Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выполнение поведенческие задачи в субъектах с внутричерепных электродов

11.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51947

⸱

2 октября 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosciences, Cleveland Clinic Foundation, 2Epilepsy Center, Cleveland Clinic Foundation, 3Department of Neurosciences and Center for Neurological Restoration, Cleveland Clinic Foundation, 4Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University

В этой статье

Краткое содержание

Пациенты с имплантированным внутричерепных электродов предоставляют уникальную возможность записать неврологические данные из нескольких областях мозга, когда пациент выполняет поведенческие задачи. Здесь мы представляем способ записи из имплантированных пациентов, которые могут быть воспроизводимым в других учреждениях, имеющих доступ к данной популяции пациентов.

Аннотация

Пациенты, имеющие стерео-электроэнцефалография (Seeg) электродные, субдуральная сетки или глубины электродов имплантаты имеют множество электродов, имплантированных в различных областях их мозга для локализации их внимания захват и красноречивых областях. После имплантации пациент должен оставаться в больнице до патологическое область мозга не обнаружено и, возможно, резекции. В течение этого времени, эти пациенты дают уникальную возможность для научного сообщества, потому что любое количество поведенческих парадигм могут быть выполнены, чтобы раскрыть нейронные корреляты что руководство поведение. Здесь мы представляем метод регистрации активности головного мозга от внутричерепных имплантатов как субъекты выполнить поведенческую задачу предназначенной для оценки процесса принятия решений и кодировку вознаграждение. Все электрофизиологические данные внутричерепных электродов записываются в поведенческих задач, позволяя за рассмотрение многих областях мозга, участвующих в одной функции на временных масштабах отношение к поведению.Более того, и в отличие от исследований на животных, больных человека можете узнать самые разнообразные поведенческие задач быстро, что позволяет за способность выполнять несколько задач в этой же теме или для выполнения контроля. Несмотря на многие преимущества этой техники для понимания функции человеческого мозга, есть и методологические ограничения, которые мы обсуждаем, в том числе экологических факторов, обезболивающее действие, временных ограничений и записей из пораженной ткани. Этот метод может быть легко реализована в любом учреждении, которое выполняет внутричерепные оценок; предоставляя возможность непосредственно изучить функцию человеческого мозга во время поведения.

Введение

Эпилепсия является одним из наиболее распространенных заболеваний мозга, характеризуется хронически рецидивирующими приступами в результате чрезмерных электрических разрядов из групп нейронов. Эпилепсия поражает около 50 миллионов человек по всему миру и около 40% всех людей, страдающих эпилепсией имеют трудноразрешимые приступы, которые не могут быть полностью контролируемые медикаментозной терапии 1. Хирургическое вмешательство может привести к приступов статуса, если области мозга, ответственные за генерацию судорог (эпилептогенной зоны - EZ) локализованы и удалены хирургическим путем или отключен. Для того чтобы определить анатомическую расположение EZ и его близость с возможными корковых и подкорковых красноречивых областях, массив неинвазивных инструментов доступны: анализ приступов симптоматики, видео-головы электроэнцефалографическими записей (иктальных и интериктальных записи), нейропсихологические тестирования , магнитоэнцефалография (МЭГ) и МРТ 2. Когда неинвазивный данных является недостаточным для preciselу определить местоположение гипотетического EZ, когда есть подозрение на ранней участия красноречивым корковых и подкорковых областях или когда есть возможность для мульти-координационных судорог, хронический инвазивный контроль может потребоваться 3,4.

Методы хронического инвазивного мониторинга для определения местоположения и границ с EZ может включать субдуральной сетки и полосы, с электродами, расположенными на поверхности мозга, и стерео-электроэнцефалография (Seeg), когда несколько электродов глубина размещаются в мозге в трех- мерное моды. Subdural внутричерепные записи были первоначально сообщалось в 1939 году, когда Пенфильд и его коллеги использовали эпидуральную одиночные контактные электроды у пациента со старым левой перелома височно-теменной и чьи пневмоэнцефалография раскрыты диффузный церебральный атрофию 5. Впоследствии, использование субдуральной массивов сетки стали более популярными после многочисленных публикаций в течение 1980-х годов показали, ихБезопасность и эффективность 6. Метод Зег была разработана и популяризировал во Франции Жан Tailarach и Жан Bancaud в 50-е и был в основном используется во Франции и Италии, как метод выбора для инвазивной отображения в огнеупорной фокальной эпилепсии 7-9.

Принцип Зег основана на анатомо-электро-клинический корреляций, которые принимает в качестве основного принципа 3-мерную пространственно-временной организации эпилептического разряда в мозге в корреляции с судорожной симптоматики. Стратегия имплантация индивидуализированы, с размещением электродов на основе преимплантационной гипотезы, которая принимает во внимание первичную организацию в эпилептиформной активности и гипотетический эпилептический сети, участвующих в распространении судорог. По мнению ряда европейских и последние североамериканских отчеты, методология Зег позволяет точные записи из глубоких корковых и подкорковых структур, многократного несмежный ЛоБес, и двусторонние изыскания, избегая при этом потребность в больших краниотомии 10-15. Впоследствии, послеоперационные изображения взяты получить точное анатомическое положение имплантированных электродов. Впоследствии начала периода мониторинга, в котором пациенты остаются в больнице в течение от 1 до 4 недель, чтобы записать интериктальных и параличом деятельности от имплантированных электродов. Этот период мониторинга подходящее время для изучения функции мозга с помощью событий, связанных с Зег анализ, как нет дополнительный риск, и пациент, как правило, рассматривает научное исследование в качестве приветственного отсрочку от мирской период мониторинга. Записи получил от внутричерепные электроды не только жизненно важное значение для улучшения оценки и ухода за больных эпилепсией, но дополнительно обеспечивают исключительную возможность изучить мозговую деятельность человека во время поведенческих парадигм.

Некоторые исследователи уже осознали возможность изучить инвазивных записи сбольных эпилепсией. Хилл и др. Сообщил о методологии для записи electrocorticographic (ЭГ) сигналы от пациентов для функциональной корковой отображения 16. ЭГ записи также проливают на мотор-языковой связи 17. Пациенты с имплантированными электродами глубины провели навигационные задачи для изучения колебаний мозга в памяти, обучения 18 и передвижения 19. Глубина первые записи были также использованы для изучения парадигмы с иным недостижимой временным разрешением, таких как гиппокампа вызванной активности 20 нейронной активности в умолчанию режима сети 21 в, и височной ходе эмоционального обработки 22. Юдри др изучали пациентов с височной эпилепсией, которые были Зег электродов, имплантированных в их миндалины для краткосрочных обонятельных раздражителей, соответствующих 23. Другая группа изучила простые движения конечностей, такие как сгибания рук или одностороннего движения рукой или ногой в здоровом BRAIп сайты от больных эпилепсией с имплантированным Зег 24,25.

Исследования, описанные выше, являются небольшая выборка очень разнообразной коллекции соответствующей литературы. Там существует непреодолимый потенциал, чтобы узнать и понять, как работает человеческий мозг с помощью комбинации поведенческих задач и внутричерепных записей. Хотя существуют и другие способы для достижения этой цели, внутричерепные записи обладают рядом преимуществ, включая высоким временным и пространственным разрешением, а также доступ к более глубоким структурам. Авторы стремятся описать общую методологию для записи пациентов с внутричерепной электродов при поведенческих задач. Тем не менее, есть несколько сдерживающих факторов и барьеров для успешного завершения клинических исследований у пациентов, получающих лечение. Ограничения, искажающие эффекты, и значение этого исследования также будут выявлены и разведаны.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все задачи были выполнены в соответствии с утвержденным протоколом представленного ведомственного комитета по вопросам (IRB) в Cleveland Clinic Foundation. Процесс информированного согласия был проведен с каждым пациентом до всех научно-исследовательской деятельности. В этом примере, при условии, что отвечает критерию обучения, которая была стерео-электроэнцефалография (Seeg) электроды, имплантированные для захвата выбирается. Проект обсуждался с предметом, и они дали согласие на участие.

1 Пациент Зачисление

  1. Оценка пациентов с огнеупорной эпилепсии в рассмотрение для внутричерепного электрода имплантации. Если пациент является хорошим кандидатом для инвазивной хирургии, анализировать пациент сайт МРТ, ПЭТ и МЭГ вместе с судорожной патологией с целью оптимизации размещения электродов. Клиническое команда выполняет все оценки и никакие решения не принимаются в исследовательских целях. .
  2. Определить пациентов, имеющих право на исследования subsequeщ оценки для имплантации и проверить пациентов в утвержденной IRB протокол на основе критериев, включения / исключения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это в интересах пациента, чтобы включить предметы с аурой в критериям включения. Пациенты с ауры могут уведомить исследователей, что они собираются иметь захват; давая исследователям и пациента время, чтобы принять необходимые меры предосторожности (нажатием захват тревогу уведомить клинического персонала и потянув все оборудование из пути). Однако, если субъекты набираются, которые не имеют ауру, гарантировать, что пациент устройства ввода могут быть легко удалены из зоны пациента и что персонал осознает исследовательского оборудования и протокола.
  3. Получение информированного согласия до любых научно-исследовательской деятельности в соответствии с IRB. В ходе информированного согласия, объяснить исследования, подчеркивая, что участие является строго добровольным и никоим образом не будет влиять пациентов клинической помощи. В большинстве случаев там яс прямой выгоды для пациента и их готовность участвовать в альтруистической.
  4. Поддержание уважения прав пациента и конфиденциальность во все времена. Напомните пациентам, что их информация будет оставаться анонимным и конфиденциальным, и они могут прекратить участие в исследовании в любое время под никакого значения.
  5. Есть знак пациента и дату информированное согласие, если он или она понимает и соглашается принять участие в исследовании. Оставьте один экземпляр остается у пациента для рассмотрения; если они есть вопросы или проблемы поощрять пациентов, чтобы связаться с PI.

2 Поведение настройки системы

  1. До приведения оборудования в комнату, убедитесь, что есть достаточно места в комнате пациента, а также доступ к необходимым точек (2).
  2. Убедитесь, что все оборудование и провода готовы ускорить создана. Поведенческая система включает FDA одобрен манипулятор (который позволяет субъекту продолжениерол курсор во время задачи), портативный компьютер для управления поведения программу, монитор для представления стимулы задачи и систему сбора данных для хранения электрофизиологические и поведенческие данные.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, необходимые изменения для удовлетворения конкретных потребностей своего исследования. Например, использовать кнопку окно для интерфейса пациента вместо манипулятора.
  3. Если пациент в настоящее время не установлен таким образом, подходящим для выполнения задачи, помочь пациенту в кресле с откидной спинкой (или кровать) с оружием, они должны иметь захват.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это хорошая идея, чтобы обсудить дизайн исследования, оборудование и т.д. со всеми членами группы по мониторингу, чтобы проинформировать их о том, что происходит, как группа будет взаимодействовать с пациентами, и любые возможные проблемы, которые могут возникает.
  4. Когда пациент готов, довести поведенческую систему в комнату и начать загрузке поведенческий систему и робота-манипулятора.
  5. Подключите цифровой Marke событийг выход из поведенческой компьютера к каналам постоянного электрофизиологических системы сбора, чтобы время блокирования записи сигналов Зег с поведенческими маркеров событий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом центре есть отдельная электрофизиологические система сбора предназначен для научно-исследовательских целей, которые не мешают клинической системы сбора. Тем не менее, можно использовать клинический систему сбора, работая с соответствующим персоналом. Все усилия должны быть предприняты, чтобы не нарушать клиническую приобретение.
  6. Калибровка робота-манипулятора и позиционировать его таким образом, что диапазон движения для пациента. Если с помощью другого интерфейса устройства, убедитесь, что оборудование работает правильно и позиционируется удобно для предметом использовать.
  7. При использовании робота-манипулятора, убедитесь, что кнопки аварийного останова можно легко добраться на исследователей по всему поведенческих задач. В случае захвата, кнопка аварийного останованажата и оборудование оторвался от пациента так, чтобы они не вредят сами себе. Кроме того, мы не используем липучки ремни, которые приходят с робототехнической системы, чтобы облегчить удаление из организма пациента в случае происходит захват.
    Примечание: В этом примере, параллельный порт поведения установки подключен к цифровому входному порту системы сбора с помощью кабеля параллельного порта. Дополнительные аналоговые сигналы, такие как х и у позиции манипулятора записываются одновременно.

3 поведенческих задач

  1. Объясните задачу к пациенту следующий завершения установки, созданной и калибровки устройства интерфейса.
  2. Используйте поведенческую задачу, подобную детской карточной игре «война». Попросите пациента сделать пари относительно того, является ли их карта больше карты компьютера. Выбор ставки основан на восприятии пациентов относительной стоимости их карты. Упростить тспросите для последующего анализа, используя только карты одной масти и ограничения палубу с 2, 4, 6, 8, и 10 пронумерованных карт.
  3. Показать закрепляющий реплику на экране на 350 мс. Убедитесь, пациент держит курсор на фиксации отметки инициировать задачу.
  4. Показать стимул для 1000 мс. Разрешить пациент, чтобы увидеть свои карты с карты компьютера рядом с его лицом вниз.
  5. После исчезновения карт, показать Go-кий (<5000 мс) отображение двух вариантов, попросив пациента сделать ставку либо $ 5 или $ 20, в зависимости от их карты. Попросите пациента, чтобы поместить ставку, перемещая курсор с помощью робота-манипулятора, над выбранной ими пари. Случайно позицию пари от суда к суду, чтобы исключить смещение на основе позиции.
  6. После ставка была выбрана, заметите 250 - 500 мс задержки (пустой экран), а затем через откровение карты компьютера (1000 - 1250 мс). Соблюдайте исход (1000 мс), что судебный процесс был ли выиграть, проиграть или рисовать исколько выиграл или проиграл.
  7. Разрешить пациент практиковать, пока они не будут уверены в их исполнении и нет вопросов.

4 сбора данных

  1. Запишите данные, когда пациент готов и проверьте, что параметры на исследования (или клинический) системы сбора, соответствующим образом выбирают.
  2. Выключите свет в комнате и телевизор, чтобы фоновый шум к минимуму во время записи. Кроме того, попросите пациента воздержаться от поведения, такие как задействовать их ногой, говорить или качали ноги.
  3. Начните задачу и записать пациента выполнения задачи. Попросите его выполнить задачу в течение 30 мин. Частота дискретизации роботизированной системы рычагов 1 кГц, и что из системы записи Зег является 2 кГц.
    Примечание: Эта длительность может быть различным для других парадигм.

Анализ 5. данных

  1. Прежде всего, де-определить записанные данные Зег, чтобы гарантировать, что Informa пациентация остается конфиденциальной и что его / ее данные представлены анонимно.
  2. Получить координаты электродов местах от послеоперационном КТ и предоперационной МРТ.
  3. Совместите нейрофизиологические записи с цифровых меток времени интересов от поведенческих задач.
  4. Применить методы анализа сигнала для анализа зависит событий мозговой деятельности модуляцию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании, спектральная плотность мощности (PSD) мероприятия, связанные сигналы Зег была рассчитана с использованием Chronux multitaper инструментов 26,27. Каждое испытание данные были выровнены по отношению к соответствующему событию (нулевой момент времени), и рассчитывается СДП была нормализована в каждой по частоте по отношению к базовому PSD.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этих результатов мы представляем анализ данных Зег от лимбической системы захваченного в одной теме, играющий в войнушку задачу. Мы можем продемонстрировать, что различные аспекты войны Task вызвать значительное гамма-диапазон (40 - 150 Гц) модуляцию в лимбической системе (рисунок 1). Как видно, в зрительной коре, презентация объекта на экрана приводит к быстрой задержкой (~ 200 мсек) широкий резонанс полосы независимо от непредвиденных задач. Кроме того, как представляется, различия в длительности ре...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы представили способ выполнения внутричерепные электрофизиологические исследования на людях, как они участвуют в поведенческих задач. Эта методология и ее простые перестановки важны для изучения движения человека и познания. В то время как по своей сути существует преимущества и недостатки в любой технике, запись с внутричерепных электродов имеет преимущества перед другими электрофизиологических и визуализации методов. Два из главных преимуществ является возможность сбора данных высокого качества с лучшим контрол...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют никаких конфликтов по раскрытию.

Благодарности

Эта работа была поддержана Efri-MC3: # 1137237 присуждена SVS и ОЦГ

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
InMotion ARMInteractive Motion TechnologiesInMotion Armhttp://interactive-motion.com/inmotion-arm-the-new-standard-of-care/
Оборудование, которое использовала наша лаборатория, может использовать другое оборудование для сбора данных
MATLABMathworks IncMATLABhttp://www.mathworks.com/
Требуется версия r2007b или выше для запуска Monkeylogic
Data Acquisition ToolboxMathworks IncData Acquisition Toolboxhttp://www.mathworks.com/products/daq/
Необходимо запустить Monkeylogic
Image Processing ToolboxMathworks IncImage Processing Toolboxhttp://www.mathworks.com/products/image/
Must have have run Monkeylogic
Wael Asaad and David FreedmanMonkeylogichttp://www.brown.edu/Research/monkeylogic/
Скачать бесплатно, должен иметь MATLAB для запуска
Chronux ООО «Медаметрикс»Data Processing Toolboxhttp://www.chronux.org/Brainstorm
MEG/EEG Analysis Applicationhttp://neuroimage.usc.edu/brainstorm/
НоутбукDellLatitude E5530http://www.dell.com/us/business/p/latitude-e5530/pd? ST=dell%20latitude%20e5530& dgc=ST& cid=263756& lid=4781504& acd=12309152537461010NI
CardNational InstrumentsNI USB-6008http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/201986
12-битный, 10 кГц/с Недорогой многофункциональный сбор данных

Ссылки

  1. Epilepsy Fact Sheet No. 999. , World Health Organization. Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs999/en/ (2013).
  2. Rosenow, F., Luders, H. Presurgical evaluation of epilepsy. Brain. 124, 1683-1700 (1093).
  3. Adelson, P. D., et al. Use of subdural grids and strip electrodes to identify a seizure focus in children. Pediatr. Neurosurg. 22 (4), 174-180 (1995).
  4. Jayakar, P. Invasive EEG monitoring in children: When, where, and what. J Clin Neurophysiol. 16, 408-418 (1999).
  5. Almeida, A. N., Martinez, V., Feindel, W. The first case of invasive EEG monitoring for the surgical treatment of epilepsy: Historical significance and context. Epilepsia. 46, 1082-1085 (2005).
  6. Dinner, D. S., Luders, H. O., Klem, G. Chronic electrocorticography: Cleveland clinic experience. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. , 58-69 (1998).
  7. Bancaud, J., et al. Functional Stereotaxic Exploration (Seeg) of Epilepsy. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 28, 85(1970).
  8. Chassoux, F., et al. Intralesional recordings and epileptogenic zone in focal polymicrogyria. Epilepsia. 49, 51-64 (2008).
  9. Lo Russo, G., et al. Focal cortical resection in malformations of cortical development. Epileptic Disord. 5, S115-S123 (2003).
  10. Avanzini, G. Discussion of stereoelectroencephalography. Acta neurologica Scandinavica Supplementum. , 152-170 (1994).
  11. Cossu, M., et al. Stereo-EEG in children. Child Nerv Syst. 22, 766-778 (2006).
  12. Cossu, M., et al. Epilepsy surgery in children: Results and predictors of outcome on seizures. Epilepsia. 49, 65-72 (2008).
  13. Cossu, M., et al. Stereoelectroencephalography in the presurgical evaluation of focal epilepsy in infancy and early childhood Clinical article. J Neurosurg-Pediatr. 9, 290-300 (2012).
  14. Gonzalez-Martinez, J., et al. Stereoelectroencephalography in the "difficult to localize" refractory focal epilepsy: early experience from a North American epilepsy center. Epilepsia. 54, 323-330 (2013).
  15. Vadera, S., et al. Stereoelectroencephalography following subdural grid placement for difficult to localize epilepsy. Neurosurgery. 72, 723-729 (2013).
  16. Hill, N. J., et al. Recording human electrocorticographic (ECoG) signals for neuroscientific research and real-time functional cortical mapping. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
  17. Ibanez, A., et al. Motor-language coupling: direct evidence from early Parkinson's disease and intracranial cortical recordings. Cortex; a journal devoted to the study of the nervous system and behavior. 49, 968-984 (2013).
  18. Caplan, J. B., Madsen, J. R., Raghavachari, S., Kahana, M. J. Distinct patterns of brain oscillations underlie two basic parameters of human maze learning. J Neurophysiol. 86, 368-380 (2001).
  19. Watrous, A. J., Fried, I., Ekstrom, A. D. Behavioral correlates of human hippocampal delta and theta oscillations during navigation. J Neurophysiol. 105, 1747-1755 (2011).
  20. Roman, R., et al. Hippocampal negative event-related potential recorded in humans during a simple sensorimotor task occurs independently of motor execution. Hippocampus. , (2013).
  21. Jerbi, K., et al. Exploring the electrophysiological correlates of the default-mode network with intracerebral EEG. Front Syst Neurosci. 4, 27(2010).
  22. Krolak-Salmon, P., Henaff, M. A., Vighetto, A., Bertrand, O., Mauguiere, F. Early amygdala reaction to fear spreading in occipital, temporal, and frontal cortex: a depth electrode ERP study in human. Neuron. 42, 665-676 (2004).
  23. Hudry, J., Perrin, F., Ryvlin, P., Mauguiere, F., Royet, J. P. Olfactory short-term memory and related amygdala recordings in patients with temporal lobe epilepsy. Brain. 126, 1851-1863 (2003).
  24. Rektor, I., Bares, M., Kubova, D. Movement-related potentials in the basal ganglia: a SEEG readiness potential study. Clin Neurophysiol. 112, 2146-2153 (2001).
  25. Rektor, I., Louvel, J., Lamarche, M. Intracerebral recording of potentials accompanying simple limb movements: a SEEG study in epileptic patients. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 107, 277-286 (1998).
  26. Mitra, P., Bokil, H. Observed Brain Dynamics. , Oxford University Press. New York. (2008).
  27. Lachaux, J. P., Axmacher, N., Mormann, F., Halgren, E., Crone, N. E. High-frequency neural activity and human cognition: past, present and possible future of intracranial EEG research. Progress in neurobiology. 98, 279-301 (2012).
  28. Rogers, R. D., et al. Choosing between small, likely rewards and large, unlikely rewards activates inferior and orbital prefrontal cortex. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 9029-9038 (1999).
  29. Lachaux, J. -P., Axmacher, N., Mormann, F., Halgren, E., Crone, N. E. High-frequency neural activity and human cognition: Past, present and possible future of intracranial EEG research. Prog. Neurobiol. 98, 279-301 (2012).
  30. Gale, J. T., Martinez-Rubio, C., Sheth, S. A., Eskandar, E. N. Intra-operative behavioral tasks in awake humans undergoing deep brain stimulation surgery. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Выполнение поведенческие задачи в субъектах с внутричерепных электродов
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.