Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Улучшенная Северная Клякса обнаружения малых РНК видов в Дрозофилы

22.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51814

⸱

21 августа 2014 г.

 , 
1Département de Génomique Fonctionnelle et Cancer, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, 2Center for Life NanoScience, Istituto Italiano di Tecnologia

В этой статье

Краткое содержание

Целью данной публикации является визуализация и обсудить оперативные шаги для улучшенного протокола Северная пятно на РНК, выделенной из Дрозофилы эмбрионов, клетки и ткани. Этот протокол является особенно полезным для эффективного обнаружения мелких видов РНК.

Аннотация

В последние десятилетия мы стали свидетелями взрыва научного интереса вокруг механизмов контроля экспрессии генов на уровне РНК. Эта отрасль молекулярной биологии была значительно подпитывается открытием некодирующих РНК в качестве основных игроков в пост-транскрипционной регуляции. Такая революционная перспектива сопровождается и вызвано развитием мощных технологий для профилирования короткий выражение РНК, как на уровне высокой пропускной (генома идентификации) или как одного кандидата анализа (стационарного накопления конкретных видов). Хотя несколько состояние дел в области стратегии в настоящее время доступны для дозирования или визуализации таких бегущих молекулы, Северная Клякса анализ остается право подход в молекулярной биологии для немедленного и точного вычисления выражения РНК. Она представляет первый шаг к применению более сложных, дорогостоящих технологий и, во многих случаях, остается льготный способ легко получить представлениев РНК биологии. Здесь мы обзору эффективный протокол (Enhanced Северная Клякса) для обнаружения слабо выраженные микроРНК (или других мелких нормативные вид РНК) из Дрозофилы целые эмбрионы, вручную расчлененный личинок / взрослых тканей или в пробирке культивируемых клетках. Очень ограниченное количество РНК не требуется, и использование материала, из проточной цитометрии-изолированные клетки могут быть также предусмотрены.

Введение

РНК биохимия пережил захватывающие прогрессирует в последние годы 1. Наша осмысление РНК потенциала в контроле экспрессии генов был лопнуть от идентификации мощных некодирующих рибо- регуляторов 2, в связи с открытием новых РНК на основе регуляторных механизмов 3,4 и более глубоким характеристик уже известных посттранскрипционных событий 5. Все вместе эти исследования позволили РНК биологии резко сделать сцену, став основным предметом исследования в современной научной ландшафта. В частности, за последние годы мы получаем ощущение всепроникающей влияния "мира РНК" на молекулярном нейробиологии 6, один из наиболее динамично развивающихся областей исследований в современной науке о жизни. В последнее десятилетие прошлого века, научная сценарий был революцию в связи с открытием в РНК-интерференция 7,8 и малых регуляторных РНК 9,10обращая особое внимание на микроРНК 11, эндогенно выразил небольшие некодирующих РНК участвует в контроле практически всех клеточных функций, как плейотропных и комбинаторных регуляторов экспрессии генов.

Почти через 10 лет после микроРНК первоначального открытия в Caenorhabditis Элеганс по Ambros и лабораторий Ruvkun в, повышенное внимание было обращено к области, когда большое число микроРНК были выявлены у дрозофилы и в клетках человека, а 12-15. С тех пор, благодаря универсальным трансгенных подходов, Дрозофилы выдалась как ценный биологическом контексте для углубляясь в микроРНК биосинтеза и деятельности. Drosophila микроРНК выявили различные функции в насекомых-специфических или эволюционно консервативных процессов, охватывающих от старения для метаболизма, сигнальных путей , поведение и, конечно, нейрогенез. Наряду этом направлении, мы недавно представила новый ссылку 16 в интригующей сотрудничестваrrelation происходит между мастер гена г см / скольжения и РНК пути. Коэффициент муха транскрипции GCM / Glide 17-19 представляет собой уникальный пример клеточной судьбы определителя, который диктует глиальных против нейронов выбор судьбы в мультипотентных летать нейронных предшественников 20. Двадцать год исследования по этой теме явно подчеркнул возникновение многочисленных и дублирующих друг друга входам регуляции экспрессии генов сходящийся над ГКМ / скользить 21-28 установить пороговые уровни, необходимые для балансировки нежную соотношение между нейронными и глиальных коллегами во время развития нервной системы.

Мы обнаружили, что регулирование с помощью DMEL-miR279 таргетинга представляет собой иной уровень управления, способствующий посттранскрипционных тонкой настройки гсм / скользить выражение 16. Во всем мире, эти направления исследований требуют от конкретные методологические усовершенствования: наряду лет, несколько технологий, первоначально разработанный для анализа традицitional РНК были преобразованы для количественного небольшие удобства РНК, кодирующие, вроде как анализов на защиту от РНКазы, кДНК массивов 29-31, ПЦР в реальном времени методов 32-35 и секвенирования 36,37. С другой стороны, калибровка технических подходов способствовала непрерывные прогрессирует в области.

Нозерн-блот анализ (NB, или РНК гель-блот-анализ) представляет репрезентативную экземпляр: она в значительной степени используется для профилирования накопление РНК, так как он обеспечивает как уровень экспрессии количественного а также определение размера. Тем не менее, внутренняя бедных чувствительность метода ограничивает, когда он должен быть применен к низкой обильных экспрессии генов тонких тюнеров, как коротких РНК. Вредным следствием является требование больших количеств суммарной РНК, которая затрудняет его применение в конкретных биологических образцах. По этим причинам, конкретных вариантов NB для малого обнаружения РНК были разработаны 38-40: мы воспользовались улучшенным NB прокedure 41 (ENB, Enhanced Северная Клякса), в то время как выяснения вышеуказанное взаимодействие между DMEL-miR279 и г см / скольжения.

Этот метод основан на шаге химической сшивки на основе активности производного карбодиимида [1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид, EDC], чтобы зафиксировать нуклеиновой кислоты на твердых подложках. Карбодиимида является универсальным сшивани, как известно, катализируют образование амидных связей между активированными карбоксильными или фосфатных групп и аминогрупп 42. Это свойство может быть использовано для ковалентно пару малых РНК с помощью их моно-фосфорилируются 5'-гидроксильной группы до аминогрупп на поверхности нейлоновые мембраны. Полученную конфигурации крепления повышает доступность иммобилизованным нуклеиновой кислоты и, в свою очередь, эффективность гибридизации зонд-мишень, что приводит к повышению замечательной обнаружения 43.

Методика предполагает особое relevancе в Drosophila молекулярных исследований, с помощью которых возникновение новых и отличительных классов малых РНК некодирующих становится 44. Среди них, rasiRNAs 45,46 составляют особую подтип Piwi взаимодействующих РНК (пиРНК 47), участвующих в последовательности конкретных молчания генов. Оперативные Детали этого метода полностью описаны и визуализировали далее, по отношению к анализу микроРНК DMEL-miR279 и DMEL-miR286 и, в первый раз, одного rasiRNA, rasi4. Мы толкнул до крайности этот метод, который позволил нам выявить плохо выраженные цели с минимальным количеством РНК (менее 1 мкг).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1 Сбор образцов

  1. Снять 2 клетки полу-приверженцем Шнайдера, (1-5 х 10 6 клеток в среднем), с помощью пипетки и собирать их с помощью центрифугирования (100 мкг в течение 1 мин). В случае, культивированных в пробирке адгезивных клеток, Trypsinize их в стандартных условиях или непосредственно собирают их из пластин в удобном количестве РНК извлечения реагента, по помощью клеточным скребком.
  2. Для получения эмбрионов, растут линии дрозофил в лету клетках и пусть эмбрионы накапливаются на откладки яиц пластин. Протрите эмбрионов прочь кистью в дистиллированной воде (DH 2 O), отбросить мусор ситовым фильтрации, промыть и восстановить эмбрионов в пробирке 48.
  3. В качестве альтернативного метода, вручную рассекают ткани / органы. Изолировать яички (преимущественное системы для анализа Пирны) из Drosophila живота в фосфатно-солевом буфере (PBS) при помощи стереомикроскопа (20-кратным увеличением), с помощью иглы или рассечение пинцет, как по отношениюualized в Sullivan и соавт 49.
  4. Пестик гомогенизации образцы по наркомании 0,5 объемов добычи РНК реагента.

2 Экстракция РНК / Анализ

  1. Перечень поручений по итогам производителей выполнить изоляцию РНК через коммерческие реагентов. ВНИМАНИЕ! Выделения РНК агенты, как правило, токсичны и каустической. В качестве альтернативы, применить протеиназы К на основе протокола для изоляции 50 РНК, а именно:
    1. Развести образцы в 400 мкл стоп-Микс и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин.
    2. Восстановление водорастворимые компоненты от стандартной фенол: хлороформ: изоамиловый спирт и хлороформом и этанолом (этанола) осадков / мытья. Воздух сухой образцы и ресуспендируйте в диэтилпирокарбонатом (DEPC) -обработанной дважды дистиллированной (дд) H 2 O.
  2. Оценка концентрации РНК УФ спектрофотометрическим измерением. Также убедитесь, чистота РНК высока, близко к 2,0, басред на A 260/280 чтение.
  3. Проверка препарат РНК на денатурирующих агарозном геле следующим образом:
    1. В чистом стакане, растворить 1,2 г агарозы в 82 мл DEPC-DDh 2 O, при непрерывном перемешивании. Варить до полного растворения.
    2. Разрешить решение гель остыть; когда температура достигает 60 ° C добавляют 10 мл 10Х 4-morpholinepropanesulfonic кислоты (МОПС) буфер для 1X конечной концентрации (ФК), и 8 мл 37% формальдегида в 3% FC. ВНИМАНИЕ! Формальдегид является канцерогеном.
    3. Налейте гель в горизонтальном электрофореза ячейки. Разрешить гель для отверждения под колпаком в течение по крайней мере 1 часа. После затвердевания, погрузите гель в MOPS 1X.
    4. Алиготе 2 мкг образца РНК и 1 мкг Лествичник (использовать РНК маркер, когда правильная оценка желательно). Добавить 3 тома агарозном красителем (ALD) на РНК и лестницы. Нагревают при 70 ° С в течение 5 мин и сразу же охладили на льду. CAUTION! Содержание ALD (этидийбромид и формамидные см Материалы) являются мутагенным и коррозию, соответственно.
    5. Загрузите образцы и запустить гель при 50 В в течение приблизительно 1 часа, периодически утилизации буфера. Проверьте РНК фракционирования шаблон УФ-визуализации или изображений гель. Признать дискретные полосы, соответствующие 28S и 18S рРНК и тРНК (рисунок 1).
  4. Перейдите к Северной Пробирной или магазина РНК при -80 ° С.

3 денатурирующих гель акриламида Подготовка

  1. Используйте маленькую вертикальную электрофоретическую аппарат для этого фракционирования стадии (размер пластины около 8 см х 9 см, гребень Толщина 0,75 мм).
  2. Сборка чистые стаканы вместе в литейной рамы.
  3. Подготовьте 10 мл 10% акриламида / бис-акриламида (19: 1) решение в MOPS 1X, 7 М мочевину. Сразу перед заливкой, добавить 100 мкл 10% персульфата аммония и 10 мкл TEMED и быстро перемешать раствор. ВНИМАНИЕ! Акриламид нейротоксичен и канцерогеном.
  4. Вылейте гель между стеклянными пластинами и вставьте расческу также тщательно, чтобы избежать пузырей. Пусть гель полимеризации при комнатной температуре в течение по крайней мере 45 мин перед использованием. Кроме того, хранить гель O / N, завернутый в насыщенных водой фильтровальной бумаги и запечатаны в Саран обертывание.

4 Подготовка образцов

  1. Аликвоты 0,5-20 мкг общей РНК для каждого образца. Если объем превышает 3-4 мкл, вакуумная высушить образец.
  2. Для определения размера, запускать аликвоту (20-30 сП) меченого низкого диапазона лестницы параллельно с образцами, в качестве маркера (смотри раздел 4.3 и 4.4 для подготовки). Treat его параллельно с образцами, как описано на стадии 4.5.
  3. Лестница: настроить фосфата прямой реакции, используя 0,1 мкг на 10 б.п.-стремянки. Инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин, а остановить реакцию, добавив этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) в 20 мМ FC.
  4. Очищают этанола осадков / мытья, сухой воздух иресуспендируйте в DDh 2 O (около 100 мкл). ВНИМАНИЕ! 32 P является радиоактивный источник.
  5. Для каждого образца добавляют равный объем акриламида синего красителя (ABD). Денатурируют нагреванием при 80 ° С в течение 5 мин и охладили на льду до погрузки. ОСТОРОЖНО! Формамид (содержание в ABD) вызывает коррозию.

5 Электрофоретическое Фракционирование

  1. Снимите стеклянные пластины из литья поддержки и правильно собрать их в электрофореза ячейки. Заполните как внутреннюю и внешнюю камеру с достаточной рабочим буфером (РБ).
  2. Аккуратно удалите гребень и предварительно запустить гель при 200 V в течение 10 мин. Перед загрузки образцов, смыть отложения мочевины из колодцев, впрыскивая некоторое RB через шприц.
  3. Используйте плоские советы, чтобы тщательно стратифицировать образцы шагом 4,5 в нижней части каждой скважины. Проверьте анодных и катодных соединения, чтобы избежать перевернутую работает. После того, как образцы проникать в гель при 100 V в течение 5 мин, яncrease напряжение до 200 В.
  4. При длине фракционирования от около 7 см, 45 мин долгосрочной перспективе является достаточным. Избегайте бромфеноловый синий (отслеживание пигмента в ABD) переполнять гель.
  5. Представьте на-гель фракционированных длинные РНК от этидийбромидом (EtBr) окрашивания, в качестве дополнительного шага:
    1. Обрежьте 2 см от верхней части геля и кратко промыть фрагмент в DDH 2 O.
    2. Инкубируйте срез геля при комнатной температуре в течение 15 мин при осторожном shacking в РБ, EtBr 0,5 мкг / мл FC.
    3. Destain геля в течение 15 мин в РБ, визуализировать длинные рРНК от УФ-облучения или изображений гель. Проверьте РНК погрузки и качества (см рис 1, панели 7). ВНИМАНИЕ! Бромид этиди является мутагенным.
  6. В то же время приступить блоттинга нижнюю часть геля, содержащего мелких видов РНК.

6 блоттинга

  1. Вырезать 6 кусков промокашки, чтобы соответствовать область блоттинга и эквивалентную часть unchargeд нейлоновую мембрану. Смочите листов бумаги, мембраны и 2 блоттинга колодки в РБ. Убедитесь, что полностью впитаться колодки, несколько раз сжимая их в РБ.
  2. Удалить гель из аппарата и открыть стаканы на среднем помощью шпателя. Используйте чистую резак для удаления скважин. Поместите лист мокрой ватмане на геле и осторожно поднимите его.
  3. Поместите нейлоновую мембрану на свободной поверхности геля. Отметить угол ориентировать фильтр в соответствии с нагружения образца. Заполните «сэндвич» (3 бумажные кусочки с каждой стороны). Рулон пластиковый стержень на поверхности блот, чтобы удалить любые возможные пузырьки воздуха.
  4. Поместите кляксу между двумя блоттинга колодки и затем в фильтровальную кассету. Соберите кассету в промокательной модуля, заполнить камеру с РБ и проверить правильность ориентации (нейлоновую мембрану должны остаться между гелем и положительного конца).
  5. Перевести на 20 V в течение 20 мин. Примечание: для обеспечения однородных условий, через 10 мин открыть промокательной модуль и гotate бутерброд на 180 ° до передачи.

7 Мембрана Сшивание

  1. Подготовьте 6 мл свежей сшивания решения (XLS). Пропитайте 10 см х 10 см (больше, чем нейлоновую мембрану) кусок промокательной бумаги с XLS. ВНИМАНИЕ! HCl (компонент XLS) отличается высокой агрессивностью.
  2. Разберите кляксу и поместите мембрану на мокром 3 мм фильтровальной бумаги. Примечание: РНК, не должен быть в непосредственном контакте с насыщенным бумаги. Поместите фильтр и бумагу между двумя стеклянными пластинами и завернуть в Саран пленку.
  3. Нагреть мембраны при 60 ° С в течение 2 ч, а затем в DDH 2 O стирки. Хранить при температуре -20 ° C или перейти к гибридизации.

8 Мембрана Предгибридизацию

  1. Если РНК погрузка была проверена (необязательный шаг 5.5), непосредственно перейти к гибридизации. Или же, срезать 1 см от до верхней части нейлоновый фильтр, чтобы избежать перекрестного зонда hybridizatioнс до фракционированных длинных РНК.
  2. Разогреть 10 мл раствора гибридизации (HS) при 37 ° С. Денатурируют 1 мг спермы лосося при 95 ° С в течение 5 мин, охлаждают на льду и добавить к HS.
  3. Инкубируйте фильтр в HS при 37oC в течение по крайней мере 1 ч, при вращении в гибридизации печи. Убедитесь, что РНК-часть фильтра обращена HS.

9 Probe Синтез

  1. Настройка прямой реакции фосфата на 10 пмоль антисмыслового олигонуклеотида определенной, как описано в 4.3.
  2. Добавить 5 объемов Трис-ЭДТА-NaCl (десять) буфер для реакции и очистки меченого праймера от некорпорированных нуклеотидов с помощью гель-эксклюзионной хроматографии на колонках G-25 Sephadex (или также EtOH осадков). Зонд деятельность может быть оценена с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика.

10. Мембрана Гибридизация

  1. Замените исчерпаны УГ со свежим 10 мл аликвоты (полученного и дополняется, как описано выше). Нагрейте датчик на95 ° С в течение 10 мин, охлаждают на льду и добавить к новым HS. Выдержите фильтр на 37 ° C ON.

11. Мембрана Стиральная

  1. Восстановление растворе для гибридизации и хранить его при температуре -20 ° С в радиоактивности-экранирования коробки.
  2. Промойте фильтр в промывочным буфером (ВБ) и промойте его тщательно в течение 10 мин при комнатной температуре.
  3. Используйте Гейгера Мюллера детектор для проверки остаточной радиоактивности в углах фильтров. Когда фон излучения составляет около 5 гц, приступить к мембранным экспозицию.

12. обнаружения сигнала

  1. Expose фильтр на авторадиографии фильмов или на молекулярном на экране тепловизора. Выявить сигналы от фотографической обработки или цифрового преобразования.
  2. Анализ интенсивности полосы специального программного обеспечения количественного (ImageJ или OptiQuant).

13. Мембрана для зачистки

  1. Чтобы удалить первичные сигналы, погрузить мембраны в 500 мл кипящей десорбирующего раствора, А затем инкубируют при комнатной температуре в течение 1 мин. Перейдите к новой (предварительно) гибридизации и не храните фильтр при -20 ° С.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Следуя общую процедуру, описанную в тексте, а схематически представлено на рисунке 1, мы оценивали экспрессию малых РНК из сложных образцов РНК различного происхождения. В эксперименте, представленной на рисунке 1, РНК выделяли из 2 клеток дрозофилы Шнайдера по добыче протеиназы К, проверяется на целостность (необязательной стадии: денатурирующих агарозном геле фракционирования) и загружается в два раза. Одна половина геля нанесены на нейтральной мембраны и химически сшитый с п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Хотя наша оценка из усложняем сплетающего через который РНК регулирует нейрогенез постоянно растет, механистические последствия РНК на основе электрических схем, затрагивающих нервную биологию стволовых клеток, дифференцировку нейронов / функциональной интеграции, развитие нервных патологий и рака остаются неисследованными. Поддержание таких сетей через царств делает потенциал генетических систем, как дрозофилы важную разгадать неисследованные клеточных путей, в котором короткие некодирующие РНК и факторы транс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным институтом де ла Здоровье и де ла Recherche MEDICALE, Национальный центр де ла Recherche Scientifique, Университет Страсбурга, Hôpital де Страсбург, Ассоциация по ла Recherche сюр ле Рак, Национальный институт дю Рак, Agence Nationale-де-ла Recherche и региона Эльзас.

Пьетро LaNeve была поддержана Fondation Pour La Recherche MEDICALE. В настоящее время он является получателем Istituto Italiano Tecnologia (ИИТ) общения. Расходы на публикации поддерживаются сети Neurex (TriNeuron - Программа Interreg IV Рейн Верхний)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ОКОНЧАТЕЛЬНЫЙ СОСТАВ/НАЗВАНИЕКАТАЛОГ КОМПАНИИ(Stock)КОММЕНТАРИИ
ОБЩИЕ ТРЕБОВАНИЯ
Центрифуга, 5418Eppendorf5418 000.017
Обеззараживающее, РНКаза AwaySigma-Aldrich83931Нанести на стеклянную/пластиковую посуду, протереть и промыть
ингибитор РНКазы, DEPCSigma-AldrichD5758Опасный //// 1609-47-8
ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ
Стереомикроскоп, M60Leica 
1X PBS Буфер
137 мМ NaClSigma-AldrichS30147647-14-5   
2,7 мМ KClSigma-AldrichP95417447-40-7 
10 мМ Na2HPO4Sigma-AldrichS32647558-79-4 
1,8 мМ KH2PO4Sigma-AldrichP97917778-77-0 
ЭКСТРАКТ/АНАЛИЗ РНК
УФ-ВИД СпектрофотометрThermo ScientificNanodrop 2000
Gel Imager, ChemiDoc XRS+Biorad170-8265
Горизонтальный электрофорес, мини-субэлемент GTBioRad170-4487EDU
реагент для экстракции РНК, реагент TRIzolLife Technologies15596026Hazardous
PCA (25:24:1), 1:1 для экстракцииSigma-Aldrich77617136112-00-0
Chlorophorm, 1:1 для экстракцииSigma-AldrichC243267-66-3   
ЭтОН, 2,5 об. для осадков, 70% для промывкиSigma-Aldrich5984464-17-5 
Линейка генов 1Kb Лестница ДНКThermo ScientificSM0311
Стоп Микс
300 мМ NaOAc, pH 5,5Sigma-AldrichS2889127-09-3
1x RSB Раствор
2% додецилсульфат натрия (SDS)Sigma-Aldrich71736Никогда не охлаждайте SDS, чтобы избежать осадков //// 151-21-3
2 мг/мл Протеиназа КРош Прикладная наука0-3115828001EC 3.4.21.64 9
10X Стандартный буфер ретикулоцитов (RSB)
100 мМ трис-Cl, pH 7,4Сигма-ОлдричT59411185-53-1   
100 мМ NaClSigma-AldrichS30147647-14-5   
30 мМ MgCl2Sigma-AldrichM82667786-30-3
Денатурирующий агарозный гель
1,2% АгарозаSigma-AldrichA9539Дайте гелю застыть не менее 1 часа //// 9012-36-2
10X MOPS Буфер
0,2 M MOPS натриевая соль, pH 7Sigma-AldrichM9381Не путайте натриевую соль MOPS с MOPS //// 71119-22-7
Агарозный загрузочный краситель
1x MOPS Буфер
3% формальдегидSigma-AldrichF8775Опасный //// 50-00-0
50% формамидSigma-Aldrich47670Опасный //// 75-12-7
Бромид этидия (EtBr) 30 μ г/млSigma-AldrichE1510Опасный //// 1239-45-8
Бромфенол синий Сигма-ОлдричB0126115-39-9 
МАЛАЯ ФРАКЦИОНАЦИЯ РНК
Плоские насадки для загрузки геляLife TechnologiesLC1002
Savant SpeedVac ConcentratorThermo Scientific DNA120
Вертикальный электрофорез, Mini-PROTEAN Tetra Cell Biorad165-8000
Денатурирующий акриламидный гель
10% акриламид/бис-акриламид (19:1)Sigma-AldrichA3449Опасный. Дайте гелю полимеризоваться в течение 45 минут перед использованием
1x TBE Buffer (или 1x MOPS Buffer)
7 M мочевинаSigma-AldrichU650457-13-6
0,1% персульфат аммонияSigma-Aldrich2155897727-54-0 
0,1% TEMEDSigma-AldrichT9281110-18-9
Линейка гена Лестница ДНК ультранизкого диапазона (10.о.)Thermo ScientificSM1211Метка 0,1 μ g, как описано в разделе "Зонд маркировки" реакция
Акриламид Синий Краситель 
50% формамидSigma-Aldrich47670Опасный //// 75-12-7
Бромфенол синийSigma-AldrichB0126115-39-9 
Рабочий буфер (RB)
1x буфер MOPS 
Альтернативный RB: 1x Буфер
1x Буфер
5X TBE
445 mM Tris-baseSigma-AldrichT150377-86-1 
445 мМ борная кислотаSigma-AldrichB790110043-35-3
20 мМ ЭДТАSigma-AldrichEDS60-00-4   
Гелевый раствор
бромида этидия 0,5 мкм; g/mlSigma-AldrichE1510Hazardous //// 1239-45-8
1x RBОкрашивание на 15 мин с EtBr, удаление пятен на 15 мин без EtBr
БЛОТТИНГ
3MM ватман бумагаSigma-AldrichZ270849
нейтральной нейлоновой мембраной, Hybond NXGE Healthcare Life ScienceRPN203TPhotosensitive
CROSSLINKING
Сшивающий раствор (XLS)
1% 1-метилимидазол (v/v)Sigma-Aldrich336092Всегда готовьте свежую аликвоту XLS //// 616-47-7
12,5 мМ HClSigma-AldrichH1758Опасный //// 7647-01-0
3,1% EDC (v/v)Sigma-Aldrich345025952-53-8   
(PRE)-HYBRIDIZATION
Счетчик жидкого сцинтилляции BeckmannLS 6500
Стриженая сперма лосося, 0,1 мг/мл Life TechnologiesAM9680
rasi4 антисмысловой зонд5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3'5s-rRNA
антисмысловой зонд5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3'Dmel-miR279
антисмысловой зонд5'-TTAATGAGTGTGTGGATCTAGTCA-3'Dmel-miR286
антисмысловой зонд5'- AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3'Набор для
очистки, колонки Illustra MicroSpin G-25GE Healthcare Life Science27-5325-01
(Pre)-Гибридизация Раствор (HS)
0,5% SDSSigma-Aldrich71736151-21-3 
5x Denhardt's Solution
20X SSPE
3.6 M NaClSigma-AldrichS30147647-14-5   
0,2 М фосфат натрияSigma-Aldrich3424837601-54-9   
20 мМ ЭДТА (pH 8,0)Sigma-AldrichEDS  60-00-4   
50x Раствор
1% Ficoll 400 (w/v)Sigma-AldrichF263726873-85-8
1% ПоливинилпирролидонSigma-AldrichPVP409003-39-8
1% BSASigma-AldrichA79069048-46-8   
1X Буфер
10 мМ Tris-Cl (pH 8,0)Sigma-AldrichT150377-86-1 
100 мМ NaClSigma-AldrichS30147647-14-5   
1 мМ ЭДТА (pH 8,0)Sigma-AldrichEDS60-00-4   
Маркировка
0,4 мкм; М олигонуклеотид
1,5 μ l Ci/μ l [γ-32P] АТФПеркин ЭлмерNEG002Aопасен //// 51963-61-2
1x T4 Полинуклеотидкиназа буферBiolabsB0201
T4 Полинуклеотидкиназа 0,5 единиц/μ lBiolabsM0201EC 2.7.1.78
WASH
Детекторы Гейгера МюллераCanberra IndustriesMCB2/CPS –
Промывочный буфер (WB), 2x SSPE
Строгие промывочные буферы
0.2x SSPE
2x SSPE, 0.5% SDS
0.2x SSPE, 0.5% SDS
ОБНАРУЖЕНИЕ СИГНАЛА
PharosFX Plus SystemBiorad170-9460
Изображение JВ свободном доступе
Количество ПервоеBiorad
BioMaxXAR Sigma-AldrichF5888Светочувствительный
проявитель для рентгеновских пленокSigma-AldrichP7042
Фиксер для рентгеновских пленокSigma-AldrichP7167
STRIPPING
Стриппинговый раствор
10 мМ Tris-HCl pH 8,8Sigma-AldrichT150377-86-1 
5 мМ ЭДТАСигма-ОлдричЭДС60-00-4   
0,1% SDSSigma-Aldrich71736Добавить SDS после кипячения во избежание пенообразования //// 151-21-3
TBETBEдля окрашиванияДенхардтаTENщупомEM77021 Рентгеновские пленки ,

Ссылки

  1. The RNA World. Gesteland, R. F., Cech, T. R., Atkins, J. F. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2006).
  2. Mercer, T. R., Dinger, M. E., Mattick, J. S. Long non-coding RNAs: insights into functions. Nat Rev Genet. 10, 155-159 (2009).
  3. Salmena, L., Poliseno, L., Tay, Y., Kats, L., Pandolfi, P. P. A ceRNA hypothesis: the Rosetta Stone of a hidden RNA language? Cell. 146, 353-358 (2011).
  4. Cesana, M., et al. A long noncoding RNA controls muscle differentiation by functioning as a competing endogenous RNA. Cell. 147, 358-369 (2011).
  5. Orphanides, G., Reinberg, D. A unified theory of gene expression. Cell. 108, 439-451 (2002).
  6. Mehler, M. F., Mattick, J. S. Noncoding RNAs and RNA editing in brain development, functional diversification, and neurological disease. Physiol Rev. 87, 799-823 (2007).
  7. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M., Kostas, S., Driver, S., Mello, C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  8. Hamilton, A., Baulcombe, D. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science. 286, 950-952 (1999).
  9. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. Elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75, (1993).
  10. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
  11. Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu Rev Biochem. 79, 351-379 (2010).
  12. Pasquinelli, A. E., et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408, 86-89 (2000).
  13. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Lendeckel, W., Tuschl, T. Identification of novel genes coding for small expressed RNAs. Science. 294, 853-858 (2001).
  14. Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294, 858-862 (2001).
  15. Lee, R. C., Ambros, V. An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans. Science. 294, 862-864 (2001).
  16. Laneve, P., et al. The Gcm/Glide molecular and cellular pathway: new actors and new lineages. Dev Biol. 375, 65-78 (2013).
  17. Hosoya, T., Takizawa, K., Nitta, K., Hotta, Y. Glial cells missing: a binary switch between neuronal and glial determination in Drosophila. Cell. 82, 1025-1036 (1995).
  18. Jones, B. W., Fetter, R. D., Tear, G., Goodman, C. S. Glial cells missing: a genetic switch that controls glial versus neuronal fate. Cell. 82, 1013-1023 (1995).
  19. Vincent, S., Vonesch, J. L., Giangrande, A. Glide directs glial fate commitment and cell fate switch between neurons and glia. Developement. 122, 131-139 (1996).
  20. Cattenoz, P. B., Giangrande, A. Lineage specification in the fly nervous system and evolutionary implications. Cell Cycle. 12, 2753-2759 (2013).
  21. Jones, B. W., Abeysekera, M., Galinska, J., Jolicoeur, E. M. Transcriptional control of glial and blood cell development in Drosophila: cis-regulatory elements of glial cells missing. Dev Biol. 266, 374-387 (2004).
  22. Ragone, G., et al. Transcriptional regulation of glial cell specification. Dev Biol. 255, 138-150 (2003).
  23. Akiyama-Oda, Y., Hosoya, T., Hotta, Y. Asymmetric cell division of thoracic neuroblast 6-4 to bifurcate glial and neuronal lineage in Drosophila. Development. 126, 1967-1974 (1999).
  24. Bernardoni, R., Kammerer, M., Vonesch, J. L., Giangrande, A. Gliogenesis depends on glide/gcm through asymmetric division of neuroglioblasts. Dev Biol. 216, 265-275 (1999).
  25. Ragone, G., Bernardoni, R., Giangrande, A. A novel mode of asymmetric division identifies the fly neuroglioblast 6-4T. Dev Biol. 235, 74-85 (2001).
  26. Soustelle, L., Roy, N., Ragone, G., Giangrande, A. Control of gcm RNA stability is necessary for proper glial cell fate acquisition. Mol Cell Neurosci. 37, 657-662 (2008).
  27. Akiyama, Y., Hosoya, T., Poole, A. M., Hotta, Y. The gcm-motif: a novel DNA-binding motif conserved in Drosophila and mammals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 25, 14912-14916 (1996).
  28. Miller, A. A., Bernardoni, R., Giangrande, A. Positive autoregulation of the glial promoting factor glide/gcm. EMBO J. 17, 6316-6326 (1998).
  29. Krichevsky, A. M., King, K. S., Donahue, C. P., Khrapko, K., Kosik, K. S. A microRNA array reveals extensive regulation of microRNAs during brain development. RNA. 9, 1274-1281 (2003).
  30. Liu, C. G., et al. An oligonucleotide microchip for genome-wide microRNA profiling in human and mouse tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 9740-9744 (2004).
  31. Yin, J. Q., Zhao, R. C., Morris, K. V. Profiling microRNA expression with microarrays. Trends Biotechnol. 26, 70-76 (2008).
  32. Schmittgen, T. D., Jiang, J., Liu, Q., Yang, L. A high-throughput method to monitor the expression of microRNA precursors. Nucleic Acids Res. 32, E43(2004).
  33. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179(2005).
  34. Shi, R., Chiang, V. L. Facile means for quantifying microRNA expression by real-time PCR. Biotechniques. 39, 519-525 (2005).
  35. Raymond, C. K., Roberts, B. S., Garrett-Engele, P., Lim, L. P., Johnson, J. M. Simple quantitative primer-extension PCR assay for direct monitoring of microRNAs and short-interfering RNAs. RNA. 11, 1737-1744 (2005).
  36. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
  37. Linsen, S. E., et al. Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling. Nat Methods. 6, 474-476 (2009).
  38. Valoczi, A., et al. Sensitive and specific detection of microRNAs by northern blot analysis using LNA-modified oligonucleotide probes. Nucleic Acids Res. 32, e175(2004).
  39. Varallyay, E., Burgyan, J., Havelda, Z. Detection of microRNAs by Northern blot analyses using LNA probes. Methods. 43, 140-145 (2007).
  40. Kim, S. W., et al. A sensitive non-radioactive northern blot method to detect small RNAs. Nucleic Acids Res. 38, e98(2010).
  41. Pall, G. S., Hamilton, A. J. Improved northern blot method for enhanced detection of small RNA. Nat Protoc. 3, 1077-1084 (2008).
  42. Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , 2nd, Academic Press, Inc. (2008).
  43. Pall, G. S., Codony-Servat, C., Byrne, J., Ritchie, L., Hamilton, A. Carbodiimide-mediated cross-linking of RNA to nylon membranes improves the detection of siRNA, miRNA and piRNA by northern blot. Nucleic Acids Res. 35, e60(2007).
  44. Guzzardo, P. M., Muerdter, F., Hannon, G. J. The piRNA pathway in flies: highlights and future directions. Curr Opin Genet Dev. 23, 44-52 (2013).
  45. Aravin, A. A., et al. Double-stranded RNA-mediated silencing of genomic tandem repeats and transposable elements in the D. melanogaster germline. Curr. Biol. 11, 1017-1027 (2001).
  46. Vagin, V. V., et al. A distinct small RNA pathway silences selfish genetic elements in the germline. Science. 313, 320-324 (2006).
  47. Brennecke, J., et al. Discrete small RNA-generating loci as master regulators of transposon activity in Drosophila. Cell. 128, 1089-1103 (2007).
  48. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  49. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. J. Vis. Exp. (51), e2641(2011).
  50. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning : a laboratory manual. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  51. Alwine, J. C., Kemp, D. J., Stark, G. R. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridisation with DNA probes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74, 5350-5354 (1977).
  52. Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495, 384-388 (2013).
  53. Flores-Jasso, C. F., Salomon, W. E., Zamore, P. D. Rapid and specific purification of Argonaute-small RNA complexes from crude cell lysates. RNA. 19, 271-279 (2013).
  54. Specchia, V., et al. Hsp90 prevents phenotypic variation by suppressing the mutagenic activity of transposons. Nature. 463, 662-665 (2010).
  55. Várallyay, E., Burgyán, J., Havelda, Z. MicroRNA detection by northern blotting using locked nucleic acid probes. Nat Protoc. 3, 190-196 (2008).
  56. Koscianska, E., Starega-Roslan, J., Czubala, K., Krzyzosiak, W. J. High-resolution northern blot for a reliable analysis of microRNAs and their precursors. ScientificWorldJournal. 11, 102-117 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Детекция РНКэлектрофорез в акриламидном гелеэкстракция РНКгибридизация зондовавторадиографическая детекцияизоляция РНКперенос с геля
Улучшенная Северная Клякса обнаружения малых РНК видов в Дрозофилы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.