Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Роман В естественных условиях Перенос генов Техника и В пробирке Сотовый основе Анализы для исследования костного Потери в опорно-двигательного аппарата

11.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51810

⸱

8 июня 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Rheumatology, Allergy and Clinical Immunology, University of California, Davis, 2Institute for Pediatric Regenerative Medicine, Shriners Hospitals for Children - Northern California, 3Department of Dermatology, University of California, Davis

В этой статье

Краткое содержание

Дифференцировка клеток-предшественников в остеокласты регулируется цитокинами и факторами роста. Здесь описывается новый метод переноса генов для дифференцировки остеокластов in vivo и протоколы клеточных культур для дифференцировки клеток-предшественников в остеокласты in vitro в качестве метода изучения влияния цитокинов на остеокластогенез.

Аннотация

Дифференцировка и активация остеокластов играют ключевую роль в развитии заболеваний опорно-двигательного аппарата, поскольку эти клетки в первую очередь участвуют в резорбции костей. Остеокласты могут быть получены in vitro из клеток-предшественников моноцитов/макрофагов в присутствии определенных цитокинов, которые способствуют выживанию и дифференцировке. Здесь демонстрируются методы in vivo и in vitro, которые позволяют ученым изучать различные вклады цитокинов в дифференцировку, передачу сигналов и активацию остеокластов. Система переноса генов доставки ДНК minicircle представляет собой альтернативный метод создания модели, связанной с остеопорозом, что особенно полезно для изучения эффективности различных фармакологических ингибиторов in vivo. Аналогичным образом, протоколы культивирования in vitro для производства остеокластов из клеток-предшественников человека в присутствии специфических цитокинов позволяют ученым изучать остеокластогенез в клетках человека для трансляционных применений. В совокупности эти методы могут ускорить усилия по разработке лекарств для таргетной терапии, специфичной для остеокластов, которые могут принести пользу миллионам пациентов с остеопорозом и артритом во всем мире.

Введение

Заболевания опорно-двигательного затрагивают миллионы людей в Соединенных Штатах и нынешних тяжелых последствий для национальных и местных систем здравоохранения 1. Эти расстройства характеризуются потерей костной и функции суставов, которые требуют серьезного лечения и длительные периоды восстановления. Как правило, относительное увеличение числа и / или активности остеокластов, клеток, специализирующихся на резорбируют кости, при остеопорозе и артрит наблюдается 2. В физиологических условиях количество и активность остеокластов регулируется рецептора активатора ядерного фактора κ-B лиганда (RANKL), который получают путем остеобластов. Остеопротегерин (ОПГ), рецептор приманка для RANKL также производится остеобластов 3 IN VIVO модели на животных, которые включают системную сверхэкспрессию sRANKL, или удаление ОПГ очень ценны в остеопороза исследований.; Однако эти способы требуют создания трансгенных мышей 4,5. Здесь, роман альтернативаМетод избыточной экспрессии sRANKL для изучения нарушений опорно-двигательного аппарата, связанных описывается. В частности, minicircle (MC) ДНК-технология и гидродинамические методы доставки были использованы для достижения перенос генов из sRANKL в естественных условиях и сверхэкспрессировать мыши sRANKL системно 6.

Этот метод также дополняет другие естественных условиях моделей в остеопороза, например, гормональной модуляции остеокластов следующих овариэктомию 7 и диетического вмешательства диету с низким содержанием кальция 8. Эти модели очень полезны для изучения различных аспектов нарушений опорно-двигательного аппарата, связанных, однако, они требуют хирургических процедур и может занять до нескольких месяцев, в значительной стоимости 9. Удаленными яичниками (OVX) модель грызуна является экспериментальной модели на животных, где удаление яичников приводит к дефицита эстрогенов, тем самым подражая человеческой постменопаузе остеопороза 10. Человека после менопаузы остеопороз, заболевание, при котором эстроген deficiency приводит к повышенному риску переломов костей и остеопороз поражает около восьми миллионов женщин в одних только Соединенных Штатах. Хотя OVX модель полезна для постклимактерического остеопороза предлагает ограниченные преимущества при изучении остеопороза в целом. Эстроген подавляет потерю костной массы, путем индукции остеокластов и остеобластов ингибирования апоптоза, поэтому в его отсутствие увеличился остеокластов активность наблюдается 10-12. Соотношение RANKL-ОПГ дисбаланс, который способствует резорбции кости наблюдается 13. Тем не менее, дефицит эстрогенов в естественных условиях также сопровождается снижением уровня трансформирующий фактор роста β (TGF β), увеличение интерлейкина-7 (IL-7) и TNF, IL-1 и IL-6 14,15. Поскольку эти цитокины известно костного ремоделирования функции модулирующие зависит от RANKL пути, невозможно приписать никакой активации остеокластов исключительно к оси RANKL-RANK. Модель, описанная в этой статье позволяет исследователям изучать в Львовео ось RANKL-ранг в остеокластогенеза и потери костной массы без провоспалительных цитокинов по сравнению с OVX моделях грызунов.

Кроме того, в пробирке методы остеокластогенеза являются важными инструментами для изучения активации остеокластов для потенциальных терапевтического лечения заболеваний опорно-двигательного. Предыдущие исследования также показали, что культивирование костного мозга мыши, полученные макрофагов (BMMs) с мышь макрофагов колониестимулирующего фактора (M-CSF) и мыши sRANKL может привести к остеокластов дифференциации 3,16,17. Здесь, протоколы для генерации многоядерные остеокластов-подобных клеток из костного мозга мыши, а также из человеческих мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) в пробирке 18 описаны. Анализы на основе клеток, необходимых для определения зрелую терминально дифференцированных и полностью функциональный остеокластов также кратко описаны. Эти методы в пробирке дополняют роман в естественных условиях подхода и вместе служить рowerful инструменты следственные учиться остеокластов дифференциации и активации. С помощью этих систем, ученые способны генерировать остеокласты ин виво и ин витро и определить стимулы и сигналы, необходимые для их пролиферации и активации, а также проверить эффективность фармакологических и биологических ингибиторов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Гидродинамическая Доставка sRANKL MC ДНК

  1. Гидродинамическая Доставка через Mouse хвостовую вену
    1. Взвесьте мыши до инъекции в хвостовую вену. Развести sRANKL или зеленый флуоресцентный белок (GFP) MC в растворе Рингера (предварительно теплой при 37 ° С) в общем объеме ~ 10% от массы тела мыши.
    2. Разминка мышь в клетке в течение 10 мин до инъекции для того, чтобы расширять кровеносные сосуды и сделать боковые вены (LVS) видимые. Монитор мыши тщательно, чтобы избежать обезвоживания и гипертермии.
    3. Как только ПЗ расширены и видно, передавать мышь к фиксатор и вставьте вилку достаточно далеко в ствол сдерживать движение. Монитор мыши для нормальной деятельности, такие как дыхание. Отрегулируйте вилку фиксатор в случае необходимости.
    4. Дезинфицировать области впрыска 3/4 от кончика хвоста со спиртом салфеткой. Используйте 27-30 G иглу для мыши инъекции в хвостовую вену. Держите хвост твердо одной рукой и вставить иглу вв хвостовую вену. Надавите на шприц и завершить инъекции в пределах 5-7 сек.
    5. Удалите иглу из хвостовой вены и оказать давление с ватным тампоном на месте инъекции, чтобы остановить кровотечение. Монитор мыши в течение 15-30 мин, а затем перенести мышь обратно в виварий, как только частота дыхания снижается до нормальной скорости.
  2. Подтверждение выражения системных Мауса sRANKL и количественной оценки мышь Сыворотка TRACP5b Сообщение генного переноса
    1. Разминка мышь в клетке в течение 5-10 мин, чтобы расширять кровеносные сосуды и сделать ПЗ видно. Монитор мыши тщательно, чтобы избежать обезвоживания и гипертермии.
    2. Сделать небольшой надрез с лезвием к хвосту мыши на участке, один вперед от кончика хвоста.
    3. Сбор около 100 мкл крови в трубках разделения сыворотки.
    4. Инкубируйте пробирки разделения сыворотки при комнатной температуре в течение 30 мин.
    5. Центрифуга образцов при 10000 мкг в течение 5 мин и собирают сыворотку. Storе сыворотки в -80 ° С для дальнейшего анализа.
    6. Выполните sRANKL ELISA и мыши сыворотки TRACP5b анализа на образцах сыворотки с использованием коммерческого доступного набора.

2. Экстракорпоральное остеокластов поколения от мыши BMMs

  1. Изоляция и культивирование BMMs
    1. Выделение берцовой и бедренной костей: Эвтаназии донорской мышь с CO 2, и дезинфицировать ноги с 70% этанола. Проанализируйте от лобковой кости к пяточной кости кости, удалить бедра и голени кости нетронутыми.
    2. Удалить кожу и мышцы осторожно, не повредив кость. Поместите обработанный бедра и голени кости в чашку Петри, содержащую забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS).
    3. Удаление костного мозга: Обрежьте кончик на одной стороне бедра и голени костей и промойте костный мозг в 50 мл трубки с помощью 1 мл шприц с 25 G иглы, загружается с α-MEM, содержащей 1% пенициллина / стрептомицина (остеокластов Культура Средний / ОСМ).
      4. Процесс костного мозга: Смешать и передать подвеска костного мозга на новый 50 мл трубки, пропуская ее через сито нейлон клеток 70 мкм. Центрифуга клетки при 300 мкг и повторно приостанавливать в α-МЕМ, содержащей 1% пенициллина / стрептомицина и 10% FBS (остеокластов Культуральную среду / OCM (+)).
  2. Культура макрофагов
    1. Граф клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
    2. Виброплиты 1 х 10 6 клеток на лунку для 6-луночный планшет или 3 х 10 5 клеток на покровных стеклах (5 мм) или дентина ломтиками, помещенных в 96-луночный планшет и инкубировать при 37 ° С
    3. Аспирируйте все носители, содержащие неприкрепленных клеток и инкубируют клетки при 37 ° С со свежим OCM (+), содержащей 25 нг / мл мыши M-CSF в течение 48 часов.
    4. Аспирируйте все носители и инкубировать клетки при 37 ° С со свежим OCM (+) носитель, содержащий 25 нг / мл мыши M-CSF, и 30 нг / мл мышиного sRANKL инициировать остеокластогенез. Пополнение СМИ каждые 3 дня по мере необходимости.
    5. Рост клетокдля примерно 6-8 дней, чтобы сформировать гигантские мульти-ядерные клетки, способные резорбции кости. Как только появляются многоядерные клетки, выполнить ловушке (тартратрезистентной кислой фосфатазы) окрашивания с использованием коммерческого доступного набора, и когда полностью созрел, выполнять функциональные анализы. Визуализация F-актин кольца на покровных использованием фаллоидином пятна и изображение клетки, прикрепленные к дентину ломтики с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), как описано выше 19.

3. Экстракорпоральное остеокластов поколения от человека МНПК

  1. Выделение человека МНПК
    1. Добавьте 10 мл подогретого Histopaque-1077 в 50 мл пробирку.
    2. Пустой лейкоцитов фильтр, полученный из банка крови стерильной PBS в 50 мл пробирку (1:1 соотношение крови с PBS). Слой разбавленной крови над Histopaque решения очень медленно, убедившись, что кровь не смешивается с Histopaque.
    3. Центрифуга образцов при 1000 х г в течение 20 мин при 18 ° С. СледоватьING центрифугирование, тщательно изолировать белый слой светлого сгустка, содержащий лейкоциты и переход к новой 50 мл пробирку.
    4. Развести клетки с PBS и центрифуги снова при 650 х г в течение 5 мин, чтобы собрать клетки.
    5. Удалить супернатант и ресуспендирования клеток в ОПК (-) СМИ и подсчета клеток с помощью счетчика клеток.
  2. Покрытие и Культивирование МНПК
    1. Ресуспендируют клеток в OCM (+) средства массовой информации и пластина 8 х 10 6 клеток / мл на лунку в 6-луночный планшет или 1 х 10 6 клеток / мл на лунку в 96-луночный планшет. Пластина клеток на покровных стеклах (5 мм) в соответствии с требованиями для иммунофлуоресценции изображений, а также на кусочки костей, пригодных для костной резорбции анализов, как описано выше 20.
    2. Изменение питательных сред, пополняя клетки с человеческой M-CSF каждые 2-3 дней или по мере необходимости. Затем переходите к дифференциации шаг на 5-й день, добавляя 30 нг / мл человеческого sRANKL вместе с 25 нг / мл человеческого M-CSF в ОПК (+) СМИ, чтобы инициировать osteoclastogenesесть.
    3. Рост клеток в течение примерно 14 до 21 дней, чтобы сформировать гигантские мульти-ядерных клеток. Как только появляются многоядерные клетки, эти клетки могут быть помечены для ловушка, и когда полностью созрел, функциональные пробы может быть выполнена. F-актина кольца могут быть визуализированы на покровных стеклах с использованием фаллоидином пятно. Морфология клеток могут быть рассмотрены в клетках, прикрепленных к дентину ломтики с помощью СЭМ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Здесь, методика переноса генов роман для дифференциации остеокластов в естественных условиях и протоколов культивирования клеток для дифференциации клеток-предшественников в остеокласты в пробирке, как способ изучения влияния цитокинов на остеокластогенеза описаны. На рисунке 1, представительные результаты успешного переноса гена GFP и мыши sRANKL MC у мышей показаны. На рисунке 2, представительные образы мыши костного мозга или человека РВМС клеточной дифференцировки ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Опорно-двигательного аппарата, являются основными причинами заболеваемости и инвалидности и состоят из более чем 150 заболеваний и синдромов; влияя на приблизительно 90 миллионов американцев сегодня. Воспаление суставов и разрушения кости являются преобладающими особенности опорно-двигательного аппарата, в том числе артрит и остеопороз. Остеопороз является состоянием, которое ослабляет целостность костей, что часто приводит к переломам костей. Артрит является хроническим, изнурительным заболевание, характеризующееся вос...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Исследование было частично поддержано исследовательскими грантами NIH R01 AR062173 и SHC 250862 МЭА. ES является получателем стипендии NIH T32 CTSC для подготовки к докторантуре.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
alpha-MEMLife Technologies 12561-056
Мышь M-CSFMiltenyi Biotec130-096-492
Мышь M-CSFMiltenyi Biotec130-094-643
Мышь RANK-лиганд - растворимыйMiltenyi Biotec130-094-631
Мышь RANK-Лиганд - растворимыйMiltenyi Biotec130-094-076
Тейлвейнер Ограничитель для мышейBraintreeTV-150 STD
Мышь Транс/РАНГ L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit НИР D системыMTR00
Кислая фосфатаза, лейкоциты (TRAP) НаборSigma387A
MouseTRAP анализ иммунодиагностические системыSB-TR103

Ссылки

  1. Yelin, E. Cost of musculoskeletal diseases: impact of work disability and functional decline. The Journal of rheumatology. Supplement. 68, 8-11 (2003).
  2. Boyce, B. F., Rosenberg, E., de Papp, A. E., Duong le, T. The osteoclast, bone remodelling and treatment of metabolic bone disease. European journal of clinical investigation. 42, 1332-1341 (2012).
  3. Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, 165-176 (1998).
  4. Mizuno, A., et al. Transgenic mice overexpressing soluble osteoclast differentiation factor (sODF) exhibit severe osteoporosis. Journal of bone and mineral metabolism. 20, 337-344 (2002).
  5. Bucay, N., et al. osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification. Gene., & development. 12, 1260-1268 (1998).
  6. Suda, T., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 15, 2063-2069 (2007).
  7. Wronski, T. J., Dann, L. M., Scott, K. S., Cintron, M. Long-term effects of ovariectomy and aging on the rat skeleton. Calcified tissue international. 45, 360-366 (1989).
  8. Seto, H., Aoki, K., Kasugai, S., Ohya, K. Trabecular bone turnover, bone marrow cell development, and gene expression of bone matrix proteins after low calcium feeding in rats. Bone. 25, 687-695 (1999).
  9. Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comparative medicine. 58, 424-430 (2008).
  10. Sherman, B. M., West, J. H., Korenman, S. G. The menopausal transition: analysis of LH, FSH, estradiol, and progesterone concentrations during menstrual cycles of older women. The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 42, 629-636 (1976).
  11. Hughes, D. E., et al. Estrogen promotes apoptosis of murine osteoclasts mediated by TGF-beta. Nature medicine. 2, 1132-1136 (1996).
  12. Kousteni, S., et al. Nongenotropic, sex-nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity. Cell. 104, 719-730 (2001).
  13. Ominsky, M. S., et al. RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 23, 672-682 (2008).
  14. Kitazawa, R., Kimble, R. B., Vannice, J. L., Kung, V. T., Pacifici, R. Interleukin-1 receptor antagonist and tumor necrosis factor binding protein decrease osteoclast formation and bone resorption in ovariectomized mice. The Journal of clinical investigation. 94, 2397-2406 (1994).
  15. Weitzmann, M. N., Pacifici, R. Estrogen deficiency and bone loss: an inflammatory tale. The Journal of clinical investigation. 116, 1186-1194 (2006).
  16. Suda, T., Nakamura, I., Jimi, E., Takahashi, N. Regulation of osteoclast function. J Bone Miner Res. 12, 869-879 (1997).
  17. Asagiri, M., Takayanagi, H. The molecular understanding of osteoclast differentiation. Bone. 40, 251-264 (2007).
  18. Matsuzaki, K., et al. Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures. Biochemical and biophysical research communications. 246, 199-204 (1998).
  19. Adamopoulos, I. E., et al. Synovial fluid macrophages are capable of osteoclast formation and resorption. The Journal of pathology. 208, 35-43 (2006).
  20. Adamopoulos, I. E., et al. Interleukin-17A upregulates receptor activator of NF-kappaB on osteoclast precursors. Arthritis researc., & therapy. 12, (2010).
  21. Jones, D., Glimcher, L. H., Aliprantis, A. O. Osteoimmunology at the nexus of arthritis, osteoporosis, cancer, and infection. J Clin Invest. 121, 2534-2542 (2011).
  22. Sato, K., Takayanagi, H. Osteoclasts, rheumatoid arthritis, and osteoimmunology. Curr Opin Rheumatol. 18, 419-426 (2006).
  23. Das, S., Crockett, J. C. Osteoporosis - a current view of pharmacological prevention and treatment. Drug design, development and therapy. 7, 435-448 (2013).
  24. Chen, Z. Y., He, C. Y., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 8, 495-500 (2003).
  25. Kay, M. A., He, C. Y., Chen, Z. Y. A robust system for production of minicircle DNA vectors. Nature biotechnology. 28, 1287-1289 (2010).
  26. Chen, Z. Y., He, C. Y., Kay, M. A. Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo. Human gene therapy. 16, 126-131 (2005).
  27. Halleen, J. M., et al. Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 15, 1337-1345 (2000).
  28. Adamopoulos, I. E., et al. IL-23 is critical for induction of arthritis, osteoclast formation, and maintenance of bone mass. J Immunol. 187, 951-959 (2011).
  29. Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. Modulation of osteoclast differentiation. Endocrine reviews. 13, 66-80 (1992).
  30. Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123, 2600-2602 (1988).
  31. Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
  32. Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. The Journal of experimental medicine. 190, 1741-1754 (1999).
  33. Fuller, K., et al. Macrophage colony-stimulating factor stimulates survival and chemotactic behavior in isolated osteoclasts. The Journal of experimental medicin. 178, 1733-1744 (1993).
  34. Edwards, J. R., Mundy, G. R. Advances in osteoclast biology: old findings and new insights from mouse models. Nature reviews. Rheumatology. 7, 235-243 (2011).
  35. Weinstein, R. S., et al. Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids. The Journal of clinical investigation. 109, 1041-1048 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Дифференцировка остеокластовгидродинамическая доставка геновмодель остеокластов in vivoгенерация остеокластов in vitroмакрофаги костного мозгаостеокласты из мононуклеарных клеток периферической крови человекамини-кольцевая ДНК с лигандом RANKдобавка MCSFTRAP-положительные клеткиформирование кольца F-актина
Роман В естественных условиях Перенос генов Техника и В пробирке Сотовый основе Анализы для исследования костного Потери в опорно-двигательного аппарата
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.