Тандем Замораживание высокого давления и резких похолоданий Замена тканей растений для просвечивающей электронной микроскопии

Наше знание ультраструктуры клеток поступает в основном из электронной микроскопии, которые могут решить детали в диапазоне от нескольких нанометров ^1. Несмотря на то, настолько мощным, в резолюции ТЭМ не считается удобной, как подготовка образца требуется много времени и трудоемкие протоколы, и требует определенного опыта от врача. Традиционный фиксация образцов объединил использование альдегидов и осмия перед дальнейшей обработки, которая включает обезвоживание, вложение в смоле, а затем секционирования производить ультратонкие срезы, которые затем окрашивали тяжелых металлов. Тем не менее, известно, что химической фиксации может производить артефакты в том числе агрегации белка и липидов потери ^1, и изменения в мембранах, что, в конечном счете влияют несколько клеточных компартментах ^2. Эти артефакты в основном связано с медленной скоростью фиксации и дегидратации при комнатной температуре ^{3, 4, 5.}

6, 7. ФВЧ уменьшается Температура образца для жидкого азота, под очень высоким давлением (210 МПа или 2100 бар) в миллисекундах. Если все сделано правильно ФВЧ предотвращает образование крупных кристаллов льда, которые могут вызвать серьезные повреждения ультраструктуры клеток. ФВЧ может быть использован для фиксации образцов толщиной 100-200 мкм при типичных концентраций растворенных веществ в биологических ^7. Существуют многочисленные отзывы на физике и принципы, лежащие в основе ФВЧ, например, ^{1, 7, 8.}

После HPF, образцы инкубируют при низкой температуре (-78,5 ° С до -90 &# 176; C) в присутствии жидких органических растворителей, содержащих химических фиксаторов как осмия, как правило, в течение нескольких дней. При такой низкой температуре, вода в образце заменяется на органическом растворителе, обычно ацетон или ^{метанол, 1 9.} Таким образом, этот процесс называется замена замораживания (FS). Затем образец постепенно нагревают, и в течение этого времени является фиксированной, как правило, с осмия и уранил-ацетатом ^9. Сшивание при низких температурах обладает тем преимуществом, фиксации молекулы, которые иммобилизованных ^1. FS, следовательно, производит образцы высшего качества по сравнению с теми, фиксированный с помощью обычной химической фиксации при комнатной температуре, в частности, это приводит к улучшенным сохранением ультраструктуры, лучшей сохранности антигенности и уменьшить потерю несвязанных клеточных компонентов ^{10, 11.}

Большинство FS осуществляется в течение длительных периодов времени, как правило, до нескольких дней. Это особенно Truе для растений образцов ^{12, 13, 14.} Недавнее протокол, разработанный Макдональд и Уэбб значительно сокращает время для FS от нескольких дней до нескольких часов ^15. В их быстрого замещения замораживания (QFS) процедуры, FS осуществляется в течение 3 часов, в то время как в супер быстрых FS образцы (SQFS) обрабатываются в течение 90 минут. Качество образцов, полученных с помощью этих методов можно сравнить с теми, которые давала традиционных протоколов FS. Мы приняли протокол QFS для глубокой переработки растительных образцов после ФВЧ. Это оказалось сэкономить не только время, но и деньги, как QFS и SQFS использовать здравый лабораторного оборудования вместо дорогостоящих коммерчески доступных машин ФС.

Растительные ткани, часто очень сложной, чтобы подготовиться к ТЭМ. В среднем, растительные клетки крупнее, чем либо бактериальных или животных клеток. Наличие гидрофобного восковой кутикулы, толстые клеточные стенки, крупных емкостей, заполненных водой вакуолей, содержащих органические кислоты, гидролазы и фенольного Compounds, что может занимать до 90% от общего объема клеточной ^16, и присутствие газированных пространств строго уменьшается теплопроводность системы ^17. Кроме того, в случае растений, толщина образца почти всегда превышает 20 мкм, предел для использования химической фиксации. В этих толщин, низкой теплопроводности воды предотвращает замораживание со скоростью больше, чем -10000 ° C / сек в центре образца. Этот показатель необходим, чтобы избежать повреждения гексагональную образование льда (ледяные кристаллы с более низкой плотностью и больше, чем от 10 до 15 нм) ^8. Вместе, эти нынешние вызовы как надлежащего замораживания образца и последующих FS. Тем не менее, cryofixation является лучшим методом для фиксации образцы растений. Вот это протокол для ФВЧ-QFS образцов ткани растений представлена. Она сосредоточена на модель вида Arabidopsis THALIANA, но также используется с Nicotiana benthamiana. Типичные результаты показывают, что HPF-QFS производит саmples сопоставимого качества традиционных HPF-FS в долю времени. При правильном корректировок, этот протокол также может быть использована для других относительно толстых биологических образцах.

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура QFS требует крайней осторожности и осторожности со стороны пользователя, и мы выделить эти меры предосторожности здесь как предупреждения и примечания, где это возможно.

1.Preparation для ФВЧ Run

1. Перед началом подготовки образцов, включите морозильник высокого давления в соответствии с инструкциями изготовителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ФВЧ единица, используемая в данном протоколе является Вольвенд Компактный 02 единица (1А), и это занимает примерно 12:59-и с половиной часов процедуры запуска до ФВЧ работает может начаться.
   1. Включение Вольвенд Компактный 02 высокого давления Freezer.
      1. Включите инструмент, поворачивая главный выключатель от "0" до "1".
      2. Выпуск сжатого воздуха к машине.
      3. Выпуск жидкого азота к машине.
      4. Нажмите кнопку "SYSTEM высохнуть".
      5. Через 30 мин, нажмите "SysteM высыхают "кнопку еще раз.
      6. Нажмите кнопку "ON / OFF" для переключения на инструмент.
      7. Нажмите кнопку «Азот».
      8. Дайте машине остыть в течение 20 минут, даже если «DRIVE IN" кнопки уже загорелись.
      9. «DRIVE IN» включается подсветка кнопки.
      10. Нажмите "Drive In" кнопку.
      11. Нажмите кнопку "AUTO".
      12. В "Система готова" подсветка кнопки.
      13. Поместите зонд температуры и давления в барокамере и зафиксируйте его с пальца.
      14. Нажмите кнопку "JET AUTO". Эта операция проверяет, что повышение давления и понижение температуры являются по желанию; существенно пробный запуск. Резкие перепады температуры и резких скачков давления, как ожидается (Рисунок 1В).
      15. Провести еще два циклы JET.

2 Подготовка к Receiviнг Замороженные образцы

1. Заполните изолированную коробку с криопробирку держатели с жидким азотом (см Техника безопасности), так что держатели полностью покрыты (Рисунок 1C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование СИЗ включая cryogloves и очки при работе с жидким азотом.
2. Поместите необходимое количество флаконов, содержащих среду FS в держатели алюминиевой трубы в жидком азоте (Рисунок 1C). С помощью этого протокола до четырех дисков каждый из которых содержит один образец может быть помещен в одном криопробирку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Флаконы должны быть маркированы с острым инструментом, как алмазным писца и очень мягким карандашом.
   1. Для фиксатора во QFS использовать 1% ОСО ₄ и 0,1% уранилацетатом в ацетоне ^9. Готовят раствор в большом объеме, обойтись аликвоты 1,5 мл в криопробирки и магазина, замороженных в жидком азоте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте Предупреждения по технике безопасности для работы ОСО ₄ и уранилацетатом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: OsO ₄ ПРИМЕЧАНИЕ: криопробирки, используемые для хранения образцов для QFS, должны иметь твердое уплотнительное кольцо, чтобы убедиться, что трубы остаются запечатанными во QFS чтобы избежать утечки OsO _4.
3. Подготовка дрожжевой пасты путем смешивания пекарских дрожжей с примерно равным объемом 10% метанола с помощью зубочистки или другим подобным инструментом, пока паста не станет однородной. Дрожжи паста действует как внеклеточный криопротекторов и используется, чтобы заполнить пространство вокруг образца в носителе образца. Количество пасты зависит от количества образцов; для 10 образцов или меньше пасты (1 мл) могут быть смешаны в микроцентрифужных трубки.

3 высокого давления Замораживание образцов

1. Удалить лист (или другой ткани) интерес со стороны завода и аккуратно поместить его на листке Дентал воск или другой режущей поверхности. С помощью штампа в 2,0 мм или желаемого размера, чтобы вырезать образец из листа. Ручка пробу осторожно с парой щипцов и работать как можно быстрее.
2. Работая под микроскопом рассекает положите лист диска в 0,2 мм стороне Тип образец носителя и полностью покрывать в дрожжевой пастой. Убедитесь, что диск полностью заполнен и паста на одном уровне с краем держателя путем сглаживания пасты с тонкой кистью (Рисунок 2).
3. Вставьте носитель в держатель образца. Обложка образца с Тип B образца носителя, плоской поверхности вниз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держатель образца должна быть сухой и при комнатной температуре.
4. Возьмите образец в держатель образца, вставить ее в машину и инициировать замерзания цикл, нажав на кнопку "JET AUTO", который должен завершить в секунду или две.
5. Работа как можно быстрее, снимите держатель из машины и поместить кончик проведения SAMPле в жидкий азот в изолированный ящик на верхней части машины ФВЧ. Погрузить кончики двух пар щипцов в жидком азоте, чтобы охладить их.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После замораживания, носители должны быть обработаны только с жидкими щипцов азота охлаждением. Теплые (комнатная температура) щипцы часто являются причиной отказа в cryotechniques.
6. Откройте криопробирку содержащий СМИ FS, и поместите крышку на стороне коробки. С помощью пары жидких щипцов азота охлаждением, аккуратно извлеките диск из держателя образцов, гарантируя, что диск всегда находится в жидком азоте или парах. Работа в парах жидкого азота, удерживайте FS трубку с одним предварительно охлаждается пинцетом и использовать другой поместить держатель в FS флаконе. Винтовые крышки ФР флакон обратно. У не зажаты жидкого азота в ампуле.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При передаче образцов для криопробирки для QFS, обеспечению того, чтобы жидкий азот не попавшие в флаконах. Жидкий азот расширяется 700 раз во время потепления и любой Trappeг жидкого азота может привести к взрыву в течение этого времени.
7. Повторите шаги 3,1 до 3,7, пока все нужные Образцы замораживают. Несколько дисков листьев, содержащие один и тот же тип образца могут быть размещены в том же самом флаконе. Следует отметить, что держатель образца должен быть высушен и доводили до комнатной температуры замерзания между запусками. Чтобы сделать это быстро, нагреть его с феном, и контролировать его температуру на ощупь.

4 Подготовка к Замена замораживания

1. Полностью погрузите Блок отопителя алюминия в жидком азоте в течение 10 мин или до пузырькового кипение не прекратится. В то время как это происходит, разместить слой сухого льда (1-2 см) в нижней части контейнера, используемого в качестве камеры FS (рисунок 3). Пенополистирола контейнер или ведро льда может быть использован для FS, вместе с измельченной сухой лед или гранул.
2. Быстро вставить криопробирки содержащие образцы вместе с датчиком температуры в средних рядах блока нагревателя. Убедитесь, что крышки наФлаконы плотно привинчена так что FS СМИ не просачивается во FS. Начните запись температуры.
   1. Сделать датчик температуры, поместив термопары через верхнюю часть криопробирку таким образом, что она достигает дна трубки. Закрыть крышку трубки смолой так, чтобы жидкость не просачивается. Заполните трубку с 1,5 мл ацетона в начале каждого QFS перспективе.
3. Использование изолированных cryogloves или большие щипцы, выльет жидкого азота от блока нагревателя. Будьте осторожны, не вылейте криопробирки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование СИЗ включая cryogloves и очки при работе с жидким азотом.
4. Поместите блок, содержащий флаконов на слой сухого льда в QFS камеры. Убедитесь, что блок размещен так, что трубы лежат горизонтально, а с небольшим наклона вверх. Там не должно быть никакой утечки, если используются правильные криопробирки.
5. Упакуйте QFS камеру с сухим льдом, так что FS трубки покрыты, хотя это не является необходимым дляпокрыть верхнюю часть блока. Поместите крышку на камере.

5 Быстрый FS

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните QFS работать в вытяжном шкафу в том случае, если любая утечка OsO ₄ непреднамеренно происходит несмотря на другие меры предосторожности.

1. Поместите QFS камеру на платформе роторной качалке в вытяжной шкаф и вращаются на 125 оборотов в минуту в течение 120 мин. В течение этого времени температура блока следует постепенно увеличивать до примерно -80 ° С. Агитация обеспечивает смешивания компонентов для лучшего FS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Размещение шейкере в вытяжной шкаф и положением капота двери дыма должна быть такой же на протяжении всей процедуры QFS и на каждые QFS работают для обеспечения последовательного потепление образцов.
2. Снимите сухой лед из камеры и продолжить встряхивания в течение еще одного часа.
   Примечание: температура должна возрасти до примерно -15 ° С до -20 ° С.
3. Удалить образцы и датчик температуры от QFS камеры и разместить нашейкере при комнатной температуре в течение еще 10-15 мин, пока они не достигнут комнатной температуры. Остановка записи температуры.
4. В FS, выключите аппарат HPF.
   1. Закройте кран резервуара с жидким азотом в то время как машина ФВЧ заполняется азотом.
   2. Нажмите кнопку «Азот».
   3. Подождите, пока красные "поршень вниз" легких гаснет.
   4. Нажмите "ON / OFF" кнопку.
   5. Нажмите кнопку "SYSTEM высохнуть".
   6. Прекратил подачу сжатого воздуха к машине.
   7. После как минимум 12 часов (для обеспечения сушки любой влажности), выключить машину, повернув главный выключатель с "1" на "0".

6 Сообщение FS Обработка

1. Осторожно снимите FS СМИ с пластиковыми пипетками передачи и место в соответствующий контейнер для токсичных отходов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: OsO ₄ и уранилацетатом опасные химические веществаи должны быть обработаны в вытяжной шкаф, а носить соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), включая закрытые носком обуви, халате и перчатках.
2. Wash образцы четыре раза 100% ацетона. Соберите первые два моет и поместите в токсического контейнер для отходов.
3. Использование тонких щипцов, удалить образцы ткани из держателей. Держите образцы мокрый ацетоном, как это делается, и работать очень осторожно, чтобы не ломать образцы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это не является необычным, и это на самом деле может быть полезно иметь дрожжи пасты отпасть от образцов в этой точке. Дрожжи пасты обычно очень темно-коричневый, а ткань листа все еще зеленым.
4. Сбор образцов в криопробирки содержащих ацетон. Продолжайте пробоподготовки (инфильтрации и вложения) для ТЭМ в соответствии с обычными протоколами.

Результаты, представленные ниже, были получены с использованием Вольвенд Compact 02 для ФВЧ (Рисунок 1A). Одно из главных преимуществ этого инструмента является простота использования образцов носителей и их носителей. При использовании других инструментов, McDonald рекомендует два пользователя должны осуществлять подготовку образцов и ФВЧ, один приготовления образцов, а другой делает замораживание и трансфер в FS криопробирки 9. Тем не менее, Вольвенд образца носители и держатель достаточно легко для одного пользователя манипулировать независимо (рисунок 2А, B, E, F и G). Следует отметить, однако, что следует выполнить несколько пробных попыток, чтобы ознакомиться с инструментом ФВЧ перед работой с ценными образцами. Опытный пользователь должен быть в состоянии исправить несколько (10 или более) образцов в час. Тем не менее, принципы, представленные в данном протоколе могут быть использованы с любым из коммерчески доступных машин HPF.

Возможно,наиболее важной частью процедуры HPF-QFS является подготовка проб для загрузки в образце носителя (Рисунок 2C). Хотя это не может быть интуитивно, это шаг в протокол, по которому исследователь имеет максимальный контроль. ФВЧ машина надежная, и при правильном использовании и обслуживании должны производить ожидаемые изменения в давлении и температуре с небольшим изменением между образцами. Если образец плохо обработаны в процессе приготовления, то никакой другой шаг не будет выкупать ущерб так причинил. Растительные ткани довольно легко манипулировать во время этой стадии процесса, поскольку они не культивируют в среде и их клетки стены дают клеткам хорошую прочность. Тем не менее важно, что образцы обрабатываются быстро, чтобы избежать ультраструктурным изменения в результате удаления из исходного растения и ограничить стресс и ранив ответов. Самый маленький образец носитель, который может вместить образец должен использоваться для обеспечения эффективного и последовательного ФВЧ (рисЮр 2C). Наконец, перевозчик образец должен быть заполнен, но не переполнены (рисунок 2D). Заполненный образец носитель легко вставляется в машину ФВЧ для замораживания (Рисунок 2 H и I).

Первые шаги в протоколе QFS может быть сложным для новичка, поэтому рекомендуется, что два человека должны работать вместе, пока пользователи не знакомы с процедурой (3А-E). Следует проявлять осторожность при всех случаях при обращении с жидким азотом и фиксаторы тетроксид осмия и уранилацетатом. Типичная кривая изменения температуры во время QFS показан на рисунке 2J. Температурные быстро возрастает от -196 ° C, температуре жидкого азота, до примерно -80 ° С. Это при температуре около -78 ° С до -90 ° С, что замораживание замена как полагают, происходит 9. Один сложным шагом в протоколе QFS является удаление сухого льда через 2 часа FS. Вэтот шаг, неправильного обращения образцов может произвести всплеск температурах. Для этого блока нагревателя должны быть быстро поднимается из QFS камеры с помощью cryoglove и сухой лед быстро выливали в средней емкости.

ФВЧ была использована для исправления различных тканях растений Nicotiana benthamiana в том числе листьев Arabidopsis и листьев и эмбрионов. Это является сложной задачей, чтобы исправить образцы из зрелых листьев, благодаря большим центральной вакуоли большинства клеток. Младшие листья содержат меньшие вакуоли но трихомы обычно довольно плотно упакованы. Наличие трихомами может затруднить для упаковки образцов с дрожжевой пастой, но необходимо позаботиться, чтобы убедиться, что это правильно сделать, чтобы свести к минимуму количество воздуха, захваченного между поверхностью листа и пасты. Захваченный воздух будет препятствовать передачи тепла во время HPF и снизить качество фиксации. Это верно для любого образца.

После HPF и QFS образцы могут быть получены для VIЮинг под ТЕА путем пропитки и встраивания смолой. Тонкие секции 65-100 нм, то может быть получено путем секционирования. Типичные результаты приведены на рисунке 4. Показанные изображения все из образцов Arabidopsis листьев. Плазменные мембраны обычно гладкие и прижимается к клеточной стенке, признак хорошей фиксации (Рисунок 4A, С и Е). Другие органеллы в том числе хлоропласты (фиг.4А, D, F и Н) и тилакоидами (фиг.4В), митохондрий (Рисунок 4D и F), Гольджи (Рисунок 4 г), микротрубочки (Рисунок 4E) и рибосом (особенно фиг.4С) также отчетливо видны и большая центральные вакуоли остаются нетронутыми (4А). Неправильное обращение во результатов HPF-QFS в артефактов в том числе кристаллов льда-индуцированного повреждения (Рисунок 4D) и плазмолиза (Рисунок 4H). Ведущий осадок также может образовывать во окрашивания разделес (Рисунок 4F).

Рисунок 1: Вольвенд Компактный 02 высокого давления Морозильная камера () Вольвенд Компактный 02 HPF машина используется для cryofixation с прилагаемым компьютерного терминала.. Образцы вставляют в передней части машины (малого круга) для замораживания. Температурная кривая может генерироваться на экране компьютера для каждого запуска, по желанию пользователя. (B) Типичный температурную кривую давления для ФВЧ перспективе. Желтые и фиолетовые линии представляют температуру и давление, соответственно. Обратите внимание на крутые склоны обеих кривых. Высокое давление поддерживают в течение примерно 400 мс. Каждый интервал на оси абсцисс представляет 50 мс. Данные были собраны с EasyScopeII для программного обеспечения DSIM12. (C) изоляцией окно и крышка используется для хранения OF замороженные образцы сразу после замораживания можно удобно разместить на верхнем машине ФВЧ. Он заполнен жидким азотом. Круглые алюминиевые контейнеры держать криопробирки.

Рисунок 2: Подготовка образец ткани для ФВЧ. (A) Держатель образца для Compact 02 ФВЧ машины в его закрытом положении. (B) Держатель образца открыт. (C) лист образец в 0,2 мм лунку Тип образец носителя. Другая сторона этого носителя глубоко 0,1 мм. (D) Образец лист покрыт дрожжей пасты. Следует отметить, что носителем является полным, но не переполнены. (Е)-носитель образца в держателе образца. (F) Образец покрыта с носителем типа B. Этот носитель имеет одну плоскую поверхность и с другой стороны скважины, котораяглубоко 0,3 мм. Здесь плоская поверхность используется для сэндвич образец. (G), Держатель образца закрыта и готов к установке в машину HPF. (Н) отверстия на передней панели прибора HPF, в котором держатель образца будет вставлен для замораживания . (I), температура и давление зонда / держатель вставлен в машину HPF. (J) Типичная кривая температуры в течение QFS перспективе (данные, собранные с помощью программного обеспечения EASYLOG). Температура была записана в секунду. Всплеск в начале пробега обусловлено электроника зонда используется и не отражает реальную измерение температуры.

Рисунок 3:. Оборудование, используемое в QFS QFS можно проводить в любом изолированном контейнере, такие как коробка из пенопласта или ведерке со льдом (A) <./ Сильный> слой сухого льда 1-2 см в глубину охватывает нижнюю часть QFS камеры, здесь пенополистирол коробки. (B) нагреватель блок с 13 мм отверстия используется для образцов дома во QFS. Датчик температуры с цифровой регистратор данных находится в нагревательном блоке. (С) После охлаждения блока нагревателя в жидком азоте образцы помещают в блоке, жидкий азот выливали, а весь узел помещают в камеру QFS . с сухим льдом (D) QFS камера заполнена сухим льдом так, чтобы образцы покрытого; нет Недостатком охватывает весь нагревательного блока с сухим льдом. (Е) Коробка покрыта, а затем перемещается на ротационном шейкере в вытяжном шкафу, где образцы перемешиваемой в течение всей процедуры QFS.

Рисунок4:.. Arabidopsis листья подготовлен ФВЧ-QFS результаты, полученные для образцов, полученных ФВЧ-QFS и отображенных с помощью ПЭМ на Zeiss Libra 200 HT FE MC (A) средний высокий увеличения изображения, показывая хлоропласты (CH) с клеточными стенками и цитоплазма соседних клеток. В вакуоли (V) содержит электронно-плотного материала. Шкала бар = 0,5 мкм. (В) с большим увеличением изображение хлоропласта. Шкала бар = 100 нм. (C) высокого увеличенное изображение клеточной стенки между соседними клетками. Разветвленной plasmodesma видна (стрелка). Обратите внимание на гладкую мембрану плазмы прижатым к клеточной стенке в вакуоли. Цитоплазма плотно упакованы с рибосом. V является вакуоль. Тонопласт является гладкой и непрерывной. Шкала бар = 200 нм. (D) малом увеличении изображение, показывающее области хорошей фиксации в хлоропластов (CH) возле регионах повреждения льдом (звездочка). Шкала бар = 0,5 мкм. (Е) Высокий коэффициент увеличения клетки вальл и микротрубочки. Шкала бар = 100 нм. (F) Изображение показывает хорошую сохранность хлоропластов (CH) и митохондрий (М). Большой черный осадок от окрашивания срезов цитратом свинца. Шкала бар = 1 мкм. (G) Высокое увеличение вид Гольджи (GA). Шкала бар = 200 нм. (H) Плохо сохраняется образец, показывающий отсутствие деталей в хлоропласты и плазмолиза (черная стрелка). Шкала бар = 1 мкм.

Авторам нечего раскрывать.