Взрослые структуры дрозофилы происходят от мешковидных структур, называемых имагинальными дисками. Анализ этих дисков дает представление о многих процессах развития, включая определение тканей, установление границ компартментов, пролиферацию клеток, спецификацию клеточной судьбы и планарную полярность клеток. Этот протокол используется для подготовки имагинальных дисков для световой/флуоресцентной микроскопии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Вскрытие и Иммуноокрашивание имагинальные диски из Дрозофилы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Значительная часть пост-эмбрионального развития дрозофилы, дрозофилы, происходит в рамках набора SAC-как структуры, называемые имагинальные диски. Эти диски порождают высокий процент взрослых структур, которые находятся в пределах взрослого лету. Здесь мы опишем протокол, который был оптимизирован для восстановления этих дисков и подготовить их для анализа с антителами, транскрипционных репортеров и белковых ловушек. Эта процедура лучше всего подходит для тонких тканей, таких как имагинальных дисках, но может быть легко модифицирована для использования с более толстыми тканей, таких как личиночной мозга и взрослых яичника. Письменное протокол и сопровождающие видео поможет читателя / зрителя через рассечения третьей возрастной стадии личинок, фиксации ткани и лечения имагинальных дисках с антителами. Протокол может быть использован, чтобы рассекать имагинальные диски от младшего личинок первой и второй возрастной стадии а. Преимущество этого протокола является то, что она является относительно коротким, и он имеет бытьан оптимизирован для сохранения высокого качества из рассеченной ткани. Еще одним преимуществом является то, что процедура фиксации, который используется хорошо работает с подавляющим числом антител, которые распознают Drosophila белки. По нашему опыту, есть очень небольшое количество чувствительных антител, которые не очень хорошо работают с этой процедурой. В таких ситуациях, появится средство, чтобы быть использовать альтернативный коктейль фиксации, продолжая следовать указаниям, которые мы, предъявляемым к шагов рассечение и инкубации антител.
Введение
Для более века плодовой мушки, дрозофилы, был главным система для изучения развития, поведение и физиологию. Развитие в лету можно разделить на две большие стадии: эмбриональных и пост-эмбриональных с большей частью последнего, происходящих в монослоя эпителия называемых имагинальные диски 1-3. Чертежи имагинальных дисках были впервые опубликованы в 1864 году Августом Вейсмана в рамках своего широкого монографии о развитии насекомых 1. Эти диски начинают свое развитие во время эмбриогенеза, по образцу в течение личиночной стадии, пережить массовое гистолиза ранних куколки, и в конечном итоге привести к высоким процент....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1 Подготовка личинок
- Заполните 35 мм чашки Петри с рассечение буфера.
- Поместите личинок в чашку Петри и дать им возможность плавать вокруг в течение нескольких минут (самоочищающиеся шаг).
- Трансфер личинок в пул рассечение буфера на основе силикона вскрытии пластины. Этот пул должна быть на одном краю пластины. Рассечение пластина состоит из силиконового раствора, который был наливают и закаленной в стеклянную чашку Петри.
- Использование Пастера-пипетки, разместить большее объединение рассечение буфера в середине вскрытии пластины.
- Использование # 5 щипцы, передачи одного очищенный личинку из небольшого бассейна на бо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Метод, описанный выше надежно производит высококачественный материал для анализа с в точке зондов, транскрипционных репортеров, белковых ловушек и антител. На рисунке 1 мы показываем глаз-антенны, генитальный, крыло, haltere и ног диски, которые обычно восстановленные с помощью этого метода. Эти диски были обработаны с фаллоидином-конъюгированного флуорофора, который связывается с F-актина и, следовательно, описание каждого элемента. Если ткань была зафиксирована должным образом, то морфогенети.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Хотя эта процедура в значительной степени сосредоточены на изоляции и последующего лечения глазных-усиков дисков, она поддается используется выделить и проанализировать крыло, haltere, ногу и генитальные диски (Рисунок 4). Единственным обязательным модификация протокола для выделения этих дисков (в отличие от глаз-усиков диска) является метод грубой вскрытия (раздел 2 протокола). Первый грудной ноги (Т1) пара находится в передней части личинки и могут быть восстановлены с помощью следующих протокол для .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Дональда Ready и Кевин Моисею для обучения JPK оригинальный имагинальную процедуру диск рассечение. Мы также благодарим Бонни Weasner для половых диска в рисунке 1b и глаз диска в рисунке 2А, Брэндон Weasner для рисунке 3, Блумингтон дрозофилы со Центр лету пятен и Развивающие Исследования Hybridoma банк антител. CMS была поддержана стипендией от Национальных институтов здравоохранения (NIH) GCMS подготовки Гранта (T32-GM007757), Фрэнк У. Патнэм исследовательский грант, и исследовательский грант Роберт Бриггс. JPK поддерживается грантом Национального института глаза (R01 EY014863)
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Sylgard 184 Набор силиконовых эластомеров | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0,5 КГ | Используется для создания основы для пластины для препарирования |
| Pryex Glass Petri Dish 150 x 20 мм | Dow Corning | 3160-152CO | Используйте крышку для препарирования пластины |
| #5 Щипцы для препарирования | Ted Pella | 525 | Щипцы должны быть очень острыми |
| 9 хорошо часовое стекло | Vairous Vendors | Используется для фиксации имагинальных дисковых комплексов | |
| 50 мл Колба Эрленмейера | Различные производители | ||
| Маленькая мешалка | Различные поставщики | Достаточно маленькая, чтобы поместиться в колбу Эрленмейера | |
| 50 мл Конические пробирки | Различные производители | ||
| 1,5 мл Пробирки Microfuge | Различные производители | Прозрачные или темные в зависимости от применения | |
| Штатив | для микрофугеразличные поставщики | ||
| настольных ротаторов | различных поставщиков | 100 μ l объем не должен разбрызгиваться при низких настройках | |
| Параформальдегид | Macron Chemicals | 2-26555-1 | Служит фиксатором |
| Фосфат натрия Одноосновной | Sigma Chemical Co | S-3139 | Используется для изготовления буферов для рассечения и промывки |
| Фосфат натрия Dibasic | Sigma Chemical Co | 71636 | Используется для изготовления буферов для вскрытия и промывки |
| Лизин | Acros Organics | 125221000 | Используется в фиксирующем растворе |
| Периодат натрия | Sigma Chemical Co | S-1878 | Используется в фиксирующем растворе |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | MTX1568-1 | Используется для перфорации имагинальных дисков |
| Гидроксид натрия | EM Science | SX0593-3 | Используется для растворения параформальдегида |
| 100% Нормальная козья сыворотка | Laboratories | 005-000-121 | Служит блокирующим раствором |
| Первичные антитела | Различные поставщики | Разводить в 10% козьей сыворотке в соответствии с указаниями производителя | |
| Вторичные антитела | Различные поставщики | разводить в 10% козьей сыворотке в соответствии с указаниями производителя | |
| Vectashield | Молекулярные зонды | H-1000 | Предотвращает обесцвечивание образцов |
| Предметные стекла микроскопа | Fischer Scientific | 48312-003 | |
| Стеклянные покровные стекла 18 x 18 мм | Fischer Scientific | 12-542A | |
| Kimwipe Tissue | Различные поставщики | Предотвращает прилипание стеклянных стекол к силиконовой основе | |
| Panit Brush 000 | Различные поставщики | Используйте для аккуратного опускания покровного стекла на образцы |
Ссылки
- Weismann, A. Die nachembryonale entwicklung der Musciden nach beobachtungen an Musca vomitoria und Sarcophaga carnaria. Zeit. Wiss. Zool. 14, 187-336 Forthcoming.
- Cohen, S. M. Imaginal disc development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 747-841 (1993).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
