Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Тандем Замораживание высокого давления и резких похолоданий Замена тканей растений для просвечивающей электронной микроскопии

16.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51844

⸱

13 октября 2014 г.

 ,  , 
1Department of Biochemical, Cellular and Molecular Biology, University of Tennessee, Knoxville, 2Advanced Microscopy and Imaging Facility, University of Tennessee, Knoxville

В этой статье

Краткое содержание

Получение высококачественных изображений с помощью просвечивающей электронной микроскопии является сложной задачей, особенно в случае растительных клеток, которые имеют большое количество заполненных водой вакуолей и аэрированных пространств. Тандемная заморозка под высоким давлением и быстрая замена замораживанием значительно сокращают время подготовки образцов растений к ПЭМ, получая образцы с отличной ультраструктурной сохранностью.

Аннотация

Поскольку электрон передачи 1940s микроскопии (ПЭМ) оказывает биологов с изображениями ультра-высокого разрешения биологических материалов. Тем не менее, из трудоемких и затратных по времени протоколов, которые также требуют опыт в подготовке без артефактов, образцов, ТЕМ не считается методика удобно. Традиционный пробоподготовки для ПЭМ использовали химические фиксаторы, чтобы сохранить клеточные структуры. Замораживание высокого давления является cryofixation биологических образцов при высоких давлениях производить очень быстрые скорости охлаждения, тем самым ограничивая образование льда, который наносит ущерб целостности клеточной ультраструктуры. Замораживание высокого давления и замена замораживания в настоящее время методом выбора для производства самого высокого качества морфологии в секциях смолы для ТЭМ. Эти методы минимизации артефактов, обычно связанные с традиционной обработке для ТЭМ тонких срезов. После cryofixation замерзшей воды в образце жидкости заменяетсяорганический растворитель при низких температурах, этот процесс называется замещение замерзания. Замораживание замена обычно проводят в течение нескольких дней в посвященном, дорогостоящего оборудования. Недавнее нововведение позволяет процесс должен быть завершен в течение трех часов, вместо обычных двух дней. Это, как правило, следует еще несколько дней пробоподготовки, который включает инфильтрацию и встраивания в эпоксидных смол, прежде чем секционирования. Здесь мы приводим протокол, сочетающий замораживание высокого давления и быстрое замещение замораживания, что позволяет образец фиксация завод, чтобы быть достигнуто в течение нескольких часов. Протокол может быть легко адаптирован для работы с другими тканями или организмов. Растительные ткани вызывают особую озабоченность в связи с наличием газированных пространств и заполненных водой вакуолей, которые препятствуют свободной ото льда замерзание воды. Кроме того, процесс химической фиксации особенно долго растений за счет клеточных стенок, препятствующих проникновению химических веществ, чтобы глубоко в ткани. Растительные ткани, следовательно, участнлярно сложным, но этот протокол является надежным и производит образцы высочайшего качества.

Введение

Наше знание ультраструктуры клеток поступает в основном из электронной микроскопии, которые могут решить детали в диапазоне от нескольких нанометров 1. Несмотря на то, настолько мощным, в резолюции ТЭМ не считается удобной, как подготовка образца требуется много времени и трудоемкие протоколы, и требует определенного опыта от врача. Традиционный фиксация образцов объединил использование альдегидов и осмия перед дальнейшей обработки, которая включает обезвоживание, вложение в смоле, а затем секционирования производить ультратонкие срезы, которые затем окрашивали тяжелых металлов. Тем не менее, известно, что химической фиксации может производить артефакты в том числе агрегации белка и липидов потери 1, и изменения в мембранах, что, в конечном счете влияют несколько клеточных компартментах 2. Эти артефакты в основном связано с медленной скоростью фиксации и дегидратации при комнатной температуре 3, 4, 5.

Cryofixation замораживанием высокого давления (ФВЧ) позволяет избежать большинства артефактов, вызванных химической фиксации. Принцип cryofixation в том, что он снижает температуру замерзания воды на 20 градусов, замедляет зародышеобразования и роста кристаллов льда, и увеличивает вязкость воды в биологическом образце, так что клеточные компоненты, по существу, иммобилизованные 6, 7. ФВЧ уменьшается Температура образца для жидкого азота, под очень высоким давлением (210 МПа или 2100 бар) в миллисекундах. Если все сделано правильно ФВЧ предотвращает образование крупных кристаллов льда, которые могут вызвать серьезные повреждения ультраструктуры клеток. ФВЧ может быть использован для фиксации образцов толщиной 100-200 мкм при типичных концентраций растворенных веществ в биологических 7. Существуют многочисленные отзывы на физике и принципы, лежащие в основе ФВЧ, например, 1, 7, 8.

После HPF, образцы инкубируют при низкой температуре (-78,5 ° С до -90 &# 176; C) в присутствии жидких органических растворителей, содержащих химических фиксаторов как осмия, как правило, в течение нескольких дней. При такой низкой температуре, вода в образце заменяется на органическом растворителе, обычно ацетон или метанол, 1 9. Таким образом, этот процесс называется замена замораживания (FS). Затем образец постепенно нагревают, и в течение этого времени является фиксированной, как правило, с осмия и уранил-ацетатом 9. Сшивание при низких температурах обладает тем преимуществом, фиксации молекулы, которые иммобилизованных 1. FS, следовательно, производит образцы высшего качества по сравнению с теми, фиксированный с помощью обычной химической фиксации при комнатной температуре, в частности, это приводит к улучшенным сохранением ультраструктуры, лучшей сохранности антигенности и уменьшить потерю несвязанных клеточных компонентов 10, 11.

Большинство FS осуществляется в течение длительных периодов времени, как правило, до нескольких дней. Это особенно Truе для растений образцов 12, 13, 14. Недавнее протокол, разработанный Макдональд и Уэбб значительно сокращает время для FS от нескольких дней до нескольких часов 15. В их быстрого замещения замораживания (QFS) процедуры, FS осуществляется в течение 3 часов, в то время как в супер быстрых FS образцы (SQFS) обрабатываются в течение 90 минут. Качество образцов, полученных с помощью этих методов можно сравнить с теми, которые давала традиционных протоколов FS. Мы приняли протокол QFS для глубокой переработки растительных образцов после ФВЧ. Это оказалось сэкономить не только время, но и деньги, как QFS и SQFS использовать здравый лабораторного оборудования вместо дорогостоящих коммерчески доступных машин ФС.

Растительные ткани, часто очень сложной, чтобы подготовиться к ТЭМ. В среднем, растительные клетки крупнее, чем либо бактериальных или животных клеток. Наличие гидрофобного восковой кутикулы, толстые клеточные стенки, крупных емкостей, заполненных водой вакуолей, содержащих органические кислоты, гидролазы и фенольного Compounds, что может занимать до 90% от общего объема клеточной 16, и присутствие газированных пространств строго уменьшается теплопроводность системы 17. Кроме того, в случае растений, толщина образца почти всегда превышает 20 мкм, предел для использования химической фиксации. В этих толщин, низкой теплопроводности воды предотвращает замораживание со скоростью больше, чем -10000 ° C / сек в центре образца. Этот показатель необходим, чтобы избежать повреждения гексагональную образование льда (ледяные кристаллы с более низкой плотностью и больше, чем от 10 до 15 нм) 8. Вместе, эти нынешние вызовы как надлежащего замораживания образца и последующих FS. Тем не менее, cryofixation является лучшим методом для фиксации образцы растений. Вот это протокол для ФВЧ-QFS образцов ткани растений представлена. Она сосредоточена на модель вида Arabidopsis THALIANA, но также используется с Nicotiana benthamiana. Типичные результаты показывают, что HPF-QFS производит саmples сопоставимого качества традиционных HPF-FS в долю времени. При правильном корректировок, этот протокол также может быть использована для других относительно толстых биологических образцах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура QFS требует крайней осторожности и осторожности со стороны пользователя, и мы выделить эти меры предосторожности здесь как предупреждения и примечания, где это возможно.

1.Preparation для ФВЧ Run

  1. Перед началом подготовки образцов, включите морозильник высокого давления в соответствии с инструкциями изготовителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ФВЧ единица, используемая в данном протоколе является Вольвенд Компактный 02 единица (1А), и это занимает примерно 12:59-и с половиной часов процедуры запуска до ФВЧ работает может начаться.
    1. Включение Вольвенд Компактный 02 высокого давления Freezer.
      1. Включите инструмент, поворачивая главный выключатель от "0" до "1".
      2. Выпуск сжатого воздуха к машине.
      3. Выпуск жидкого азота к машине.
      4. Нажмите кнопку "SYSTEM высохнуть".
      5. Через 30 мин, нажмите "SysteM высыхают "кнопку еще раз.
      6. Нажмите кнопку "ON / OFF" для переключения на инструмент.
      7. Нажмите кнопку «Азот».
      8. Дайте машине остыть в течение 20 минут, даже если «DRIVE IN" кнопки уже загорелись.
      9. «DRIVE IN» включается подсветка кнопки.
      10. Нажмите "Drive In" кнопку.
      11. Нажмите кнопку "AUTO".
      12. В "Система готова" подсветка кнопки.
      13. Поместите зонд температуры и давления в барокамере и зафиксируйте его с пальца.
      14. Нажмите кнопку "JET AUTO". Эта операция проверяет, что повышение давления и понижение температуры являются по желанию; существенно пробный запуск. Резкие перепады температуры и резких скачков давления, как ожидается (Рисунок 1В).
      15. Провести еще два циклы JET.

2 Подготовка к Receiviнг Замороженные образцы

  1. Заполните изолированную коробку с криопробирку держатели с жидким азотом (см Техника безопасности), так что держатели полностью покрыты (Рисунок 1C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование СИЗ включая cryogloves и очки при работе с жидким азотом.
  2. Поместите необходимое количество флаконов, содержащих среду FS в держатели алюминиевой трубы в жидком азоте (Рисунок 1C). С помощью этого протокола до четырех дисков каждый из которых содержит один образец может быть помещен в одном криопробирку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Флаконы должны быть маркированы с острым инструментом, как алмазным писца и очень мягким карандашом.
    1. Для фиксатора во QFS использовать 1% ОСО 4 и 0,1% уранилацетатом в ацетоне 9. Готовят раствор в большом объеме, обойтись аликвоты 1,5 мл в криопробирки и магазина, замороженных в жидком азоте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте Предупреждения по технике безопасности для работы ОСО 4 и уранилацетатом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: OsO 4 и уранилацетатом опасные химические вещества и должны быть обработаны в вытяжной шкаф, а носить соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), включая закрытые носком обуви, халате и перчатках.
      ПРИМЕЧАНИЕ: криопробирки, используемые для хранения образцов для QFS, должны иметь твердое уплотнительное кольцо, чтобы убедиться, что трубы остаются запечатанными во QFS чтобы избежать утечки OsO 4.
  3. Подготовка дрожжевой пасты путем смешивания пекарских дрожжей с примерно равным объемом 10% метанола с помощью зубочистки или другим подобным инструментом, пока паста не станет однородной. Дрожжи паста действует как внеклеточный криопротекторов и используется, чтобы заполнить пространство вокруг образца в носителе образца. Количество пасты зависит от количества образцов; для 10 образцов или меньше пасты (1 мл) могут быть смешаны в микроцентрифужных трубки.

3 высокого давления Замораживание образцов

  1. Удалить лист (или другой ткани) интерес со стороны завода и аккуратно поместить его на листке Дентал воск или другой режущей поверхности. С помощью штампа в 2,0 мм или желаемого размера, чтобы вырезать образец из листа. Ручка пробу осторожно с парой щипцов и работать как можно быстрее.
  2. Работая под микроскопом рассекает положите лист диска в 0,2 мм стороне Тип образец носителя и полностью покрывать в дрожжевой пастой. Убедитесь, что диск полностью заполнен и паста на одном уровне с краем держателя путем сглаживания пасты с тонкой кистью (Рисунок 2).
  3. Вставьте носитель в держатель образца. Обложка образца с Тип B образца носителя, плоской поверхности вниз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держатель образца должна быть сухой и при комнатной температуре.
  4. Возьмите образец в держатель образца, вставить ее в машину и инициировать замерзания цикл, нажав на кнопку "JET AUTO", который должен завершить в секунду или две.
  5. Работа как можно быстрее, снимите держатель из машины и поместить кончик проведения SAMPле в жидкий азот в изолированный ящик на верхней части машины ФВЧ. Погрузить кончики двух пар щипцов в жидком азоте, чтобы охладить их.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После замораживания, носители должны быть обработаны только с жидкими щипцов азота охлаждением. Теплые (комнатная температура) щипцы часто являются причиной отказа в cryotechniques.
  6. Откройте криопробирку содержащий СМИ FS, и поместите крышку на стороне коробки. С помощью пары жидких щипцов азота охлаждением, аккуратно извлеките диск из держателя образцов, гарантируя, что диск всегда находится в жидком азоте или парах. Работа в парах жидкого азота, удерживайте FS трубку с одним предварительно охлаждается пинцетом и использовать другой поместить держатель в FS флаконе. Винтовые крышки ФР флакон обратно. У не зажаты жидкого азота в ампуле.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При передаче образцов для криопробирки для QFS, обеспечению того, чтобы жидкий азот не попавшие в флаконах. Жидкий азот расширяется 700 раз во время потепления и любой Trappeг жидкого азота может привести к взрыву в течение этого времени.
  7. Повторите шаги 3,1 до 3,7, пока все нужные Образцы замораживают. Несколько дисков листьев, содержащие один и тот же тип образца могут быть размещены в том же самом флаконе. Следует отметить, что держатель образца должен быть высушен и доводили до комнатной температуры замерзания между запусками. Чтобы сделать это быстро, нагреть его с феном, и контролировать его температуру на ощупь.

4 Подготовка к Замена замораживания

  1. Полностью погрузите Блок отопителя алюминия в жидком азоте в течение 10 мин или до пузырькового кипение не прекратится. В то время как это происходит, разместить слой сухого льда (1-2 см) в нижней части контейнера, используемого в качестве камеры FS (рисунок 3). Пенополистирола контейнер или ведро льда может быть использован для FS, вместе с измельченной сухой лед или гранул.
  2. Быстро вставить криопробирки содержащие образцы вместе с датчиком температуры в средних рядах блока нагревателя. Убедитесь, что крышки наФлаконы плотно привинчена так что FS СМИ не просачивается во FS. Начните запись температуры.
    1. Сделать датчик температуры, поместив термопары через верхнюю часть криопробирку таким образом, что она достигает дна трубки. Закрыть крышку трубки смолой так, чтобы жидкость не просачивается. Заполните трубку с 1,5 мл ацетона в начале каждого QFS перспективе.
  3. Использование изолированных cryogloves или большие щипцы, выльет жидкого азота от блока нагревателя. Будьте осторожны, не вылейте криопробирки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование СИЗ включая cryogloves и очки при работе с жидким азотом.
  4. Поместите блок, содержащий флаконов на слой сухого льда в QFS камеры. Убедитесь, что блок размещен так, что трубы лежат горизонтально, а с небольшим наклона вверх. Там не должно быть никакой утечки, если используются правильные криопробирки.
  5. Упакуйте QFS камеру с сухим льдом, так что FS трубки покрыты, хотя это не является необходимым дляпокрыть верхнюю часть блока. Поместите крышку на камере.

5 Быстрый FS

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните QFS работать в вытяжном шкафу в том случае, если любая утечка OsO 4 непреднамеренно происходит несмотря на другие меры предосторожности.

  1. Поместите QFS камеру на платформе роторной качалке в вытяжной шкаф и вращаются на 125 оборотов в минуту в течение 120 мин. В течение этого времени температура блока следует постепенно увеличивать до примерно -80 ° С. Агитация обеспечивает смешивания компонентов для лучшего FS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размещение шейкере в вытяжной шкаф и положением капота двери дыма должна быть такой же на протяжении всей процедуры QFS и на каждые QFS работают для обеспечения последовательного потепление образцов.
  2. Снимите сухой лед из камеры и продолжить встряхивания в течение еще одного часа.
    Примечание: температура должна возрасти до примерно -15 ° С до -20 ° С.
  3. Удалить образцы и датчик температуры от QFS камеры и разместить нашейкере при комнатной температуре в течение еще 10-15 мин, пока они не достигнут комнатной температуры. Остановка записи температуры.
  4. В FS, выключите аппарат HPF.
    1. Закройте кран резервуара с жидким азотом в то время как машина ФВЧ заполняется азотом.
    2. Нажмите кнопку «Азот».
    3. Подождите, пока красные "поршень вниз" легких гаснет.
    4. Нажмите "ON / OFF" кнопку.
    5. Нажмите кнопку "SYSTEM высохнуть".
    6. Прекратил подачу сжатого воздуха к машине.
    7. После как минимум 12 часов (для обеспечения сушки любой влажности), выключить машину, повернув главный выключатель с "1" на "0".

6 Сообщение FS Обработка

  1. Осторожно снимите FS СМИ с пластиковыми пипетками передачи и место в соответствующий контейнер для токсичных отходов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: OsO 4 и уранилацетатом опасные химические веществаи должны быть обработаны в вытяжной шкаф, а носить соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), включая закрытые носком обуви, халате и перчатках.
  2. Wash образцы четыре раза 100% ацетона. Соберите первые два моет и поместите в токсического контейнер для отходов.
  3. Использование тонких щипцов, удалить образцы ткани из держателей. Держите образцы мокрый ацетоном, как это делается, и работать очень осторожно, чтобы не ломать образцы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это не является необычным, и это на самом деле может быть полезно иметь дрожжи пасты отпасть от образцов в этой точке. Дрожжи пасты обычно очень темно-коричневый, а ткань листа все еще зеленым.
  4. Сбор образцов в криопробирки содержащих ацетон. Продолжайте пробоподготовки (инфильтрации и вложения) для ТЭМ в соответствии с обычными протоколами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Результаты, представленные ниже, были получены с использованием Вольвенд Compact 02 для ФВЧ (Рисунок 1A). Одно из главных преимуществ этого инструмента является простота использования образцов носителей и их носителей. При использовании других инструментов, McDonald рекомендует два пользователя должны осуществлять подготовку образцов и ФВЧ, один приготовления образцов, а другой делает замораживание и трансфер в FS криопробирки 9. Тем не менее, Вольвенд образца носители и держатель достаточно ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Успех протокола, представленного здесь в большой степени зависит от пользователя. Во-первых, расширенный подготовка требуется для того, чтобы все необходимые материалы легко доступны и в достаточном количестве, чтобы завершить весь HPF-QFS пробег. Во-вторых, пользователь должен работать быстро, переход от стадии-к-шагом в эффективной манере, что сводит к минимуму обращение с пробами, таким образом минимизируя изменения в нативном состоянии ткани. После того, как образцы замораживаются и, прежде чем они обезвожены крайне...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Доброта и щедрость доктора Кента Макдональд из Калифорнийского университета в Беркли, получают высокую оценку. Мы благодарим анонимного рецензента за очень полезные советы. Лаборатория Burch-Смит поддерживается стартовые средства из Университета Теннесси.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Wohlwend HPF Compact 02 Морозильная машина высокого давленияTechnotrade International, IncHPF02Со встроенным осциллографом для отображения кривых замерзания и давления; Для отображения требуется ПК (не входит в комплект); параметров замораживания
Держатель для носителей алюминия DN 3 x 0,5 ммTechnotrade International, Inc290
Держатели образцов, P=1 000, DN 3 x 0,5 алюминия, тип ATechnotrade International, Inc241-200
Держатели образцов, P=1 000, DN 3 x 0,5 алюминия, тип BTechnotrade International, Inc242-200
Storage Dewar 20,5 л, MVE Millennium 2000 XC20Таблица
Пекарские дрожжиЧем старше, тем лучше, чтобы избежать чрезмерного газообразования (CO2)
Зубочистки
Регистратор данных термопары EL-USB-TCOMEGA Engineering Inc.OM-EL-USB-TC Запасной аккумулятор приобретается отдельно
Температурный зондЭлектронная микроскопия Sciences34505
Нагревательный блок 12/13 мм
Вращающийся шейкерFisher Scientific11-402-10
Листовой пробивщик - Harris Uni-core 2.00Ted-Pella Inc.15076
Розовый стоматологический воскЭлектронная микроскопияНауки 72660
Криогенные флаконы 2 млЭлектронная микроскопия Науки61802-02
Метанол
Фен
Сухой лед
Жидкий азот
Ацетон
ЩипцыНесколько пар

Ссылки

  1. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and cell biology. 130, 877-889 (2008).
  2. Studer, D., Hennecke, H., Muller, M. High-pressure freezing of soybean nodules leads to an improved preservation of ultrastructure. Planta. 188, 155-163 (1992).
  3. Bowers, B. aM. M. Ch 2. Artifacts in Biological Electron Microscopy. Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. 2, Plenum Press. 13-42 (1988).
  4. Mollenhauer, H. H. Ch 3. Artifacts in Biological Electron Microscopy. Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. , Plenum Press. 43-64 (1988).
  5. Kiss, J. Z., Giddings, T. H., Staehelin, L. A., Sack, F. D. Comparison of the ultrastructure of conventionally fixed and high pressure frozen/freeze substituted root tips of Nicotiana and Arabidopsis. Protoplasma. 157, 64-74 (1990).
  6. Moor, H. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. Steinbrecht, R. A., Zierold, K. , Springer Verlag. 175-191 (1987).
  7. Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods in cell biology. 88, 151-164 (2008).
  8. Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure freezing for the preservation of biological structure theory and practice. Journal of electron microscopy. 13, 165-174 (1989).
  9. McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods in molecular biology. 117, 77-97 (1999).
  10. Hippe-Sanwald, S. Impact of freeze substitution on biological electron microscopy. Microscopy research and technique. 24, 400-422 (1993).
  11. Kiss, J. Z., McDonald, K. Electron microscopy immunocytochemistry following cryofixation and freeze substitution. Methods in cell biology. 37, 311-341 (1993).
  12. Segui-Simarro, J. M., Austin 2nd, J. R., White, E. A., Staehelin, L. A. Electron tomographic analysis of somatic cell plate formation in meristematic cells of Arabidopsis preserved by high-pressure freezing. The Plant cell. 16, 836-856 (2004).
  13. Kobayashi, K., Otegui, M. S., Krishnakumar, S., Mindrinos, M., Zambryski, P. INCREASED SIZE EXCLUSION LIMIT encodes a putative DEVH box RNA helicase involved in plasmodesmata function during Arabidopsis embryogenesis. The Plant cell. 19, 1885-1897 (2007).
  14. Austin, J. R., 2nd,, Staehelin, L. A. Three-dimensional architecture of grana and stroma thylakoids of higher plants as determined by electron tomography. Plant physiology. 155, 1601-1611 (2011).
  15. McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of microscopy. 243, 227-233 (2011).
  16. Taiz, L. The Plant Vacuole. The Journal of experimental biology. , 172-1113 (1992).
  17. Wilson, S. M., Bacic, A. Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes. Nature protocols. 7, 1716-1727 (2012).
  18. Ding, B., Turgeon, R., Parthasarathy, M. V. Substructure of freeze-substituted plasmodesmata. Protoplasma. 169, 28-41 (1992).
  19. McDonald, K. L. Rapid Embedding Methods into Epoxy and LR White Resins for Morphological and Immunological Analysis of Cryofixed Biological Specimens. Microscopy and microanalysis. 20, 152-163 (2014).
  20. McDonald, K. L., Auer, M. High-pressure freezing, cellular tomography, and structural cell biology. BioTechniques. 41, 137, 139-141 (2006).
  21. Spiegelhalter, C., et al. From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy. PloS one. 5, e9014 (2010).
  22. McDonald, K. L. A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues. Journal of microscopy. 235, 273-281 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Подготовка растительных тканейкриопротекторная дрожжевая пастаработа с жидким азотомфиксация тетраоксидом осмияпротокол замораживающего замещенияподготовка носителя образцавизуализация образцов ПЭМ
Тандем Замораживание высокого давления и резких похолоданий Замена тканей растений для просвечивающей электронной микроскопии
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.