Здесь мы опишем эффективный метод изоляции, идентификации и очистки мыши тимуса эпителиальных клеток (ТИК). Протокол может быть использован для изучения функции тимуса для нормального развития Т-клеток тимуса, дисфункции и восстановления Т-клеток.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение, идентификация, и очистка мышиного тимуса эпителиальных клеток
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Тимус является жизненно важным органом для развития Т-лимфоцитов. Из тимуса стромальных клеток, тимуса эпителиальные клетки (ТИК) имеют особенно важное значение в нескольких этапах развития Т-клеток: Обязательство Т-клеток, положительно отбора и отрицательного отбора. Тем не менее, функция ТИК в тимусе остается полностью поняты. В статье, мы предлагаем способ, чтобы изолировать TEC подмножества из свежего тимуса мыши, используя комбинацию механического разрушения и ферментативного расщепления. Метод позволяет тимуса стромальных клеток и тимоцитов, чтобы быть эффективно выпущен из клетка-клетка и матричных соединений клеток с внеклеточным и образуют единую-клеточной суспензии. Использование изолированных клеток, цитометрии потока многопараметрических могут быть применены к идентификации и характеризации ТИК и дендритных клеток. Потому что ТИК являются редким клеточная популяция в тимусе, мы также описать эффективный способ обогатить и очистить ТИК истощая тимоцитов, самый распространенный тип клеток в тимусе. ФоллоКрыло обогащение, сортировки клеток время может быть уменьшено, так что потери жизнеспособности клеток может быть сведено к минимуму во время очистки ТЭМ. Очищенные клетки пригодны для различных последующих анализов, как Real Time-ПЦР, Вестерн-блоттинга и экспрессии генов профилирования. Протокол будет способствовать исследование функции TEC и, а также развитие в пробирке Т-клеток восстановления.
Введение
В начале развития Т-клеток, костного мозга гемопоэтических стволовых клеток, полученных предшественники мультипотентные рекрутируются в коре тимуса, пройти приверженность T линии и стать Т-клеток предшественников 1. В коре, Т-клеток-предшественников CD4 и CD8 Double Negative (DN) тимоциты расширить и дифференцировать в незрелых CD4 и CD8 двойной положительный (DP) тимоцитов, образуя большой пул предшественников с сильно варьирует Т клеточных рецепторов 1. Только выберите MHC-ограничено подмножество DP клеток станет CD4 или CD8 сингл положительные (SP) тимоциты, мигрируют в костный мозг тимуса, и дифференцируются в функционально компетентных зрел....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
В этом исследовании, взрослых - были использованы (6 8 недель) женщины C57Bl / 6 мышей. Мыши были приобретены у Национального института рака и поддерживается при определенных патогенов условиях. Университет Миннесоты институционального комитета уходу и использованию животных (IACUC) утвердил все экспериментов на животных.
1 Подготовка инструментов и буферов
- Готовят раствор фермента (RPMI1640 среды с 0,05% [вес / объем] из Liberase TH и 100 ед / мл ДНКазы I), альбумина, богатых буфера (1X PBS [Ca2 + / Mg 2 + -бесплатный] с 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты [ЭДТА])....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Используя этот протокол, тимус орган был удален из взрослой мыши (раздел 2) и вилочковой суспензии клеток получали, как описано в разделе 3 получены суспензии клеток состояла из тимоцитов, кроветворных стромальных клеток и некроветворных стромальных клеток. CD45 представляет собой гемопоэтические пан-маркер экспрессируется на обоих тимоцитов и гемопоэтических стромальных клеток, таких как макрофаги и дендритные клетки. В отличие от этого, ТИК не кроветворной происхождения и не выражают CD45 15. Окрашивание кл.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В протоколе, критические шаги являются подготовка тимуса стромальных клеток (раздел 3) и обогащение ТИК (раздел 4). Настоятельно рекомендуется, что свежий фермент раствор готовят каждый раз и ткань обрабатывают как можно скорее. Для объединенной Thymi, оптимизируя объем раствора фермента необходим в зависимости от количества Thymi. Если любая ткань остаток оставил после обработки, добавляя больше раствора фермента и расширение времени инкубации может увеличить урожайность клеток. При обогащении ТИК, комплектующих коллек.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке Национального института здравоохранения Грант R01 AI088209 (к KAH). Мы также благодарим Университет штата Миннесота проточной цитометрии ресурса.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Антимышиный EpCAM | eBioscience | XX-5791-YY* | Клон G8.8 |
| Антимышиный MHC II | eBioscience | XX-5321-YY* | Клон M5/114.15.2 |
| Антимышиный Ly51 | eBioscience | XX-5891-YY* | Клон 6C3 |
| UEA-1 | Векторная лаборатория | FL-1061 | |
| Проточный цитометр | BD Biosciences | LSRFortessa | |
| Проточный сортировщик клеток | BD Biosciences | FACSAria | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| программное обеспечение для анализа проточной цитометрии | TreeStar - Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| *XX зависит от флуорохрома, а YY зависит от размера флакона. |
Ссылки
- Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nat. Rev. Immunol. 8, 9-21 (2008).
- Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
