Целью данной публикации является визуализация и обсудить оперативные шаги для улучшенного протокола Северная пятно на РНК, выделенной из Дрозофилы эмбрионов, клетки и ткани. Этот протокол является особенно полезным для эффективного обнаружения мелких видов РНК.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Улучшенная Северная Клякса обнаружения малых РНК видов в Дрозофилы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В последние десятилетия мы стали свидетелями взрыва научного интереса вокруг механизмов контроля экспрессии генов на уровне РНК. Эта отрасль молекулярной биологии была значительно подпитывается открытием некодирующих РНК в качестве основных игроков в пост-транскрипционной регуляции. Такая революционная перспектива сопровождается и вызвано развитием мощных технологий для профилирования короткий выражение РНК, как на уровне высокой пропускной (генома идентификации) или как одного кандидата анализа (стационарного накопления конкретных видов). Хотя несколько состояние дел в области стратегии в настоящее время доступны для дозирования или визуализации таких бегущих молекулы, Северная Клякса анализ остается право подход в молекулярной биологии для немедленного и точного вычисления выражения РНК. Она представляет первый шаг к применению более сложных, дорогостоящих технологий и, во многих случаях, остается льготный способ легко получить представлениев РНК биологии. Здесь мы обзору эффективный протокол (Enhanced Северная Клякса) для обнаружения слабо выраженные микроРНК (или других мелких нормативные вид РНК) из Дрозофилы целые эмбрионы, вручную расчлененный личинок / взрослых тканей или в пробирке культивируемых клетках. Очень ограниченное количество РНК не требуется, и использование материала, из проточной цитометрии-изолированные клетки могут быть также предусмотрены.
Введение
РНК биохимия пережил захватывающие прогрессирует в последние годы 1. Наша осмысление РНК потенциала в контроле экспрессии генов был лопнуть от идентификации мощных некодирующих рибо- регуляторов 2, в связи с открытием новых РНК на основе регуляторных механизмов 3,4 и более глубоким характеристик уже известных посттранскрипционных событий 5. Все вместе эти исследования позволили РНК биологии резко сделать сцену, став основным предметом исследования в современной научной ландшафта. В частности, за последние годы мы получаем ощущение всепроникающей влияния "мира РНК" на молекулярном нейробиологии 6, один из наиболее....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1 Сбор образцов
- Снять 2 клетки полу-приверженцем Шнайдера, (1-5 х 10 6 клеток в среднем), с помощью пипетки и собирать их с помощью центрифугирования (100 мкг в течение 1 мин). В случае, культивированных в пробирке адгезивных клеток, Trypsinize их в стандартных условиях или непосредственно собирают их из пластин в удобном количестве РНК извлечения реагента, по помощью клеточным скребком.
- Для получения эмбрионов, растут линии дрозофил в лету клетках и пусть эмбрионы накапливаются на откладки яиц пластин. Протрите эмбрионов прочь кистью в дистиллированной воде (DH 2 O), отбросить мусор ситовым фильтрации, про....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Следуя общую процедуру, описанную в тексте, а схематически представлено на рисунке 1, мы оценивали экспрессию малых РНК из сложных образцов РНК различного происхождения. В эксперименте, представленной на рисунке 1, РНК выделяли из 2 клеток дрозофилы Шнайдера по добыче протеиназы К, проверяется на целостность (необязательной стадии: денатурирующих агарозном геле фракционирования) и загружается в два раза. Одна половина геля нанесены на нейтральной мембраны и химически сшитый с п.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Хотя наша оценка из усложняем сплетающего через который РНК регулирует нейрогенез постоянно растет, механистические последствия РНК на основе электрических схем, затрагивающих нервную биологию стволовых клеток, дифференцировку нейронов / функциональной интеграции, развитие нервных патологий и рака остаются неисследованными. Поддержание таких сетей через царств делает потенциал генетических систем, как дрозофилы важную разгадать неисследованные клеточных путей, в котором короткие некодирующие РНК и факторы транс.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана Национальным институтом де ла Здоровье и де ла Recherche MEDICALE, Национальный центр де ла Recherche Scientifique, Университет Страсбурга, Hôpital де Страсбург, Ассоциация по ла Recherche сюр ле Рак, Национальный институт дю Рак, Agence Nationale-де-ла Recherche и региона Эльзас.
Пьетро LaNeve была поддержана Fondation Pour La Recherche MEDICALE. В настоящее время он является получателем Istituto Italiano Tecnologia (ИИТ) общения. Расходы на публикации поддерживаются сети Neurex (TriNeuron - Программа Interreg IV Рейн Верхний)
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| ОКОНЧАТЕЛЬНЫЙ СОСТАВ/НАЗВАНИЕ | КАТАЛОГ КОМПАНИИ | (Stock) | КОММЕНТАРИИ |
| ОБЩИЕ ТРЕБОВАНИЯ | |||
| Центрифуга, 5418 | Eppendorf | 5418 000.017 | |
| Обеззараживающее, РНКаза Away | Sigma-Aldrich | 83931 | Нанести на стеклянную/пластиковую посуду, протереть и промыть |
| ингибитор РНКазы, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | Опасный //// 1609-47-8 |
| ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ | |||
| Стереомикроскоп, M60 | Leica | ||
| 1X PBS Буфер | |||
| 137 мМ NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
| 2,7 мМ KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | 7447-40-7 |
| 10 мМ Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | 7558-79-4 |
| 1,8 мМ KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | 7778-77-0 |
| ЭКСТРАКТ/АНАЛИЗ РНК | |||
| УФ-ВИД Спектрофотометр | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Gel Imager, ChemiDoc XRS+ | Biorad | 170-8265 | |
| Горизонтальный электрофорес, мини-субэлемент GT | BioRad | 170-4487EDU | |
| реагент для экстракции РНК, реагент TRIzol | Life Technologies | 15596026 | Hazardous |
| PCA (25:24:1), 1:1 для экстракции | Sigma-Aldrich | 77617 | 136112-00-0 |
| Chlorophorm, 1:1 для экстракции | Sigma-Aldrich | C2432 | 67-66-3 |
| ЭтОН, 2,5 об. для осадков, 70% для промывки | Sigma-Aldrich | 59844 | 64-17-5 |
| Линейка генов 1Kb Лестница ДНК | Thermo Scientific | SM0311 | |
| Стоп Микс | |||
| 300 мМ NaOAc, pH 5,5 | Sigma-Aldrich | S2889 | 127-09-3 |
| 1x RSB Раствор | |||
| 2% додецилсульфат натрия (SDS) | Sigma-Aldrich | 71736 | Никогда не охлаждайте SDS, чтобы избежать осадков //// 151-21-3 |
| 2 мг/мл Протеиназа К | Рош Прикладная наука | 0-3115828001 | EC 3.4.21.64 9 |
| 10X Стандартный буфер ретикулоцитов (RSB) | |||
| 100 мМ трис-Cl, pH 7,4 | Сигма-Олдрич | T5941 | 1185-53-1 |
| 100 мМ NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
| 30 мМ MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | 7786-30-3 |
| Денатурирующий агарозный гель | |||
| 1,2% Агароза | Sigma-Aldrich | A9539 | Дайте гелю застыть не менее 1 часа //// 9012-36-2 |
| 10X MOPS Буфер | |||
| 0,2 M MOPS натриевая соль, pH 7 | Sigma-Aldrich | M9381 | Не путайте натриевую соль MOPS с MOPS //// 71119-22-7 |
| Агарозный загрузочный краситель | |||
| 1x MOPS Буфер | |||
| 3% формальдегид | Sigma-Aldrich | F8775 | Опасный //// 50-00-0 |
| 50% формамид | Sigma-Aldrich | 47670 | Опасный //// 75-12-7 |
| Бромид этидия (EtBr) 30 μ г/мл | Sigma-Aldrich | E1510 | Опасный //// 1239-45-8 |
| Бромфенол синий | Сигма-Олдрич | B0126 | 115-39-9 |
| МАЛАЯ ФРАКЦИОНАЦИЯ РНК | |||
| Плоские насадки для загрузки геля | Life Technologies | LC1002 | |
| Savant SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific | DNA120 | |
| Вертикальный электрофорез, Mini-PROTEAN Tetra Cell | Biorad | 165-8000 | |
| Денатурирующий акриламидный гель | |||
| 10% акриламид/бис-акриламид (19:1) | Sigma-Aldrich | A3449 | Опасный. Дайте гелю полимеризоваться в течение 45 минут перед использованием |
| 1x TBE Buffer (или 1x MOPS Buffer) | |||
| 7 M мочевина | Sigma-Aldrich | U6504 | 57-13-6 |
| 0,1% персульфат аммония | Sigma-Aldrich | 215589 | 7727-54-0 |
| 0,1% TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | 110-18-9 |
| Линейка гена Лестница ДНК ультранизкого диапазона (10.о.) | Thermo Scientific | SM1211 | Метка 0,1 μ g, как описано в разделе "Зонд маркировки" реакция |
| Акриламид Синий Краситель | |||
| 50% формамид | Sigma-Aldrich | 47670 | Опасный //// 75-12-7 |
| Бромфенол синий | Sigma-Aldrich | B0126 | 115-39-9 |
| Рабочий буфер (RB) | |||
| 1x буфер MOPS | |||
| Альтернативный RB: 1x Буфер | |||
| 1x Буфер | |||
| 5X TBE | |||
| 445 mM Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | 77-86-1 |
| 445 мМ борная кислота | Sigma-Aldrich | B7901 | 10043-35-3 |
| 20 мМ ЭДТА | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
| Гелевый раствор | |||
| бромида этидия 0,5 мкм; g/ml | Sigma-Aldrich | E1510 | Hazardous //// 1239-45-8 |
| 1x RB | Окрашивание на 15 мин с EtBr, удаление пятен на 15 мин без EtBr | ||
| БЛОТТИНГ | |||
| 3MM ватман бумага | Sigma-Aldrich | Z270849 | |
| нейтральной нейлоновой мембраной, Hybond NX | GE Healthcare Life Science | RPN203T | Photosensitive |
| CROSSLINKING | |||
| Сшивающий раствор (XLS) | |||
| 1% 1-метилимидазол (v/v) | Sigma-Aldrich | 336092 | Всегда готовьте свежую аликвоту XLS //// 616-47-7 |
| 12,5 мМ HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | Опасный //// 7647-01-0 |
| 3,1% EDC (v/v) | Sigma-Aldrich | 3450 | 25952-53-8 |
| (PRE)-HYBRIDIZATION | |||
| Счетчик жидкого сцинтилляции | Beckmann | LS 6500 | |
| Стриженая сперма лосося, 0,1 мг/мл | Life Technologies | AM9680 | |
| rasi4 антисмысловой зонд | 5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3'5s-rRNA | ||
| антисмысловой зонд | 5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3'Dmel-miR279 | ||
| антисмысловой зонд | 5'-TTAATGAGTGTGTGGATCTAGTCA-3'Dmel-miR286 | ||
| антисмысловой зонд | 5'- AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3'Набор для | ||
| очистки, колонки Illustra MicroSpin G-25 | GE Healthcare Life Science | 27-5325-01 | |
| (Pre)-Гибридизация Раствор (HS) | |||
| 0,5% SDS | Sigma-Aldrich | 71736 | 151-21-3 |
| 5x Denhardt's Solution | |||
| 20X SSPE | |||
| 3.6 M NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
| 0,2 М фосфат натрия | Sigma-Aldrich | 342483 | 7601-54-9 |
| 20 мМ ЭДТА (pH 8,0) | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
| 50x Раствор | |||
| 1% Ficoll 400 (w/v) | Sigma-Aldrich | F2637 | 26873-85-8 |
| 1% Поливинилпирролидон | Sigma-Aldrich | PVP40 | 9003-39-8 |
| 1% BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | 9048-46-8 |
| 1X Буфер | |||
| 10 мМ Tris-Cl (pH 8,0) | Sigma-Aldrich | T1503 | 77-86-1 |
| 100 мМ NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
| 1 мМ ЭДТА (pH 8,0) | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
| Маркировка | |||
| 0,4 мкм; М олигонуклеотид | |||
| 1,5 μ l Ci/μ l [γ-32P] АТФ | Перкин Элмер | NEG002A | опасен //// 51963-61-2 |
| 1x T4 Полинуклеотидкиназа буфер | Biolabs | B0201 | |
| T4 Полинуклеотидкиназа 0,5 единиц/μ l | Biolabs | M0201 | EC 2.7.1.78 |
| WASH | |||
| Детекторы Гейгера Мюллера | Canberra Industries | MCB2/CPS – | |
| Промывочный буфер (WB), 2x SSPE | |||
| Строгие промывочные буферы | |||
| 0.2x SSPE | |||
| 2x SSPE, 0.5% SDS | |||
| 0.2x SSPE, 0.5% SDS | |||
| ОБНАРУЖЕНИЕ СИГНАЛА | |||
| PharosFX Plus System | Biorad | 170-9460 | |
| Изображение J | В свободном доступе | ||
| Количество Первое | Biorad | ||
| BioMax | XAR Sigma-Aldrich | F5888 | Светочувствительный |
| проявитель для рентгеновских пленок | Sigma-Aldrich | P7042 | |
| Фиксер для рентгеновских пленок | Sigma-Aldrich | P7167 | |
| STRIPPING | |||
| Стриппинговый раствор | |||
| 10 мМ Tris-HCl pH 8,8 | Sigma-Aldrich | T1503 | 77-86-1 |
| 5 мМ ЭДТА | Сигма-Олдрич | ЭДС | 60-00-4 |
| 0,1% SDS | Sigma-Aldrich | 71736 | Добавить SDS после кипячения во избежание пенообразования //// 151-21-3 |
Ссылки
- The RNA World. Gesteland, R. F., Cech, T. R., Atkins, J. F. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2006).
- Mercer, T. R., Dinger, M. E., Mattick, J. S. Long non-coding RNAs: insights into functions. Nat Rev Genet. 10, 155-159 (2009).
- Salmena, L., Poliseno, L., Tay, Y., Kats, L., Pandolfi, P. P.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
