Методическая статья

Экстракорпоральное синтеза модифицированных мРНК для индукции экспрессии белка в клетках человека

DOI:

10.3791/51943

⸱

13 ноября 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Thoracic, Cardiac, and Vascular Surgery, University Hospital Tuebingen

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом видео статье мы описывают синтез в пробирке модифицированной мРНК для индукции экспрессии белка в клетках.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экзогенный доставка кодирования синтетических РНК (мРНК) для индукции синтеза белка в нужные ячейки имеет огромный потенциал в области регенеративной медицины, основной клеточной биологии, лечения заболеваний, и перепрограммирования клеток. Здесь мы опишем шаг за шагом протокола для генерации модифицированной мРНК с пониженным потенциалом иммунной активации и повышенной стабильности, контроля качества производимой мРНК, трансфекции клеток с мРНК и проверки экспрессии белка индуцированной цитометрическим. До 3-х дней после одного трансфекции EGFP мРНК, трансфицированные клетки НЕК293 производить EGFP. В этой статье видео, синтез мРНК EGFP описан в качестве примера. Тем не менее, эта процедура может быть применена для производства других желаемых мРНК. Использование синтетических модифицированный мРНК, клетки могут быть индуцированы к временно выразить желаемые белки, которые они обычно не экспрессируют.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В клетках, транскрипция матричной РНК (мРНК) и следующие перевод мРНК в нужных белков обеспечения надлежащего функционирования клеток. Наследственные или приобретенные генетические нарушения могут привести к недостаточной и неблагополучной синтеза белков и вызвать серьезные заболевания. Таким образом, новый терапевтический подход, чтобы вызвать выработку недостающих или поврежденных белков является экзогенный поставка синтетических изменены мРНК в клетках, который кодирует нужного белка. Таким образом, клетки активируются синтезировать функциональных белков, которые они обычно не могут производить или, естественно, не нужно. Используя этот подход, генетические наруше....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Увеличение плазмиды, содержащие Обязательные Кодирование последовательностей ДНК (CDS)

  1. Предварительно теплой средой SOC, который входит в набор преобразований, до комнатной температуры и агаром LB, содержащей 100 мкг / мл ампициллина до 37 ° С. Уравновешивают ванну воды до 42 ° С.
  2. Оттепель один флакон химически компонента Е. палочка на льду.
  3. Добавить 1-5 мкл плазмиды (10 мкг до 100 нг), содержащий СДУ во флакон с химически компонента Е. палочка и аккуратно перемешать. Не смешивать клетки с помощью пипетки. После добавления плазмиды, тщательно смешать трубку осторожно.
  4. Выдержите смесь на льду в течение 30 м....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование pcDNA 3,3 плазмиды, содержащей СДУ из EGFP, был создан синтез модифицированных EGFP мРНК (рисунок 1). После вставки амплификации ПЦР и поли Т-хвостохранилище, ясно полоса длиной около 1100 пар оснований обнаруживается (рисунок 2). Увеличение времени IVT Дополненная выход мРНК (рис 3). После бесступенчатой, ясно мРНК полоса длиной около 1100 пар оснований был обнаружен, что соответствует длине EGFP мРНК для производства (рисунок 4).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

МРНК терапия обладает огромным потенциалом в области регенеративной медицины, лечения заболеваний и вакцинации. В этом видео мы покажем, производство стабилизированной, модифицированной мРНК для индукции экспрессии белка в клетках. Используя этот протокол, другие желаемые мРНК могут быть сгенерированы. Синтез в пробирке из модифицированной мРНК позволяет трансфекцию клеток с желаемыми мРНК для индукции экспрессии белков-мишеней. Таким образом, желаемый белок экспрессируется временно в физиологических условиях д.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот проект был профинансирован европейских социальных фондов в земле Баден-Вюртемберг, Германия.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Cell culture
DMEM, высокий уровень глюкозыPAAE15-009
FBSLife Technologies10500
Пенициллин/стрептомицин PAAP11-010100x
L-глютамин ПААМ11-004200 мМ
ДПБС без кальция и магния ПААЕ15-002
0,04% трипсин / 0,03% ЭДТА PromocellC-41020
TNSPromocellC-41120раствор нейтрализующего трипсина, 0,05% ингибитор трипсина в 0,1% BSA
HEK-293 клеткиATCCCRL-1573
Расходные материалы
Планшеты для культуры тканей, 12-лунки Corning3512
Колба для клеточных культур (75 см<суп>2)Corning430641
стерильные микроцентрифужные пробирки без ДНКазы и РНКазы 1,5 мл Eppendorf0030 121.589Safe-Lock, Biopur
15 мл конические тубы greiner bio-one188271
ПЦР чистые и стерильные наконечники для пипеток epT.I.P.S. с двойным фильтром Eppendorf10 µ l: 022491202; 100 &микро; l: 022491237; 1,000 & микро; l: 022491253
Cryovialgreiner bio-one122279-128Cryo.s 
Полипропиленовая трубка с круглым дном 14 мл для бактериального посева BD Falcon352059
Amplification and purification
pcDNA 3.3_eGFP Plasmid Addgene26822
One Shot Top10 химический компонент Escherichia coli InvitrogenC4040-10
Стерильная вода (Ampuwa)Fresenius Kabi1636071
LB среда (Luria/Miller) Carl RothX968.1Растворите 25 г L-1 в стерильной воде.
Агар LB (Лурия/Миллер) Carl RothX969.1Растворите 40 г L-1 в стерильной воде.
Ампициллин готовый растворSigma AldrichA5354100 мг/мл
ГлицеринSigma AldrichG2025
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen27104
mRNA production
HotStar HiFidelity Polymerase Kit Qiagen202602
Набор для очистки ПЦР QIAquick Qiagen28106
MEGAscript T7 Kit Life TechnologiesAM1334
5-метилцитидин-5 &TrilinkN10145-метил-CTP
псевдоуридин-5 &TrilinkN1019Псевдо-УТП
3´-O-Me-m7G(5´)ППС(5&ОСТРЫЙ;)Аналог структуры колпачка G РНК New England BiolabsS1411L
RiboLock РНКаза ИнгибиторThermo ScientificEO038140 U/µ l 
ТУРБО ДНКазыLife TechnologiesAM13342 U/&микро; l (из набора MEGAscript T7)
Антарктическая фосфатаза Новый Английский БиолабсMO289S
RNeasy мини-набор Qiagen74104
РНКазеРешение Zap Life TechnologiesAM9780
Transfection
Lipofectamine 2000 Реагент для трансфекции Invitrogen11668-019Реагент для трансфекции катионных липидов
Opti-MEM I Редуцированная сыворотка Media Invitrogen11058-021Улучшенная минимальная незаменимая среда (MEM), которая позволяет уменьшить количество добавок фетальной бычьей сыворотки (FBS)
Gel electrophoresis
AgaroseSigma-AldrichA9539
Gelred Nucleic Acid Gel StainBiotium4100310,000x in water 
peqGOLD Range Mix DNA-Ladder Peqlab25-2210
Анализ проточной цитометрии
CellFIX (1x)BD Biosciences34018110x концентрат 
Праймер для амплификации вставки и поли (T) хвост PCR
Forward Primer (класс ВЭЖХ) 10 & микро; MElla Biotech5´-TTGGACCCTCGTAC
AGAAGCTAATACG-3´
Обратная грунтовка (класса ВЭЖХ) 10 & микро; MElla Biotech5´- T120-CTTCCTACT
CAGGCTTTATTCAA
AGACCA-3´
Equipment
Cell incubatorBinderCO2 (5%) и O2 (20%) 
Счетчик ячеек CASY Schä Стерильный верстак rfe System
 BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH
Бактериальный инкубатор Incutec
Водяная баня
ScanDrop спектрофотометр Аналитический
PCR  Eppendorf
МикроцентрифугаEppendorf
Vortexpeqlab
ТермомиксерEppendorf
Gel аппарат для электрофореза Bio-Rad
Gel Система Bio-Rad
FACScan BD Biosciences
 Nikon
 Цейсс
термоциклер Jena Система документирования Флуоресцентный микроскоп Фазово-контрастный микроскоп

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bangel-Ruland, N., et al. CFTR-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis "gene therapy". The journal of gene medicine. , (2013).
  2. Benteyn, D., et al.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vitroGFPHEK293

Похожие статьи