Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Использование наложения Пробирной для Качественно Измерьте бактериальной продукции и чувствительность к пневмококковой Бактериоцины

13.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51876

⸱

30 сентября 2014 г.

 , 
1Microbiology and Immunology, University of Michigan, 2Pediatrics and Communicable Diseases, University of Michigan

В этой статье

Краткое содержание

Конкуренция у Streptococcus pneumoniae опосредована бактериоцинами, малыми антимикробными пептидами с ингибирующей активностью по отношению к пневмококку и другим родственным видам. Здесь мы описываем оптимизированный анализ бактериального наложения, который позволяет охарактеризовать активность бактериоцина и ингибирующий спектр, специфичный для бактериоцина иммунитет и обнаружение секретируемых пептидов, чувствительных к кворуму.

Аннотация

Streptococcus pneumoniae колонизирует очень разнообразное полимикробное сообщество носоглотки, где ему приходится конкурировать с резидентными организмами. Мы показали, что антимикробные пептиды (бактериоцины), продуцируемые бактериями, определяют результат этих конкурентных взаимодействий. Все полностью секвенированные пневмококковые штаммы содержат локус bактериоцин-l ike pэптида (blp). Локус blp кодирует ряд разнообразных бактериоцинов и все высококонсервативные компоненты, необходимые для их регуляции, обработки и секреции. Разнообразие бактериоцинов, обнаруженных в области бактериоцинового иммунитета (БИР) локуса, является основным фактором конкуренции пневмококков. Наряду с бактериоцинами в БИР находятся гены иммунитета, которые необходимы для защиты клетки-продуцента от воздействия собственного бактериосина. Анализ наложения является быстрым методом исследования большого числа штаммов на предмет конкурентных взаимодействий, опосредованных бактериоцинами. Анализ наложения также позволяет охарактеризовать бактериоцин-специфический иммунитет и обнаружить секретируемые пептиды, чувствительные к кворуму. Анализ проводится путем предварительного инокуляции агаровой пластины штаммом, подлежащим испытанию на продукцию бактериоцина, с последующим нанесением мягкого агарового покрытия, содержащего штамм, подлежащий испытанию на чувствительность к бактериоцину. Зона зазора вокруг укола указывает на то, что наложенный штамм чувствителен к бактериоцинам, продуцируемым предварительно инокулированным штаммом. Если зона клиренса не наблюдается, либо оверлейный штамм невосприимчив к продуцируемым бактериоцинам, либо предварительно инокулированный штамм не продуцирует бактериоцины. Чтобы определить, является ли локус blp функциональным в данном штамме, анализ наложения может быть адаптирован для оценки секреции пептидных феромонов предварительно инокулированным штаммом. В этом случае в оверлее используется серия из четырех штаммов lacZ-репортеров с разной феромонной специфичностью.

Введение

Пневмококк, общая колонизатор полимикробной сообщества носоглотки, способен конкурировать с другими пневмококков и близкородственных видов путем производства бактериально производства антимикробных пептидов (Бактериоцины). Каждый полностью секвенировали пневмококковой штамм на сегодняшний момент содержит версию б acteriocin- л Айк р eptide локуса, BLP. Бактериоцин производство по пневмококка была продемонстрирована быть важно в исходе как в пробирке и в естественных условиях конкуренции 1-4. Конкурентные динамика под влиянием экспрессии различных бактериоцинов наряду с родственными белками иммунитета в ответ на конкретный пептидной феромона. Индукция BLP локуса контролируется кворума системы зондирования, в котором пептид феромон, BlpC, связывается с киназы датчика, BlpH, и инициирует сигнальный каскад, что приводит ктранскрипция BLP локуса 5,6. Существуют четыре аллельные вариации BlpC, что каждый связываются с родственным BlpH 6. Для клеток, чтобы выжить эффекты собственной бактериоцина, гены, которые кодируют белки, родственные иммунитета транскрибируются на той же оперона в качестве каждого из генов бактериоциновых. Уничтожение происходит, если штамм конкурент не может положительно регулировать в BLP локус в ответ на экзогенный феромона, или, если штамм не имеет конкретный ген иммунитета, необходимого для защиты. Транспортер комплекс, BlpAB требуется для секреции и обработки пептидного феромона и бактериоцина пептидов 2,4. Недавно было показано, что значительная доля пневмококковых штаммов "мошенники", то есть они имеют сохраняющуюся мутацию в гене blpA что делает их не в состоянии выделять феромоны и бактериоцинами 1,2. Эти штаммы способны реагировать на внешнее BlpC 2 секретируется ржутрасточные штаммы, позволяющие для производства иммунитета белков.

Хотя, неочищенные препараты бактериоцинов из супернатантов могут быть получены из штаммов-продуцентов с помощью биохимических методов шаги, чтобы достичь чистоты, этот подход не является полезным для скрининга больших коллекции штаммов, и если уровень экспрессии бактериоцина низка в бульоне выращивают культур 2,7- 9. Наложение анализ используют в качестве быстрого способа исследовать динамику конкуренции между штаммами, которые могут существовать в пробирке. Чтобы сделать это, пневмококковой деформации предварительно высевали на чашку с агаром и давали им расти, чтобы достичь местных бактериальных концентрации, достаточные для индукции BLP локуса. Второй штамм затем инокулировали в мягком агаре расплавленного раствора, который затем наносили на предварительно заражают штаммом для проверки чувствительности. Для оценки для деятельности BLP локуса (независимо от ингибиторной активности), штаммы могут быть наложены с серией гоРи, описанные ранее штаммов репортер BlpC. Эти штаммы были построены, чтобы содержать один из трех различных аллелей blpH, которые отвечают на трех наиболее распространенных феромонов BlpC секретируемых пневмококков. Штаммы репортер имеют встроенный ген LacZ, который находится под контролем BlpH зависимого промотора и ношение удаление в гене blpC что предотвращает самостимуляция 10,11.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1 Получение штамма-продуцента

  1. Подряд пневмококковой штамм пройти тестирование на бактериоцина производства на 5% овечьей кровью триптического соевым агаром от -80 ° C запасов морозильных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование пластин крови для начального роста штамма пройти тестирование на ингибирование значительно повышает воспроизводимость анализа. Кроме того, другие не-пневмококковых штаммов, которые продуцируют бактериоцины могут быть использованы, хотя условия роста, возможно, должны быть изменены для конкретного организма. Мы использовали Streptococcus Mitis и Lactococcus Лактис в наложения Пробирной успешно.
  2. Инкубировать в течение ночи (O / N) при 37 ° С с 5% CO 2.
  3. После инкубации штамма-продуцента, подготовить триптического соевый агар (TSA) пластину с помощью пипетки от 3000 до 4000 единиц каталазы на чашки, содержащие 25 мл TSA и распространять решение каталазы использованием стерильных стеклянных шариков. Пусть пластинка высохнуть в течение примерно 10 мин прибокс биологической безопасности.
  4. Соберите видимый количество бактерий на кончика пипетки. Stab пипетки в высушенном TSA пластины.
    Примечание: более одного штамма-продуцента может быть ножом в одном TSA пластины. Важно растянуть ударов, так что в результате ореолы не перекрываются.
    1. Если это возможно, включают известные бактериоцин производителя в качестве положительного контроля и деформации, которые будут использоваться в наложении в качестве отрицательного контроля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Положительные и отрицательные контрольные образцы были ранее опубликованы и доступны по запросу 10.
  5. Инкубируйте TSA пластину, содержащую множество удары при 37 ° С с 5% CO 2 в течение 6 часов.

2. Создание Глицерин Запасы штамма Overlay

  1. Подготовьте глицерина запасы (культур, выращенных до середины экспоненциальной фазы, а затем хранили при -80 ° С после добавления глицерина) до дня наложения Пробирной. Привить 5-10 колонии пневмококковой улайн пройти тестирование на чувствительность или секреции феромонов в Тодд-Hewitt среде с экстрактом 0,5% дрожжевого (THY).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Строительство BlpC индуцибельных журналистами был описан ранее 2 и штаммы предоставляются по запросу.
  2. Выдержите 5-10 колонии в стеклянных трубок с 5 мл твои с плотно закрытыми веками в водяной бане при 37 ° без встряхивания.
  3. Инкубируют культуры при 37 ° С, пока они не достигают наружный диаметр 620 от 0,3 до 0,5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это займет около 4-5 ч в зависимости от используемого штамма.
    1. Аккуратно переверните трубки несколько раз до измерения OD.
  4. Если эксперимент не может быть выполнена в тот же день или штамм будет использоваться несколько раз в будущем, сделать запасы глицерина и возобновить эксперимент на более поздний срок. Для запасов глицерина, добавить глицерин в культурах до конечной концентрации 20%. Алиготе культуры в 1,5 мл микропробирок и хранить при температуре -80 ° С. ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть сческое течение нескольких месяцев при -80 ° С. Если не делая запасы глицерина, использовать образцы непосредственно для наложения Пробирной.

3 наложения Пробирной

  1. Только до наложения приложение, смешивать компоненты наложения. В 15 мл коническую трубку, добавить 5 мл твой, 3000-4000 U каталазы и 200 мкл штамма наложения бульонной культуры, которая была либо выросли в тот день или глицерине культуры, что было разморозить при комнатной температуре. При использовании репортер процедить, добавить 50 мкл X-Gal (40 мг / мл), чтобы наложения смеси. Используйте одну коническую трубку за тарелку.
  2. Равновесие наложения смеси при комнатной температуре перед добавлением расплавленного АСП.
  3. Удалить TSA пластину с ножом деформации от инкубатора. Растопить твердый АСП в микроволновой печи и не держать при 55 ° С на водяной бане до начала использования. Добавить 3 мл расплавленной АСП с 1,5% агара охлаждают до 55 ° С, чтобы наложить смесь.
    1. Подготовьте наложения смесь непосредственно перед отбором, смесь начнет затвердевать оченьбыстро. ПРИМЕЧАНИЕ: Если накладка начинает затвердевать до обшивки, результаты будут интерпретируемы.
  4. Смешайте наложения смесь с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз с 5 мл пипетки осторожно, чтобы не вводить пузырьков в смеси. Медленно пипетки наложения смесь непосредственно на зарезал TSA пластины. Держите тарелку по крышке в течение нескольких минут, позволяя агар затвердевать.
    1. Не поворачивайте тарелку распространять наложения смесь, это потянет рост с ножом культуры в наложение.
  5. Осторожно поместите TSA пластину с накладкой в 37 ° C инкубаторе, содержащем 5% CO 2 O / N (примерно 16-18 ч).
  6. Соблюдайте тарелки после ночного роста. Планшеты должны появиться непрозрачным от роста штамма наложения за исключением районов, где произошли ингибирование или феромон сигнализации. Они появятся как либо четких или синей зоне вокруг ножом деформации, соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, измерения дментов из диаметра синего или очистки может быть определена для количественной оценки, различия в диаметре может также изменяться в зависимости от количества бактерий, которые были ножом в пластину. Наложение анализ качественный анализ, любая количественная оценка следует интерпретировать с осторожностью. Любое видимое очистки по сравнению с отрицательным контролем, рассматривается как активность.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Есть два возможных исхода в наложения Пробирной. Это должно быть возможным, чтобы увидеть рост штамма ножом после инкубации в течение ночи. В рисунке 1а, штамм наложения чувствителен к бактериоцины производится. Зона оформления могут быть визуализированы, окружающая ножом нагрузку. Кроме того, вихревое движение ножом процедите в наложения смеси можно и можно увидеть в рисунке 1а. В рисунке 1b, штамм наложения невосприимчив к бактериоцинами вырабатывается организмом как ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Это наложение анализ является быстрый способ определить диапазон деятельности для производителей бактериоциновых и продемонстрировать конкурентные взаимодействия, которые могут возникнуть между пневмококковых штаммов. Наложение анализ может быть выполнен с возможностью использовать для скрининга нескольких штаммов для производства бактериоцина на одной пластине. Мы успешно скрининг больших коллекций штамма этом анализе с использованием 48-контактный репликатор для инокуляции SBA пластины из одной половины 96-луночный пл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана премией Элизабет Э. Кеннеди за исследования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Триптиказ Соевый агар с 5% овечьей кровиFisherB21261XДля роста из морозильных культур
КаталазаСигмаС100-500 мг4,741 единиц на тарелке
Бульон Тодда Хьюитта + Дрожжевой экстракт (THY)FisherDF0492-17-6 30 г THB, 5 г дрожжевого экстракта, 1 л автоклава ddH2O
Триптиказ Соевый бульон + агаровые пластины (TSA)FisherB11768 30 г TS, 15 г агара, 1 л автоклава ddH2O
5-бром-4-хлор-3-индолил&бета;-D-галактопиранозид (X-gal)SigmaB4252-50MGРастворить в диметилформамиде
чашки ПетриСпектрофометр
ИзмеряетOD<суб>620 культур
С водяной баней
37 °°; C инкубатор с 5% CO2
коническая трубка
Фишера FB0875712 37° 15 мл

Ссылки

  1. Dawid, S., Roche, A. M., Weiser, J. N. The blp bacteriocins of Streptococcus pneumoniae mediate intraspecies competition both in vitro and in vivo. Infect Immun. 75 (1), 443-451 (2007).
  2. Sawa, N., et al. Isolation and characterization of enterocin W, a novel two-peptide lantibiotic produced by Enterococcus faecalis NKR-4-1. Appl Environ Microbiol. 78 (3), 900-903 (2012).
  3. Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195 (7), 1561-1572 (2013).
  4. Lux, T., Nuhn, M., Hakenbeck, R., Reichmann, P. Diversity of bacteriocins and activity spectrum in Streptococcus pneumoniae. J Bacteriol. 189 (21), 7741-7751 (2007).
  5. Reichmann, P., Hakenbeck, R. Allelic variation in a peptide-inducible two-component system of Streptococcus pneumoniae. FEMS Microbiol Lett. 190 (2), 231-236 (2000).
  6. Saizieu, A., et al. Microarray-based identification of a novel Streptococcus pneumoniae regulon controlled by an autoinduced peptide. J Bacteriol. 182 (17), 4696-4703 (2000).
  7. Barbour, A., Philip, K., Muniandy, S. Enhanced production, purification, characterization and mechanism of action of salivaricin 9 lantibiotic produced by Streptococcus salivarius NU10. PLoS One. 8 (10), 77751(2013).
  8. Wladyka, B., et al. Isolation, biochemical characterization, and cloning of a bacteriocin from the poultry-associated Staphylococcus aureus strain CH-91. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (16), 7229-7239 (2013).
  9. Shea, E. F., et al. Bactofencin a, a new type of cationic bacteriocin with unusual immunity. 4 (6), 00498-00413 (2013).
  10. Son, M. R., et al. Conserved mutations in the pneumococcal bacteriocin transporter gene, blpA, result in a complex population consisting of producers and cheaters. MBio. 2 (5), (2011).
  11. Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195, 1561-1572 (2013).
  12. Widdick, D. A., et al. Cloning and engineering of the cinnamycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 4316-4321 (2003).
  13. Begley, M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. Identification of a novel two-peptide lantibiotic, lichenicidin, following rational genome mining for LanM proteins. Appl Environ Microbiol. 75 (17), 5451-5460 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Streptococcus pneumoniaeBLPTSATHY
Использование наложения Пробирной для Качественно Измерьте бактериальной продукции и чувствительность к пневмококковой Бактериоцины
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.