Быстрое Анализ хромосомных аберраций в Mouse-лимфоцитов на PNA-FISH

Краткое содержание

Восстановления повреждений ДНК имеют важное значение для поддержания геномной целостности и предотвращения мутации и рак. Цель этого протокола заключается в количественном нестабильность генома путем прямого наблюдения хромосомных аберраций в метафазных из В-клеток мыши, используя флуоресцентные в гибридизация (FISH) для повторов теломер ДНК.

Аннотация

Неисправный репарации ДНК приводит к увеличению нестабильности генома, которая является причиной мутаций, которые приводят к туморогенеза. Анализ частоты и типа хромосомных аберраций в клетках различных типов позволяет дефекты восстановления повреждений ДНК не выяснены. Понимание млекопитающих репарации ДНК биология была очень помог производства мышей с нокаутом в специфических генов. Цель этого протокола заключается в количественном геномной нестабильности в мышь-лимфоцитов. Маркировка теломер с использованием PNA-FISH зондов (пептид нуклеиновых кислот - флуоресцентные в гибридизация) способствует быстрому анализ геномной нестабильности в спредов метафазных хромосом. В-клетки имеют определенные преимущества по сравнению с фибробластами, потому что они имеют нормальную плоидности и более высокий митотический индекс. Краткосрочная культура клеток, следовательно, позволяет точное измерение геномной нестабильности в первичной клеточной популяции, которая, вероятно, имеют меньше вторичного генетическую мутациюс чем то, что, как правило, находится в трансформированных фибробластов линии клеток или пациента.

Введение

Рак вызывается к накоплению мутаций, влияющих на гены, которые регулируют нормальный рост клеток. Мутация является следствием изменений в структуре и последовательности генома, связанная с повреждением ДНК. Повреждение ДНК может происходить с помощью различных процессов, в том числе экзогенных агентов, таких как ионизирующее излучение, и в качестве побочного продукта нормального клеточного метаболизма, такие как спонтанного дезаминирования нуклеотидных оснований или повреждений, возникающих при контакте с активными формами кислорода ^1.

Хотя клетки млекопитающих обладают ряд мероприятий по ремонту, которые могут повернуть вспять повреждение ДНК или восстановить последовательность в местах разрыва, мутации, тем не менее накапливаются в течение всей жизни клетки. Повреждение ДНК может, кроме того, способствуют старению и потере активности стволовых клеток, два процесса, которые связаны с старение-ассоциированных заболеваний ^2. Понимание ремонт повреждения ДНК, таким образом, решающее значение в решении две знакificant вопросы в области общественного здравоохранения. Увеличение данные свидетельствуют о том, что млекопитающих пути репарации ДНК может способствовать эволюции раковых клеток геном ^3,4, что делает его еще более важно для понимания процессов, участвующих в подавлении мутации на молекулярном уровне.

Прямая визуализация хромосомных аберраций является мощным и количественные средства определения степени геномной нестабильности в конкретном типе клеток. Сокращенные хромосомы клеток в метафазе, могут быть выделены и проверены с помощью света или флуоресцентной микроскопии. Такие подходы цитогенетических был на практике в течение нескольких десятилетий и может быть использован, чтобы продемонстрировать внешний вид транслокаций или конкретных видов хромосомных аберраций, связанных с потерей репарации ДНК деятельности. Протокол поддается нескольких потенциальных расширений: хромосомы могут быть помечены зондов для спектрального кариотипирование (SKY) или многоцветной флуоресцентной гибридизации на месте(MFISH) для выявления транслокации ^5,6. Эти методы также позволяют частоту хромосомных транслокаций и структуры сложных хромосомных транслокаций, которые будут определены, что обеспечивает дополнительную информацию сверх того, что можно с этим протоколом. Кроме того, последовательность конкретных зонды могут быть получены и использованы для тестирования частоты разрыва ДНК в отдельных геномных сайтов ^7.

В этом протоколе, мы опишем приготовление метафазных хромосом распространяется от В-лимфоцитов. Флуоресцентно-меченного пептида нуклеиновой кислоты (ПНК) зонд для теломерных повторов используется, которые эффективно отмечает теломеры в метафазе хромосомы распространяется Этот протокол имеет несколько преимуществ. В-клетки могут быть индуцированы расти при высокой митотический индекс, так что высококачественные спреды последовательно, может быть получено. В-клетки генетически модифицированных мышей, также гораздо реже содержат вторичные генетические мутации, которые могут посрамить анализ вкладаспецифических генов в геномной целостности. Подход PNA-FISH может быть завершена в течение одного дня, и позволяет более точно озвучивание разрывы хромосом. Используя этот подход, особенно в сочетании с конкретного оборудования, описанного в этом протоколе, можно производить очень последовательные, высококачественные спреды и быстро анализировать частоту и тип геномной нестабильности.

Протокол

Эта процедура была утверждена уходу и использованию комитета Институциональная животных при университете Ратджерса, Государственного университета Нью-Джерси на. Мышей обрабатывали в соответствии с Руководством по NIH по уходу и использованию лабораторных животных. Ученые должны консультироваться со своими национальными и институциональных организаций животных для установленных и утвержденных принципов.

Прежде чем начать, приготовления растворов, перечисленных в таблице 1.

1 B Выделение клеток и активация

Усыпить мышь, используя CO ₂ с последующим смещением шейных позвонков. Поместите мышь так левая сторона тела и спрей мышь с 70% этанола, пока мех не сыро. Проанализируйте селезенку и место в 35 мм блюдо культуры ткани с 2 мл промывочного буфера. В ламинарном потоке, аккуратно разбить селезенки в тканевой культуральной чашке с помощью плоский конец 5 мл шприца.

1. Вставьте нейлоновая сетка 70 мкм в 50мл тюбик и перенести образец селезенки в 2 мл промывочного буфера в нейлоновой сетке. Осторожно нарушить селезенки в сетке, используя плоский конец шприца.
2. Промойте заднюю часть шприца и 35 мм пластины с 8 мл промывочного буфера и фильтровать через нейлоновую сетку 70 мкм. Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
3. Аспирируйте и отбросить супернатант и ресуспендируют осадок в 3 мл ACK буфера для лизиса. Внесите вверх и вниз кратко сорвать комки и инкубировать 5 мин. Добавьте 10 мл промывочного буфера и центрифуге при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
4. Аспирируйте и отбросить супернатант и ресуспендируют осадок, нажав на дне пробирки затем с помощью пипетки в 1 мл промывочного буфера. Добавить 50 мкл анти-CD43 MACS микро-шариков и инкубируют на льду в течение 30 мин. Добавьте 10 мл промывочного буфера, аккуратно перемешать, и центрифуге при 300 мкг в течение 10 мин при 4 ° С. Добавьте 10 мл промывочного буфера, аккуратно перемешать, и центрифуге при 300 мкг в течение 10 мин при 4 ° С.
5. НастройкаКолонка Мини-MACS, поместив столбец на MACS магнита. Расположите меченого 15 мл коническую трубку ниже колонки. Добавьте 1 мл промывочного буфера на колонку и дать ему поработать до 15 мл трубки.
6. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют в 1 мл промывочного буфера. Загрузить образец в колонку после того, как буфер стирки проходит через.
7. После того, как образец пропускали через колонку, добавьте 1 мл промывочного буфера для промывки колонки. Добавить 7 мл промывочного буфера непосредственно к собранной пробы в 15 мл пробирку.
8. Граф клеток с использованием гемоцитометра. Перенесите необходимый объем клеток, необходимых для 5000000 клеток / лунку в 50 мл трубки. Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Дополнение среднего В-клеток с ЛПС 1: 500 и IL-4 1: 1000.
9. Аспирируйте супернатант и добавить соответствующий объем среды, дополненной В-клеток, необходимых для конечной концентрации 1000000 клеток / мл.
10. Пластина клеток в 6-луночных планшетах с 5 мл клеток в 1 млн клеток / мл и место в humidifiред инкубаторе для клеточных культур при 37 ° С, 5% СО _2.

2 B сотовый Фиксация

1. Добавить 50 мкл колцемид в лунку, содержащую 5 мл В-клеток (за конечной концентрации 100 нг / мл) и инкубируют 1 ч при 37оС. Prewarm 75 мМ КСl решение в C водяной бане 37 °. Перенесите В-клеток с меченым 15 мл трубки. Обложка этикетку с ленты и центрифуге при 300 мкг в течение 10 мин при 4 ° С.
2. Аспирируйте супернатант, оставляя 1 мл в пробирку и вновь суспендируют таблетку с помощью пипетки. Добавить 5 мл в предварительно подогретую KCl по капле при нажатой или пульсирует на вихрь.
3. Добавьте 10 мл KCl и взболтайте. Инкубировать в C водяной бане 37 ° С в течение 15 мин. Добавить 5 капель свежего фиксатора и взболтайте. Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Аспирируйте супернатант, оставляя 1 мл в пробирку и ресуспендируют осадок с помощью пипетки вверх и вниз.
4. Добавить 5 мл свежей закрепителя по капле при нажатой или пульсирует на VORтекс. Добавить еще 10 мл фиксатора и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
5. Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Аспирируйте супернатант, оставляя 1 мл в пробирку и ресуспендируют с помощью пипетки. Добавить 14 мл свежего фиксатора и центрифуге при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
6. Повторите шаг 2,7 раза больше.
7. Добавить 14 мл свежей фиксатором. Уплотнение крышки парафильмом и хранить в течение ночи при температуре -20 ° C.

3 Получение метафазных хромосом Спреды

1. Установите регулируемый окружающую камеру до 22,9 ° С и 52% влажности.
2. Центрифуга фиксированной В-клеток при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Аспирируйте FIXATIVE оставляя 70 мкл в пробирки и ресуспендируют с помощью пипетки.
3. Поместите меченные слайды в камере влажности под углом 35 °. Бросьте 35 мкл ресуспендированных В-клеток на слайд и поместите две горки на образец. Разрешить слайды сушить в камере влажности в течение 30 мин, то хранить слайдыв слайд-коробки при 37 ° С.

4 теломер ПНА FISH

1. Подготовка зонда
   1. Предварительно теплой деионизированной формамид до 37 ° С. Смешайте 2 мкл теломер PNA зонда с 7 мкл деионизированной подогретого формамида и инкубируют при 37 ° С при встряхивании в течение 1 часа.
   2. Предварительно теплой мастер-FISH смесь до 37 ° С. Добавить 7 мкл подогретого мастер Fish Mix к смеси с шага 4.1.1 и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 1-3 часов.
   3. Денатурации смеси зонда в течение 8 мин при 80 ° С. Предварительно отжига зонда в течение 1 ч при 37 ° С.
2. Предварительная обработка хромосомы Слайды
   1. Предварительно нагреть-предметное стекло-окрашивания банку, содержащую 50 мл 0,01 М HCl до 37 ° С на водяной бане.
   2. Место скользит в другом предметное стекло-окрашивающего сосуд, содержащий 2Х SSC в течение 5 мин при комнатной температуре.
   3. Добавить 2 мкл пепсина складе в предварительно нагретом стекло-окрашивания банку и взболтайте. Трансфер слайды в этом стеклянном SLIDE-окрашивание банку и инкубируют 90 сек при 37 ° С.
   4. Промыть слайды 2x в другом предметное стекло-окрашивающего сосуд, содержащий 1X PBS в течение 5 мин каждый при комнатной температуре, встряхивая. Затем промыть слайды в течение 5 мин в 1х PBS / MgCl ₂ при комнатной температуре, встряхивая.
   5. Передача слайдов на предметное стекло-окрашивающего сосуд, содержащий свежеприготовленного 1% формальдегид / 1X PBS / MgCl ₂ в течение 10 мин при комнатной температуре.
   6. Вымойте слайды в течение 5 мин в другом предметное стекло-окрашивания банку, содержащую 1x PBS при комнатной температуре, встряхивая.
   7. Подготовка обезвоживания серии этанола, имея отдельный стекло-окрашивания баночки с 70%, 90% и 100% этанола.
   8. Передача слайдов в каждую банку в течение 3 мин, начиная с 70% этанолом, затем 90% этанола, а затем 100% этанола. Поместите этанола банки при -20 ° С, когда закончите.
   9. Разрешить слайды высохнуть на воздухе, нажав избыток этанола на бумажное полотенце и подперев слайды под углом 35 °. После высыхания, Массачусетсгк на 18 х 18 мм область для гибридизации на задней слайдов с использованием алмазной ручку.
3. Денатурация Слайды для FISH
   1. Применить 120 мкл 70% деионизированной формамид / 2 × SSC в 24 х 60 мм покровным. Прикоснитесь к слайд покровного стекла. Денатурации слайд на 80 ° С на горячей плите в течение 90 сек.
   2. Быстро и тщательно соскользнуть покровное и поместить слайд в ледяной 70% этанола в течение 3 мин, после чего 90% этанола, и 100% этанола каждого в течение 3 мин. Разрешить слайды высохнуть на воздухе.
   3. Подготовка влажной камере, выравнивая пластиковую коробку с плотной крышкой и папиросной бумаги мокрой. Бумага должна быть влажной, но не насыщен водой.
   4. В влажной камере, применить предварительно отжигают сочетание зонда с шага 4.1.3 к обозначенному месту на слайде, накрыть 18 х 18 мм крышки скольжения и инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа.
4. Сообщение-инкубации Моет
   1. Предварительно теплые 50% формамид / 2 x SSC, 1x SSC, и 4x SSC / 0,1% Tween-20 в 45 °; Водяной бане C.
   2. Осторожно снимите покровные и мыть слайды в подогретого 50% формамидном / 2x SSC 3xfor 5 мин каждый в темноте и встряхивая. Вымойте слайды в подогретого 1x SSC 3xfor 5 мин каждая, дрожит. Наконец, мыть слайды в подогретого 4x SSC / 0,1% Твин-20 3xfor 5 минут каждый.
   3. Пятно слайды в течение 3 мин в DAPI в защищенном от света стекло-окрашивания банку.
   4. Вымойте слайды в течение 5 мин в 2х SSC, дрожит. Применить 35 мкл Mowiol монтажной среды, накрыть 24 х 60 мм покровные и хранить слайды при 4 ° С.

5 Микроскопический анализ хромосом

1. Проанализируйте метафазных слайды, используя стандартный эпи-флуоресцентного микроскопа. Используйте изображений платформу с автоматизированной стадии в платформе метасистем Metafer получить лучшие результаты. Для каждого разворота метафазной, собирать одну картинку для флуоресценции DAPI визуализировать хромосомы, и одно изображение для флуоресцентного сигнала от теломер рхалат. (Например, Cy3- другие Fluors доступны и работают одинаково хорошо.)
2. Наложения на изображения с помощью программы анализа изображений и анализировать.

Результаты

Метафазных хромосом, полученных от одной клетки должны образуют дискретный кластер, содержащий 40 хромосом (при использовании клетки мыши) (Рисунок 1А). Каждая хромосома имеет центромеры на одном конце, которая видна в виде светло-голубой шар. В нормальных хромосом, две теломер сигналы видно на конце хроматидами и двух сигналов по каждой центромеры. Ядра Межфазные будет присутствовать на слайде, а также. Они будут видны в виде синих сфер, с красными сигналами теломер, но не конденсированных хромосом (см...

Обсуждение

В то время как активированные лимфоциты особенно подходит для приготовления митотических хромосом спредов, другие типы клеток, также могут быть использованы. Т-лимфоциты имеют много преимуществ В-клеток, так как они могут быть очищены из селезенки или лимфатических узлов, а также имеют высокий индекс митотической при стимуляции роста в среде, содержащей соответствующие митогены ^8. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) подходят также для анализа метафазных хромосом ^9. Если они не доступны, фибробласт...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
50% сульфат декстрана	Intergen	S4030
Деионизированный формамид	Ambion	9342
Пепсин (5 г)	Sigma	P 6887
FCS	Gemini	100-106
LPS (100 мг)	Sigma	L2630
IL-4 (5 μ g)	Sigma	I1020
PNA Telomere Probe	PNA Bio Inc	F1002	(CCCTAACCCTAACCCTAA)
Colcemid	Roche	295892
Mowiol 4-88	Sigma	81381-50g
CD43 (ly-48_) микрогранулы	Miltenyl Biotec.	130-049-801
DAPI	Sigma	32670-5MG
Eclipse E800	Nikon
AxioImager.Z2	Zeiss
CDS-5 Цитогенетическая сушильная камера	термотрон