Теломераза экспрессируется в неонатальном мозге, а также в отдельных областях мозга взрослого человека. Мы представляем нетоксичный, экономящий время TRAP-анализ для анализа активности теломеразы в различных областях мозга мыши и обнаружения различий в активности теломеразы между мозгом самцов и самок мыши.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Активности теломеразы в различных регионах мозга мыши: нерадиоактивный теломеразы повторить Amplification протокол (TRAP) Анализ
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Теломераза, рибонуклеопротеиновый, отвечает за поддержание длину теломер и, следовательно, содействие геномной целостности, пролиферацию, и продолжительность жизни. Кроме того, теломераза защищает митохондрии от окислительного стресса и придает устойчивость к апоптозу, предлагая свое возможное значение для выживания не-митотических, высокоактивные клетки, такие как нейроны. Мы ранее продемонстрировали способность новых теломеразы активаторов для увеличения активности теломеразы и выражение в различных регионах мозга мыши и защищать моторных нейронов клетки от окислительного стресса. Эти результаты укрепляют мнение, что теломераза участвует в защите нейронов от различных повреждений. Чтобы подчеркнуть роль теломеразы в мозге, мы здесь сравнивать активность теломеразы в мужской и женский мозг мыши и ее зависимость от возраста. TRAP анализа является стандартным методом для обнаружения активности теломеразы в различных тканях или клеточных линий. Здесь мы показываем, анализа парамSIS теломеразной активности в трех областях головного мозга мыши путем неденатурирующих экстрагирования белка с использованием буфера для лизиса CHAPS затем модификации стандартного TRAP анализа.
В этом 2-ступенчатой анализа, эндогенный теломеразы удлиняет конкретный теломеразы субстрат (TS праймера) добавив TTAGGG 6 повторов, BP (теломеразы реакцию). Реакционные теломераза продукты усиливаются с помощью ПЦР-реакции, создающей ДНК лестнице 6 шагом ВР. Анализ ДНК маркера производится с помощью электрофореза в агарозном геле 4,5% высокого разрешения с последующим окрашиванием красителем высокочувствительного нуклеиновой кислоты.
По сравнению с традиционным TRAP анализа, которые используют 32 P с надписью радиоактивных дЦТФ для выявления ДНК и электрофореза в полиакриламидном геле для решения лестницу ДНК, этот протокол предлагает нетоксичный экономия времени TRAP анализа для оценки активности теломеразы в мозге мыши, демонстрируя способность к выявления различий в telomerasэ деятельность в различных женского и мужского области мозга мыши.
Введение
Теломеразы является рибонуклеопротеин состоит из теломеразной обратной транскриптазы (TERT), каталитической субъединицы теломеразы, и компонент РНК (TERC). Каноническая роль теломеразы является сохранение надлежащего длину теломер, добавив повторяющиеся последовательности (TTAGGG) к теломерными концов, поэтому содействие геномной целостности и пролиферацию клеток 1. Дополнительные роли были отнесены к трет в клетках, то есть придает устойчивость к апоптозу, вызванному различными повреждающего агента 2, защищает человека мезенхимальные стволовые клетки от окислительного стресса 3, и играет роль про-выживания в полностью дифференцированных нейронов своей причастностью к TIA1 положительный РНК гранулы 4.
TERT выражается и активны в основном в соматических деления клеток и в большинстве видов рака, в то время как уровни экспрессии фермента и активность жестко регулируется в не-деления клеток 5,6. Исследования показали, что в рОден мозга, активность теломеразы более не обнаруживается день после рождения 10, в то время как ТРЕТ мРНК поддерживается на более низких уровнях и во взрослом возрасте 7. Другие исследования показали, активность теломеразы в рамках суб-желудочковой зоны взрослого, обонятельной луковице, гиппокампе, и во взрослом мозжечке и коре 8. Мы недавно показали, что новые соединения, которые повышают экспрессию теломеразы и активность в мозге и спинном мозге, оказываемое нейропротекторное действие в N-метил-D-аспартат (NMDA) - вводили мышам, задержка развития и прогрессирования о боковой амиотрофический склероз болезни в СОД1 трансгенных мышей и повышает выживаемость моторных нейронов в спинном мозге этих мышей 9. Чтобы полностью понять роль про-выживания теломеразы в нейронах и в мозге, важно разработать простой и относительно чувствительной быстрый тест для обнаружения активности теломеразы в различных областях головного мозга.
Теломерный гПротокол EPEAT амплификации (TRAP) представляет собой хорошо известный чувствительным анализом сочетания канонический активность теломеразы и полимеразной цепной реакции (ПЦР). В этом анализе, теломераза добавляет TTAGGG повторяет в теломеразы подложки (TS грунтовку) олигонуклеотида, а затем с помощью ПЦР-амплификации, который генерирует 6 пар оснований (АД) ДНК лестнице, используя TS обратного праймера -. ACX 32 P помечены дЦТФ, используются для обнаружения низкое количество продуктов ПЦР. Лестница ДНК решается секвенирование полиакриламидном геле (ПААГ). И интенсивность полос ДНК и длина лестницы ДНК отражают количество активных молекул фермента и их процессивности соответственно 10.
Этот традиционный анализ имеет некоторые серьезные трудности: опасность воздействия на радиоактивных веществ, больших и твердых обрабатывать секвенирования страницы и время потребление работающем гель и пленки воздействия радиоактивного продукта (в течение ночи в обоих случаях).
Этот протокол предлагает улучшенный нерадиоактивный агарозном мини-гель анализа, основанный. ДНК 6 б.п. лестница будет решена с помощью 4,5% с высоким разрешением агарозном геле и обнаружение достигается с помощью высокочувствительного пятно нуклеиновой кислоты. Сочетание высокого разрешения с использованием агарозы мини-гель и чувствительный краситель нуклеиновой кислоты предлагает простой в обращении анализа, исключает опасность воздействия радиоактивности и значительно сократить общую продолжительность анализа от 3 дней до нескольких часов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Эксперименты на животных были одобрены этическим комитетом для экспериментов на животных в Университете Бен-Гуриона (IL-39-08-2010).
1 мышь Мозг Белок Добыча
- Подготовьте 3 трубки 15 мл каждая из которых содержит 5 мл раствора и место трубки Рингера на льду.
- Жертвоприношение мыши с помощью Isoflurane анестезии (ВНИМАНИЕ - использовать химическую капот) в течение 10-20 сек с последующим смещением шейных позвонков и немедленного обезглавливания.
- Снимите мозг из черепа и промыть в течение нескольких секунд с раствором ледяным Рингера для предотвращения повреждения мозговой ткани.
- Использование хирургического лезвия, отделить мозжечок (CR) и ствол мозга (BS) от лобной коры. Далее, отделить мозжечок от мозга и сократить лобную долю (FL) от лобной коры; удалить обонятельной луковицы от лобной доли. Поместите регионы 3 мозга в обозначенных 15 мл пробирок.
- Однородный ткани в каждую пробирку. Добавить фрЭШ ледяным Рингера так каждая трубка содержит тот же объем и центрифуги для 7 мин при 800 х г.
- Удалить супернатант и добавить 100 мкл CHAPS буфера для лизиса в каждую пробирку. Все хорошо перемешать, пропусканием раствора несколько раз (~ 10) через 1 мл шприц с 21 G иглы, и инкубировать на льду в течение 30 мин.
- Передача содержимого каждой пробирки на новый микро-центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 30 мин при 13000 х г в. Передача супернатант в новую микро-центрифужную пробирку и определяют концентрацию белка с использованием ранее установленного способа. Хранить белковых экстрактов в виде аликвот по 10 мкл при -80 ° С.
2 TRAP анализа Подготовка инструментов, реакционные растворы и белка разбавления Расчеты
- Подготовьте необходимое количество меченых микро-трубки центрифуги для белковых экстрактов разведения и реакционного буфера теломеразы. Выполните все пипетирование в протоколе с использованием советы фильтра для предотвращения загрязнения.
- Оттепель следующие решения на льду: TRAP реакционной смеси 10x, TS грунтовки, дНТФ UPW и белковых экстрактов (см таблицу материалов для реагенты и реактивы концентраций).
- Развести раствор белкового экстракта до конечной концентрации 1 мкг / мкл с использованием сверхчистой воды (UPW).
3 теломеразы Реакция
- Подготовьте теломеразы реакционной смеси путем добавления в микро-трубки центрифуги: 2 мкл TRAP микс (10x), 1 мкл TS праймера (0,1 мкг), 1 мкл дНТФ (10 мм) и 15 мкл UPW. Для нескольких образцов, умножить вышеупомянутые объемы по количеству образцов, плюс 1.
- Добавить 19 мкл реакционной смеси в каждой реакционной трубе и добавить 1 мкл разбавленного экстракта белка (1 мкг белков) в каждую пробирку для конечного объема 20 мкл.
- Поместите в реакционные трубы 30 ° C предварительно нагретую ванну с водой в течение 45 мин.
4 ПЦР реакции
- Пятнадцать мильн до конца реакции теломеразы, оттепель следующие решения: ACX праймеров, титана Taq буфера, UPW.
- Подготовка ПЦР реакции смесь, добавив следующее в микро-трубки центрифуги: 2,5 мкл Титан Taq буфера (10x), 1 мкл ACX грунтовки (0,1 мкг), 2 мкл UPW (1 мкл, когда IC используется) и 0,5 мкл Титан Taq полимеразы (50x). Для нескольких образцов, умножить вышеупомянутые объемы по количеству образцов плюс 2.
- Добавить 6 мкл ПЦР смешивают в каждую ПЦР-пробирку и добавить весь объем реакции теломеразы (20 мкл) в каждую пробирку для конечного объема 26 мкл.
- Вставьте пробирки для ПЦР к термо циклере ПЦР и выполните следующую программу:
- 90 ° C - 2 мин.
- 94 ° C -. 30 сек *
- 60 ° C -. 30 сек *
- 72 ° C -. 45 сек *
- 72 ° C - 2 мин.
Храните продукты ПЦР при -20 ° C.
* = 34 циклов
5 Агароза Мини-GEл Приготовление, образцы Бег, и гель для окрашивания
- Добавить 25 мл охлажденной буфера электрофореза (КЭ) и мешалку в стакан, который в 2-4 раза объем буферного раствора и медленно посыпать в 1,125 г с высоким разрешением (HR) агарозы порошка в то время как раствор быстро перемешивают . Снимите мешалку, покрыть стакан с пластмассовой оберткой и проколоть в небольшое отверстие для вентиляции. Нагрейте стакан в микроволновой печи на "Low" власти в течение 3 мин, а затем переключиться на "высокий" власть и нагревают раствор в коротких импульсов с осторожностью, чтобы не вызвать разлив. Следует отметить, что, когда пена создается путем нагревания становится крупные пузыри и исчезает через несколько секунд, агарозы готов.
- Литой гель на аппарате с горизонтальной мини-гель, после того, как гель затвердевает при комнатной температуре позволяют гель, чтобы охладить в течение 20 мин при 4 ° С перед использованием.
- Загрузка каждый полосу с 25 мкл образца TRAP (20 мкл ПЦР-продуктов TRAP и 5 мкл 6x гель-загрузочного красителя) и работать на 110 В в течение 3 ч в 4 ° C холодной комнате.
- Подготовка нуклеиновых кислот пятен 3x рабочего раствора путем добавления 15 мкл 10,000x нуклеиновой кислоты, пятно маточного раствора до 50 мл бидистиллированной воды (DDW) с 0,1 М NaCl (0,29 г). Пятно гель в течение 20 мин при осторожном встряхивании.
- Используйте УФ трансиллюминатора с 302 нм длины волны для просмотра полос ДНК TRAP лестницы.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Экстракты белка клетки были получены из лобной доли (Флорида), ствол мозга (BS) и мозжечка (CR), полученный из 3 CD-1 женского и 3 CD-1 мышей-самцов в возрасте от 1 и 3 месяца для изменение TRAP анализа и 3 CD-1 мышей-самцов в возрасте 2 месяцев для радиоактивных TRAP анализа. Активность теломеразы была обнаружена в 1 мкг белков экстракта с помощью модифицированного TRAP анализа и 2 мкг белки извлечь для радиоактивных TRAP анализа. Обнаружение активности теломеразы в результате радиоактивного TRAP анализа и с помощью мо...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Анализ активности теломеразы в мозге мыши через ловушку анализа состоит из 4 основных этапа: 1) белков извлечения из конкретных регионов мозговой ткани 2) ИР удлинение праймера по теломеразы - теломераза реакции 3) усиления реакции теломераза продуктов с помощью ПЦР 4 ) разделение продуктов ПЦР с использованием агарозном геле с высоким разрешением.
Это изменение TRAP анализа рассматриваются две главные трудности, которые поднимаются от традиционного анализа: использование радиоактивных дЦТФ ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа была частично поддержана технологией B.G. Negev и вкладом Линды Пауэрс.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| TRAP Mix (10x) | Изготовлен вручную, смешайте в UPW следующее: 630 мМ KCl, 200 мМ Tris-HCl pH 8,2, 10 мМ ЭДТА, 15 мМ MgCl2, 1 мг/мл BSA, 0,5% TWEEN (приобретено у Sigma). Аликвоты замораживаются при температуре -20°С. | ||
| Раствор | Сделанный вручную, смешайте в DDW: 124 мМ NaCl, 3 мМ KCl, 1,25 мМ2PO4· H2O, 2 мМ MgSO4, 26 мМ NaHCO3, 1,802 г/л D-(+)-глюкозы безводной. | ||
| Изофлуран | Минрад ИНК. | NDC 60307-110-10 | Бережное обращение в химическом колпаке |
| dNTPs (10 мМ) | Sigma | D7295 | |
| TS праймер (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA олигоны упорядочены в формате DRY и UPW добавлены в соответствии с требуемой концентрацией | |
| ACX праймера (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Сигма | ДНК олигоны упорядочены в формате DRY и UPW добавлены в соответствии с требуемым концентрация | |
| Титан Taq Полимераза/Буфер | Clontech | S1792/S1793 | |
| Агароза высокого разрешения | Sigma | A4718 | Любой высококачественный агарозный аппарат высокого разрешения может быть поддающимся |
| воздействию Мини-гель аппарат | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Краситель нуклеиновых кислот (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC праймер (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Сигма | ДНК олигос упорядочены в формате DRY и UPW добавлены в соответствии с требуемой концентрацией | |
| CHAPS лизис буфер | Технология клеточной сигнализации | 9852S | Добавить PMSF (ингибитор протеазы) до конечной концентрации 1 мМ |
| Ультра чистая вода (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 мыши | HARLAN Laboratories INC. |
Ссылки
- Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis. Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).
- Cong, Y., Shay, J. W. Actions of human telomerase beyond telomeres. Cell Res. 18, 725-732 (2008).
- Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. Curr.Mol. Med. 13, 1010-1022 (2013).
- Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B. PloS one. 8, e66602(2013).
- De Jesus, B. B., Blasco, M. A. Potential of telomerase activation in extending health span and logevity. Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).
- Blackburn, E., Collins, K. Telomerase: An RNP enzyme synthesizes DNA. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, 1-9 (2011).
- Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice. J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).
- Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice. Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).
- Eitan, E., et al. Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis. EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP). Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
