMor шпоры могут быть созданы для имитации инфильтративные опухоли.
9. Защитите агарозном включений из света и обезвоживания, обернув их в алюминиевую фольгу и храните их во влажной контейнер для хранения при 4 ° С.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование концентрации более низкой или высокой флуоресцентного красителя, чем известные оптимальная концентрация будет как приведет к снижению интенсивности флуоресцентного сигнала. Казалось бы противоречит здравому смыслу уменьшение интенсивности сигнала при увеличении концентрации красителя выше оптимальной концентрации флуоресцентного красителя обусловлено явление, известное как закалки. При оценке максимальной глубину проникновения флуоресцентного красителя в призраков, используя оптимальную концентрацию является обязательным.

4 Создание Груди Фантомы

1. Получить чашеобразную форму, чтобы создать груди фантомы нужного размера и объема, например, стеклянной или пластиковой миске. Пресс-форма должна иметь гладкую поверхность, чтобы предотвратить желатин форму прилипшей к пресс-форме. Плесень Volumе 500 мл создаст груди фантомы достаточного размера.
2. Чтобы создать молочной фантом с объемом 500 мл, добавляют 50 г желатина 250 цвету до 500 мл TBS (шаг 2). Нагреть желатин суспензии до 50 ° С при постоянном перемешивании.
3. После того, как желатин полностью не растворится, пусть желатин смесь постепенно остыть и поддерживать его при постоянной температуре 35 ° С с использованием горячей водяной бане.
4. При постоянном перемешивании, добавить 5,5 г (85 ммоль) бычьего гемоглобина и 25 мл интралипида 20% для имитации поглощение и рассеяние фотонов в ткани, соответственно.
5. Prechill в чашеобразную форму при 4 ° С в течение по меньшей мере 1 часа. Далее, заливают смесь желатина в кристаллизаторе до уровня, который соответствует заранее определенной глубине в агарозном опухоли-имитации включения (рисунок 1С). Пусть желатин смесь затвердевает при 4 ° С в течение 30 мин до одного часа.
6. После затвердевания, позиционировать опухоли-моделирования флуоресцентный агарозном включение на поверхности призрак и временно фиксируют включение с тонкой иглы. До максимум трех опухолевых-моделирования флуоресцентных включений могут быть включены в один фантом молочной железы. Достаточно места (по крайней мере, 5 см) должны храниться между отдельными опухолевых-моделирования включений (Рисунок 1D).
7. Налейте остаток теплого желатина смеси в остальной объем пресс-формы, обеспечивая сцепление обоих слоев не создавая преломления артефакты. Отметьте местоположение флуоресцентных опухолевых-моделирования включений на форму. Пусть призрак укрепить O / N при 4 ° С.
8. После того, как затвердевший, удалить иглы, используемые для временной фиксации включений и осторожно удалите молочной фантом от его формы (Рисунок 1E). Защитите молочной фантом от света и обезвоживания, обернув его в алюминиевую фольгу и хранить его в увлажненной контейнер для хранения при 4 ° С.

Юр 1 "FO: контент-ширина =" 5 дюймов "SRC =" / файлы / ftp_upload / 51776 / 51776fig1highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 1 последовательные стадии создания молочной железы фантомы, содержащих люминесцентные опухолевые-моделирования включений. После создания силиконовые формы на желаемой формы и размера, формы заполнены расплавленным агарозном смеси с помощью шприца (A). Опухолевые-моделирования включения различного размера и формы были произведены в текущем исследовании (B). Далее, тонкий слой расплавленного желатина смеси заливают в заказной покрытием из дерева молочной пресс-формы (С). После затвердевания, опухолевые-имитации включения расположены, временно фиксироваться, и покрыт другим слоем расплавленного желатина смеси (D). После затвердевания, молочной фантомное осторожно удаляют из формы (E). Призрак может применяться для моделирования различных NIRF приложений обработки изображений (F).ссылка = "/ файлы / ftp_upload / 51776 / 51776fig1highres.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

5 Установите камеры системы NIRF

1. Система камеры NIRF для интраоперационной применения требуется для моделирования целевой визуализации NIRF в хирургии рака молочной железы. Несколько системы визуализации NIRF для реального времени изображений интраоперационная NIRF в настоящее время доступны для исследуемого использования. Хотя некоторые различия между этими устройствами существует, все они содержат источник света возбуждения (для возбуждения флуоресцентных включений опухолевых) и высокочувствительный изображений устройство для обнаружения испускаемых фотонов.
2. Убедитесь использовать источник света возбуждения достаточного волны. Для опухолевых-моделирования включений, содержащих МКГ, использовать возбуждения источника света (например, лазерный), который излучает фотоны между 750 и 800 нм. Если используется альтернативный флуоресцентный краситель, длина волны возбуждения должна быть скорректирована соответствовать мА Инструкция nufacturer в.
3. В случае, если система камеры NIRF содержит фильтр выбросов отфильтровать нежелательные фоновые сигналы, убедитесь, что правильно фильтр используется. Для опухолевых-моделирования включений, содержащих МКГ, использовать фильтр выбросов между 800 и 850 нм. Альтернативные флуоресцентные красители могут потребоваться различные фильтры выбросов, в зависимости от инструкции производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что есть без перекрытия между возбуждением и длиной волны излучения по предотвращению пересыщенных изображения. Кроме того, время захвата изображений, возможно, придется быть отрегулирована, чтобы получить оптимальные флуоресцентные изображения. В случае глубинных люминесцентных включений или слабых флуоресцентных сигналов, время захвата изображений может быть увеличена до нескольких сек до минимальной. В случае поверхностных включений или сильных флуоресцентных сигналов, время обнаружения может быть уменьшена до нескольких миллисекунд, чтобы обеспечить видео-курса флуоресценции изображений в реальном времени.

1. Возьмите ткани-моделирования груди фантом от своего контейнера и поместите его на ровную нефлуоресцентный поверхности. Далее, установите устройство обработки изображений NIRF над молочной фантома, оставляя достаточное рабочее расстояние для иссечения опухоли-моделирования включений.
2. Локализации опухоли-моделирования флуоресцентный включение используя NIRF изображений и / или пальпация фантомного груди. В случае, если нет флуоресцентный сигнал не может быть обнаружен, включение либо расположены слишком глубоко в фантоме для обнаружения или время захвата изображения должно быть увеличено.
3. После того, как включение локализован, надрезать фантомное грудь и удалить опухоль имитации включение под реального времени NIRF-руководством, используя обычные хирургические инструменты. С другой стороны, включение можно вырезать руководствоваться исключительно путем осмотра и пальпации молочной фантома для имитации стандарт оказания медицинской помощи.
4. Непосредственно после удаленияопухолевой-моделирования включения, изображение хирургическое полости для любого оставшегося флуоресцентного деятельности с указанием неадекватное удаление.
5. В случае любого оставшегося флуоресцентного деятельности, вырезать включение остаток при прямом NIRF руководством пока не флуоресцентный сигнал не осталось.
6. Изображение Исключены фрагменты фантомные имитировать NIRF наведением оценку макроскопического состояния маржи. К этому, нарезать фантомное ткани в 3 - 5 мм бляшек и изображения бляшки соответственно. Флуоресценции сигнал, достигающий в хирургических краев указывает на существование положительного хирургического края.

Результаты этого исследования были ранее зарегистрированы в других местах 9.

Наши данные показывают, что изображения NIRF может применяться для обнаружения люминесцентных опухолевых-моделирования включений в ткани-моделирования груди фантомов, имитируя NIRF наведением хирургии с сохранением молочной железы у больных раком молочной железы. Использование нашу модель фантомное, мы обнаружили, интраоперационной локализации опухоли, NIRF наведением резекция опухоли, интраоперационной оценки хирургического края полости, и обнаружение остаточного заболевания нецелесообразна (рисунок 2). Вкратце, в общей сложности четыре фантомных груди были произведены, все содержащий два флуоресцентных включений с различными размерами и / или морфологии (Таблица 1).

Флуоресцентные опухолевые-имитации включения были удалены хирургическим путем из первого и второго фантома молочной железы с использованием обычных хирургических инструментов. Удаление включений руководствовался пальпации и визуального осмотра OPERATив поле. Хирург попросили работать на фантомного груди до опухолевые-моделирования включений не были полностью удалены. Далее, настроены флуоресценции камеры был применен для сканирования хирургического полость для оставшихся флуоресцентных сигналов. В случае неполного удаления, указанном сильной оставшегося сигнала флуоресценции, хирург было предложено, чтобы вырезать включение остаток под реальном времени NIRF наведения. В обоих фантомного # 1 и # 2, удаления одной из двух опухолевых-моделирования включений была неполной, о чем свидетельствует сильной оставшейся флуоресценции сигнала, приходящего из хирургической полости. В случае неполного удаления после первого хирургического попытке, хирург обнаружены и вырезали остатку включение под NIRF руководством в течение того же процедуры (так называемый theranostic). Reexcision под прямым NIRF руководством привело к полному удалению включения остатка на второй хирургической попытки во всех случаях, в то время как не было никакой необходимости, чтобы вырезать большое VolumЭС фантомного ткани.

В третьем и четвертом фантома молочной железы, NIRF наведением локализацию и хирургическое удаление флуоресцентных включений проводили при первой попытке хирургической. При приближении опухолевые-моделирования флуоресцентных включений, хирург был монитор в своем распоряжении, на котором сигнал флуоресценции прогнозируемого в режиме реального времени. В четвертом фантома груди, опухоль имитации включение расположены на 3,0 см глубина была только обнаружить после рассечения фантомного ткани примерно 1 см. В третьем фантома молочной железы, как опухолевые-моделирования включений были радикально удалены в первой попытке хирургической, в то время как удаление одного инфильтративно включения в четвертом фантома было обнаружено, что неполные. Reexcision под прямым NIRF-руководством привело к полному удалению остатков опухоли в этом фантоме.

В послеоперационном периоде, вырезанные фрагменты фантомные ткани разрезали на 3 мм слайдов и отображаемого с помощью камеры сис NIRFма для имитации экс естественных макроскопического оценку состоянии хирургического края. Во всех случаях, послеоперационная томография NIRF четко изображены границы опухолевых-моделирования включений и указал ли опухоль-остаток присутствовал на хирургического края (Рисунок 2C).

Рисунок 2 NIRF моделирования изображений в груди фантомов. Ткани-моделирования груди фантомы, содержащие флуоресцентные опухолевых-моделирования включений были применены для моделирования интраоперационной локализации опухоли (А), NIRF наведением удаление опухоли (B), и NIRF наведением оценку хирургического края Статус (С). Изменен из:.. Pleijhuis др, EJSO (2011) Plоблегчить нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1 Обзор фантомного состава.
В общей сложности 4 призраков были произведены, содержащий два опухолевых-моделирования флуоресцентные включений друг различного размера и формы.

Авторы не имеют ничего раскрывать.