После воздействия специфических стрессоров окружающей среды, нематода Caenorhabditis elegans претерпевает обширную фенотипическую пластичность, чтобы перейти в стрессоустойчивую ювенильную стадию 'dauer'. Представлены методы контролируемой индукции и визуализации нейропластичности во время Дауэра.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В естественных изображений из Dauer конкретным нейронов ремоделирования в C. Элеганс
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Механизмы, контролирующие вызванное стрессом фенотипическую пластичность у животных часто сложным и трудным для изучения в естественных условиях. Классическим примером индуцированной стрессом пластичности является этап Dauer из C. Элеганс. Dauers являются альтернативой развития личиночной стадии формируются в условиях низких концентраций бактериальной пищи и высоких концентраций DauER феромона. Dauers отображения обширный развития и поведения пластичность. Например, набор из четырех внутренний-губной квадранте (IL2Q) нейроны претерпевают обратимое обширную реконструкцию в процессе формирования DauER. Используя известную запись экологические тропы регулирования DauER, ранее установленного способа для производства сырой DauER феромона от крупномасштабных жидкость нематод культур демонстрируется. С помощью этого метода, концентрации 50000 - 75000 нематоды / мл жидкой культуры является достаточным для получения высокой активностью сырой DauER феромон. Сырой феромон потенция Determined по биоанализе доза-реакция. Наконец, методы, используемые для в естественных условиях покадровой съемки из IL2Qs при формировании DauER описаны.
Введение
Фенотипический пластичность, в том числе развития и состояния психического пластичности, имеет важное значение для адаптации к неблагоприятным условиям окружающей среды и считается движущей силой в эволюции 1. C. Элеганс является модельным организмом часто используются для исследований в области развития и нейробиологии. В идеальных условиях, C. Элеганс развивается через четыре личиночной стадии перед входом в репродуктивной стадии взрослого. Тем не менее, в условиях низкой доступности пищи и высокой плотностью населения, C. Элеганс могут пройти переключатель с развитием и войти в долгоживущих и стресс-устойчивых этапе DauER
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1 Сырая Dauer Феромоны Производство
- Вырастить OP50 Е. палочки из одной колонии O / N при 37 ° С при встряхивании в 100 мл LB бульоне при 200 оборотах в минуту. Примечание: Эта O / N. культуры могут быть сделаны заранее и хранили при 4 ° С.
- Вырастить N2 C. Элеганс на 15 - 20 6 см чашки Петри с NGM агар (Просмотреть рецепт в таблице 1), засеянного с 50 мкл OP50 Е. палочка до бактерий не близок к исчерпанию 19.
- Сделать 5x 250 мл S СМИ (см рецепт в таблице 1) в 1 л конических колб 19. Примечание: Это решение может быть сделано заблаговременно.
- Вырастить культуру OP50 Е. палочка<....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Производство результатов сырой Dauer феромонных в желтой жидкости (рисунок 1), что является одновременно тепло и холод стабильной. Аликвоты сырого феромона хранятся при температуре от -20 ° С до бесконечности без очевидного потери активности. После производства феромона, один биологический анализ доза-реакция достаточно для грубой оценки потенции. Тем не менее, для большинства экспериментов необходимо повторить биопроб 2 - 3 раза и занимает в среднем от каждого эксперимента. Типичные результаты двух фер.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Экспертиза DauER конкретных нейропластичностью и других DauER связанных морфологических изменений требует контролируется и надежный формирование dauers либо с помощью генной мутации (т.е., DAF-с-мутантов) или воздействия животных дикого типа к феромона. В то время как использование генетической мутации, чтобы вызвать dauers удобно, он может путать результаты. Поэтому данные, собранные с DAF-с мутациями должны быть впоследствии подтвержден с животных дикого типа индуцированных на сцену DauER воздействие.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать
Благодарности
Я благодарю доктора Морин Барр, под руководством которой был первоначально охарактеризован фенотип ремоделирования dauer IL2. Благодарим доктора К. Бритта Карлсона за критическое прочтение рукописи. Финансирование лаборатории Барра было предоставлено NIH (5R01DK59418) и постдокторскими стипендиями от Министерства сельского хозяйства США (2010-65106-20587) и Комиссии Нью-Джерси по исследованию спинного мозга (CSCR12FEL004). В настоящее время эта работа финансируется за счет гранта ACES FIRE Университета штата Иллинойс в Урбане-Шампейне.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| N2 C. elegans Bristol strain | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III | По запросу из лаборатории | ||
| PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V | По запросу из лаборатории | ||
| JK2868 qIs56[Plag-2:: gfp] V | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| OP50 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Petri чашки | Tritech Research | 60 мм T3308, 35 мм T3501 | |
| NGM агар | Различные | 3 г NaCl, 17 г агара, 2,5 г пептона в 975 мл H2O автоклавный охлажденный до 55° C с последующим приемом 1 мл 5 мг/мл холестерина в этаноле, 25 мл 1 М KPO4 буфера (pH 6,0), 1 мл 1 M CaCl2, 1 мл 1 M MgSO4 | |
| S среды | Различные | S-среды состоят из S-базального раствора (1,46 г NaCl, 0,25 г K2HPO4, 1,5 г KH2PO4, 0,25 мл 5 мг/мл холестерина в этаноле и H2O до 250 мл. Автоклавированный.) К базальному раствору S добавить 2,5 мл цитрата калия pH 6,0 (2 г моногидрата лимонной кислоты, 29,4 г три-цитрата натрия моногидрат<суб>, H<суб>2О до 100 мл, автоклавированный), 2,5 мл раствора микропримесей металлов (1,86 г динатрия ЭДТА, 0,69 г FeSO<суб>4 • 7 H2O, 0,2 г MnCl2• 4 H2O, 0,29 г ZnSO4 • 7 H2O, 0,025 г CuSO4 • 5 H2O, H2O до 1 л. Автоклавировать и хранить в темноте), 0,75 мл 1 M CaCl2 и 0,75 мл 1 M MgSO4. | |
| Феромонные тарелки Дауэра для анализа «доза-ответ | Various | Mix 0,085 г благородного агара, 0,5 мл 0,513 М NaCl и 5 & микро; л 5 мг/мл холестерина, растворенного в этаноле в каждой из 6 культуральных пробирок по 15 мл. Добавьте достаточное количество сырого феромона в каждую пробирку, чтобы создать диапазон концентраций. Добавьте H2O, чтобы довести объем до 4,725 мл. Кипятите на конфорке Бунзена, пока агар не растворится, а затем охладите до 55 °C. Добавьте 125 & микро; l 1 М KPO4 буфер (pH 6,0), 50 &; l 0,1 M CaCl2, 50 &; l 0,1 М MgSO4 и 50 &m; л 5 мг/мл стрептомицина сульфата в каждую пробирку. Вылейте содержимое каждой трубки в чашку Петри диаметром 35 мм. Дайте агару застыть при комнатной температуре в течение ночи (если дольше, храните в закрытой таре, чтобы предотвратить чрезмерное высыхание). | |
| Микросферные шарики 0,1 мкм | Polysciences Inc. | 00876-15 | |
| M9 буферная | смесь 3 г KH2PO4, 6 г Na2HPO4, 5 г NaCl, 1 мл 1 M MgSO4, H2O до 1 литра. Стерилизация автоклавированием |
Ссылки
- West-Eberhard, M. J. Developmental Plasticity and Evolution. , Oxford University Press. (2003).
- Cassada, R. C., Russell, R. L. The dauerlarva, a post-embryonic developmental variant of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 46, 326-342 (1975).
- Riddle, D. L., Al....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
