Method Article

Конфокальной длительной изображений в качестве эффективного метода для Cytocompatibility оценки Стоматологические композиты

DOI:

10.3791/51949

⸱

November 9th, 2014

 ,  ,  , 
1Laboratoire des Multimatériaux et Interfaces, UMR CNRS 5615, Université Lyon1, 2UFR d'Odontologie, Université Lyon1; Service de Consultations et de Traitements Dentaires, Hospices Civils de Lyon, 3UFR d'Odontologie, Université Paris Diderot; Service d'Odontologie, APHP, Hôpital Rothschild

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наиболее изученным аспектом биосовместимости стоматологических композитов является их цитотоксичность 3D CLSM промежуток времени визуализации в сочетании с флуоресцентной количественной сигнала позволяет чувствительную оценку судьбе клеток с течением времени. Используя этот метод может быть эффективным инструментом для оценки cytocompatibility стоматологических композитов.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Общепринято, что в пробирке клеток материалы взаимодействие является полезным критерием в оценке стоматологического материала биосовместимости. Целью данного исследования было использовать 3D CLSM времени визуализации промежуток конфокальной оценить биологическую совместимость в пробирке стоматологических композитов. Этот способ обеспечивает точное и чувствительное индикацию скорости жизнеспособной клетки в контакт с стоматологических композитных экстрактов. ELS дополнительная низкая усадка, зубной композит используется для прямого восстановления, было принято в качестве примера. В пробирке оценка была выполнена на культуре первичных человеческих десневых фибробластов с помощью Live / Dead окрашивание. Изображения были получены с конфокальной биологической перевернутой системе FV10i и проанализированы с FV10-ASW 3.1 Software. Анализ изображений показал очень незначительное цитотоксичность в присутствии тестируемого композита через 5 часов после промежутка времени. Небольшое снижение жизнеспособности клеток было показано в контакт с испытуемой композитного экстракты Comparред с контрольными клетками. Выводы подчеркнул важность использования 3D CLSM времени истечения изображений в качестве чувствительного метода качественно и количественно оценить поведение биосовместимость стоматологических композитов.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одним из основных стандартов, цитируемых в рекомендациях ISO, чтобы определить биологическую совместимость является отсутствие токсичности материала в клетки. Смола на основе зубных композитов может выпустить компоненты из смолистой матрицы, которые могут быть первоначально из-за частичной полимеризации, и / или позже из-за процессов деградации с течением времени 1-4. Эти опубликованные компоненты вступают в контакт с тканями полости рта и может иметь различные недостатки, такие как крапивницы и слизистых реакций, 5 развитии аллергии и аллергических реакций у пациентов, 6 модификаций фибробласты десны морфологии и сокращения по типу белок коллаген I 7, иммуносупрессии или иммуностимуляции на митоген управляемом распространение очищенных Т-лимфоцитов и клеток селезенки 8 и повреждения ДНК в первичных фибробластов человека десны, которая подчеркивает их генотоксического потенциальную 9. Многие параметры могут повлиять зубной композитный токсичности, такие как тени сomposite, свет отверждения, химический состав мономера смолы, наполнитель и степень конверсии 10-13. Поскольку в пробирке токсичные свойства материалов могут предсказать, в естественных условиях ситуаций и можно сравнить с клинических ситуациях по изучению некоторых соответствующих конечных точек. Цитотоксичность стоматологических композитов и их компонентов были широко оценены с использованием культуры клеток системы 14- 16.

Эти системы в пробирке были разработаны с целью оценки дентальных композитов биосовместимость в срок: роста клеток, апоптоз клеток и с использованием ТНР-клеток, такие как 1monocytes 17, цитотоксичность в человеческих фибробластах десен 18, воспалительное потенциал в НаСаТ кератиноцитов как клетки 2, функциональности клеток odontoblast- как МЦОД-23 клеток 19, снижение общего уровня РНК и значительным увеличением индукции апоптоза на десны человека кератиноцитов 20 иПовреждение ДНК на десны и целлюлозно фибробластов 21.

Различные методики предложил исследовать биосовместимость стоматологических композитов. Колориметрические анализы, которые включают специфические красители и легкие измерения адсорбции, остаются наиболее широко используемым, из-за их относительной простотой и низкой стоимостью 22- 26. Анализ микроскопии с помощью световой отличие часто потребляет больше времени и берет на себя более высокие затраты. Тем не менее, эти методы микроскопии имеют несколько важных преимуществ. Наблюдение структуры клеток дает расширенную информацию о опытных токсических эффектов, обеспечивая тем самым более релевантные и конфиденциальных данных. В частности, введение конфокальной микроскопии позволило 27 для наблюдения биологических структур с осевой улучшения разрешения по сравнению с традиционными широко полевых флуоресценции изображений микроскопов. Следовательно, конфокальной изображения стал мощным исследовательским инструментом в различных областяхмедицинские и научные исследования. В отличие от электронных методов микроскопии, сканирующей конфокальной микроскопии дает возможность визуализировать различные компоненты клеток по включению специфических флуоресцентных маркеров. Большинство из этих конкретных индикаторов стабильны в водной среде, разумно измеримы, недорогой и нетоксичный 28, что позволяет использовать их в клинических, так и лабораторных исследований исследований. Кроме того, образец сушки и фиксации требуется для обычного анализа электронной микроскопии не является необходимым для временной промежуток визуализации конфокальной, таким образом, зависит от времени сбора также возможно на образцах. По сравнению с двумерных изображений, конфокальный принцип формирования изображения позволяет образец подповерхностной визуализацию и трехмерную реконструкцию структуре от различных полученных изображений глубины; которые приводят к более точные и более конструктивные детали 29, 30. Данное видео исследование является примером использования трехмерной покадровой Confocal лазерной сканирующей микроскопии (3D-CLSM) в сочетании с Live / Dead флуоресцентной маркировки и сигнала количественного как инновационный метод. Методика представлена ​​в этой работе имеет то преимущество, что позволяет чувствительную оценки и покадровой изображений живых клеток без изменения оцениваемую клеточную структуру. Нет подготовка действий не требуется до конфокальной анализа. Ранее эта же окрашивание используется для оценки жизнеспособности культивируемых губчатой ​​кости ядер 31, но без конфокальной покадровой следующем. Точно такая же процедура покадровой конфокальной была использована для оценки эритромицин время уничтожающие активность бактерий активного ила в зависимости от их типа Грама 32 с помощью специального бактерии Live / Dead окрашивание. Эти методы были недавно адаптированы и использованы для сравнения токсичность стоматологических композитов на основе метакрилата мономеров 11.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол состоит из трех основных этапов: первый этап включает подготовку составного экстракта в культуральной среде; второй касается Первичные человека фибробласты десны (HGF) культуры клеток, контактные клеток с композитных экстрактов и окрашивания клеток; Третий шаг состоит из конфокальной микроскопии и анализа флуоресцентного сигнала. Для тканей десны принимать, протокол был одобрен в соответствии с французским законодательством, информированного согласия и местного этического комитета.

1. Композитный Экстракты Подготовка

Использование модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) в качестве элюирующего среды. Убедитесь, что соотношение между площадью поверхности образцов и объема экстрагирующей среды находится на самом низком уровне требований ISO 10993/12. Процедура недавно описал 11 и изложил вкратце ниже:

  1. Форма сферические образцы неотвержденной зубной композит, используя заказ захватэ. Размер держатель 2 мм в радиусе, который в соответствии с правило, рекомендуется глубины отверждения в полости клинического лечения.
  2. Подготовка планшета, каждый из которых содержит 1 мл культуральной среды (DMEM), с 5% смеси пенициллин / стрептомицин и 1% амфотерицина но без эмбриональной бычьей сыворотки (FBS).
  3. Образцы Cure внутри хорошо, содержащей DMEM среде с использованием светодиодные лампы с 1070 мВт см -2 интенсивности (λ = 465-475 нм) в течение 40 сек. Убедитесь, что расстояние между наконечником и отверждения образцов находится в диапазоне от 0,5 мм. Используйте этот режим отверждения для имитации временный контакт между зубом и неотвержденной стоматологической композита. В клинической ситуации, когда происходит контакт восстановительное композит помещают в полости рта.
  4. Инкубируйте образцы (композиты образцов в DMEM среде) при температуре 37 ° С в увлажненной атмосфере 5% CO 2 в воздухе. Инкубируйте DMEM среде (без композитных образцов) для контрольных клеток в тех же условиях.

2. ФРГ Культура клеток, композитный Экстракты Тестирование и Клетки Окрашивание

  1. Рост и поддержание клеточных культур
    Изолировать человека фибробласты десны от здоровых тканей десны биопсии пациентов, принятых в ходе рутинных ортодонтических экстракции.
    1. Выращивают фибробласты десны человека в среде DMEM в присутствии 10% FBS, 5% пенициллина / стрептомицина и 1% Амфотерицин Б. Поддержание клеток при 37 ° С в инкубаторе в увлажненной атмосфере 5% CO 2 в воздухе.
    2. Изменен средние каждые 3 дня, и прохождение клетки каждые 5 дней. После достижения слияния, урожай клеток трипсинизацией.
    3. Центрифуга клетки при 90 мкг в течение 5 мин и повторно приостанавливать их в культуральной среде. Граф клетку со скипетром карманный автоматизированной счетчика клеток.
    4. Суспензию клеток семян при плотности клеток 2,5 × 10 4 клеток / мл в системе камера слайд. Разрешить инкубацию клеток в течение ночи при 37 ° С в атмосфере 5% в.
  2. Добавление композитных экстрактов к клеткам в культуре
    1. Замените носитель двух скважин камерного горкой на 1 мл тестируемых композитных экстрактов (после 24 ч инкубации).
    2. Поддерживать два оставшихся скважин (контрольные клетки) в тех же условиях.
    3. Инкубируйте камеры слайд, содержащий четыре скважины при 37 ° С в инкубаторе, в соответствии с увлажненной атмосфере 5% CO 2 в воздухе.
  3. Люминесцентная окрашивание
    Используйте Live / Dead цитотоксичности пятно для эукариотических клеток в соответствии с инструкциями изготовителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Комплект обеспечивает быстрый двухцветную флуоресцентный анализ, чтобы определить жизнеспособность клеток в популяции на основе целостности плазмалеммы и эстеразы. Пятно различать живые из поврежденных клеток путем одновременного маркировки с зеленым флуоресцентным-кальцеин-АМ, чтобы указать, внутриклеточная активность эстеразы и красный флуоресцентный-этидий гомодимер-1 (EthD-1), чтобы указать, потерю мембранныхе целостности.
    1. Приготовьте рабочий раствор из двух пятен реагентов, содержащих 2 мкм кальцеина AM и 4 мкм EthD-1 (конечная концентрация сообщается, подходит для окрашивания фибробластов). Добавить пятно на культивируемых адгезивных клеток в присутствии или в отсутствие выбранных составных экстрактов.
    2. Соблюдайте прямое и быстрое окрашенных клеточных популяций по крайней мере 15 минут после окрашивания и через покадровой обработки изображений. Не центрифуги и не фикс окрашенные клетки.

3. конфокальной длительной изображений и анализ сигналов

Система используется оснащен четырьмя диодных лазеров единиц и мульти-окрашенных изображение на срок до четырех флуоресцентных красителей для каждого образца. Система может выполнять отображение изображения (10x), который дает обзор тестового образца, на котором можно двигаться наблюдать область интереса (600x увеличение).

  1. Временной интервал изображения
    1. Поместите секpecimens (камера слайд, содержащий окрашенные образцы) на темной комнате конфокальной интегрированной инкубатора (37 ° C, 5% CO 2 и влажной атмосфере).
    2. Выберите соответствующие лазеры. Используйте два лазерных источников 473 нм (15 МВт) и 559 нм (18 МВт), чтобы возбудить Кальцеин и EthD-1.
    3. Используйте два режим последовательного получать изображения через последовательностей линейных без перекрестных помех при визуализации с двумя использованных красителей флуоресценции.
    4. Используйте детектор с недавно разработанной спектра для автоматической установки условия в соответствии с флуоресцентной краской в ​​блоке сканирования.
    5. Оптимизация полосы пропускания обнаруженного флуоресценции для каждого канала до максимума. Запишите все приобретения последовательно, чтобы избежать возможных кросс-разговор.
    6. Выберите наиболее подходящие условия изображений, основанные на выборе флуоресцентным красителем, используя программное обеспечение сбора.
    7. Приобретайте карты файл, который автоматически создается из центра в виде спирали,с интересующей области было легко выбраны для более детального изучения.
    8. Выберите режим наблюдения. Выберите до пяти типов режимов наблюдения в том числе покадровой, Z-стек, и мульти-зоны, как это необходимо. Использование комбинации Z-стек и режимах покадровой в настоящем исследовании и завершить быстро захвата изображения,
    9. Изменение и переключить флуоресцентный краситель. С другой стороны, накладывать флуоресцентного света и контрастность изображения друг с другом. Соблюдайте живое изображение с помощью выбранной точки на левом нижнем экране карты.
    10. Определить площадь изображения с помощью обрамление и масштабирования функций. При желании, переключаться между дисплеями для каждого типа флуоресценции красителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Микроскоп используется в данном протоколе имеет такую ​​же функциональность как высокой обычной конфокальной в компактном дизайне. Микроскоп оснащен перевернутых целей вода-погружения, которые оптимально подходят для стабильного покадровой съемки живых клеток с упрощенной встроенным инкубатора.
  2. Анализ сигналов и количественное
    1. Используйте для обработки изображений для количественного определения сигнала флуоресценции. Получить пять изображения карт с целью 10X для обоих протестированных образца и клеточной контроля.
    2. Получено 1024 × 1024 пикселов регулярные изображений, с размером 0,231 мкм × 0,231 пикселей мкм. Сохранение изображений в формат Olympus Image (МОФ) для анализа сигналов. Этот формат позволяет хранить различные настройки параметров и изображения вместе. Используйте различные инструменты анализа (измерение профиля интенсивности, коэффициент интенсивности между двумя используемых каналов).
    3. Храните максимальные проекционные изображения как 12 бит / пиксель TIFF файлов.
    4. Заготовка статистического анализа с помощью программного обеспечения командир R. Проанализируйте различия, используя односторонний анализ дисперсии (ANOVA) с периодической проверки. Сообщить приводит как среднее стандартное отклонение (± SD) и статистическую значимость при р <0,05.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 1 показано обзор Live / Dead окрашенных клеток в полученных изображениях карт (10X объективных) как для контроля и клеток, подвергшихся воздействию тестируемых композитных экстрактов (ELS сверхнизкое усадки). Трехмерная структура клеток может быть визуализированы в увеличении 600X. Визуализация клеток, собранных в контрольной камере и из клеток, собранных в камере в присутствии тестируемых экстрактов композитных представлена ​​на Рисунке 2. Максимальная проекция (цель 60X) показывает судьбу выбранных клеточных популяций в начале промежутка времени (на 15 мин) и в конце периода времени градиента (на 5 часов). Были получены Пятьдесят семь стеки изображений (xyzt мод сканирования, 39 изображений на стеков, воксел-глубина 1,00 мкм) в течение этого периода. Небольшое снижение зеленого флуоресцентного сигнала и очень небольшое изменение в красной флуоресцентной были получены в открытых клетках. Никакого значительного различия не наблюдали для контроляклетки. Композитные экстракты подвергаются клетки предполагается аналогичное морфологию шпинделя для контроля клеток; Морфология не было изменено в этих экспериментальных условиях (несмотря на уменьшение сигнала зеленого и красного с увеличением сигнала в присутствии тестируемого композита). Анализ изображений проводился на пяти выбранных разными стеками изображения, соответствующих различных клеточных популяций из полученных изображений для тестируемого композита по сравнению с отрицательными контрольными клетками для обоих зеленого и красного сигнала. Профиль интенсивности окрашенных клеток показан на фиг.3; зеленый и красный сигнал эволюции клеток в контакт с испытуемой композита был сопоставимы с контрольными клетками. Кальцеин и EthD-1 интенсивности флуоресценции измеряли на контрольных клеток и композитных подверженных клеток. Измерение было сделано в один часовыми интервалами до пяти часов. Зеленый / красный соотношение флуоресценции (на основе интегральных интенсивностей зеленой 495-515 нм и красных нм сигналов 620-650) Рассчитывали в период покадровой. Коэффициенты жизнеспособность контроля и открытые клетки в ELS дополнительное низкую усадку экстрактов показаны в состоянии T 1. В присутствии тестируемого композита, было обнаружено, процент живых клеток, чтобы слегка уменьшается от 100% до 93,9% после 1 часа с контакт. Значительная разница наблюдалась между тестируемой композита и отрицательного контроля (клеток без каких-либо составных экстрактов) после 5 часов в указанный период покадровой.

figure-results-1
Рисунок 1: Обзор отображения изображения, показали окрашенных клеток при объективном 10X (а) контрольные клетки и (б) клеток в присутствии композиционных экстрактов (ELS дополнительное низкую усадку) в начале периода времени градиента (Т = 15 мин). Зеленые насаждения являются живые клетки и красные участки повреждены клетки. В этотусловия эксперимента, без изменений (как для зеленой и красной флуоресценции) наблюдался для композитов подвергаются клетки по сравнению с отрицательными контрольными клетками.

figure-results-2
Рисунок 2: CLSM изображения на объективной 60X популяции клеток из (A) управления камерой и (В) составные экстракты камеры в начале и в конце периода экспозиции покадровой (I: 15 мин и II: 5 ч соответственно ). Зеленые насаждения являются живые клетки и красные участки повреждены клетки. Панель изображений продемонстрировали незначительное изменение в интенсивности сигнала (небольшое уменьшение зеленого сигнала и очень незначительное увеличение красного). Нет изменения морфологии клеток не наблюдалось в присутствии композиционных экстрактов; подвергать клетки сохранили свою веретенообразную и фибробластов морфологию, контрольных клеток.


Рисунок 3: Линия профиль клеток, наблюдаемых в покадровой микроскопии () Управляющие клетки (B) Составные экстракты подвергаются клетки, (I) в 15 мин и (II) в 5 ч.. Нет видимых изменение в зеленой эволюции сигнала в присутствии тестируемого композита независимо время контакта. Однако, небольшое увеличение красного сигнала наблюдалось в присутствии композита после 5 ч контакта.

Связаться время (час) Жизнеспособность клеток (%)
1 2 3 4 5
Контрольные клетки 100 100 100 100 100
ELS дополнительная низкая усадка ® 93,9 ± 7 91,3 ± 5 * 89,5 ± 3 * 87,6 ± 2 * 87,7 ± 3 *

Таблица 1:. Курсы живой HGF клеток эволюции после 1, 2, 3, 4 и 5 ч контакта с композитными экстрактов выживаемость клеток анализировали с помощью окрашивания с помощью Live / Dead комплект цитотоксичности. Данные показывают, средние значения ± SD из пяти изображений стеки анализ. Значения значительно отличаются от контрольных клеток при р <0,05.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поведение биосовместимости материала является наиболее необходимым условием параметр, чтобы быть оценены перед медицинского применения. Международные стандарты охватывают медицинских приборов ISO 10993 33 и, в частности стоматологических материалов ISO 7405 34. Отсутствие токсического воздействия на окружающие клетки является ключевым нормой в оценке биосовместимости таких материалов. Именно поэтому цитотоксичность тестирование имеет такое значение в оценке стоматологического материала биосовместимости 35 - 37. ISO предложил методы испытаний могут быть основаны на метаболической активности или целостности мембраны. Отдельные конечные точки должны следовать конкретные условия для ранжирования негативных последствий, вызванных испытательном материала, с тем, чтобы минимизировать время и стоимость анализов оценки. Нынешний метод исследования (3D конфокальной время визуализации промежуток) является целостность мембран на основе. Оценка цитотоксичности через эту конечную точку, кажется, быть ценным маркером клеток biocompaвости с проверенными материалами и это также ISO утвердил конечную точку. В пробирке тесты предназначены для определения того, как образец материала влияет конкретный тип клеток. Колориметрический МТТ-анализ первоначально был описан Mossman (1983) в качестве полезного метода для измерения цитотоксичности в пробирке и пролиферации клеток. Тест МТТ основан на конверсии в соли тетразолия кристаллов формазана активными клетками, определяющего активности митохондрий. Это может быть переведена на жизнеспособность скоростью 38. Гупта и сотрудники сообщили, что тест МТТ является наиболее широко используемым методом для измерения цитотоксичности композитных смол. Сукциндегидразы и щелочные фосфатазы ответы были также использованы для той же цели 39. Тем не менее, судьба клетки не могут последовать, так как МТТ требуется убивая клетки при каждом измерении временной точке. Для того, чтобы более тщательно контролировать поведение окрашенных клеток в данном исследовании, дипрямоугольник наблюдения живых клеток проводили, благодаря промежуток времени CLSM изображений в сочетании с коротким окрашивания протокола, автоматического анализа изображений и флуоресцентной количественной сигнала.

Стоматологические композиты приходят в тесном контакте с тканями полости рта, особенно десен и пульпы клеток. Фибробласты бы мишенью компонентов, выделяющихся из этих восстановительных композитов 40 - 41. Кроме того, несколько исследований выявили, что увековечил элементы и первичные клетки могут иметь различные клеточные ответы в контакте с биоматериалов. Первичные элементы оказались более подходящими для оценки биоматериалов эффекты 42. Это объясняет использование первичных человеческих десневых фибробластов в качестве модели клеточной для оценки цитотоксичности испытуемого стоматологической композита в текущем исследовании. Токсичность потенциал освобожденных веществ из стоматологического композита был широко изучен 43 - 44. Для того чтобы оценить тон цитотоксическое действие материалов, два контакта модели клетки могут быть выполнены. В прямой контакт модельной системе материал помещают непосредственно с клетками-мишенями в то время как в косвенном контакте системы, клеток-мишеней находятся в контакте с элюируется из биологических средах. В клинической практике и для восстановительных процедур, зубной композит помещают в косвенном контакте с тканей десны. По этой причине, в настоящее время экспериментальный протокол было сосредоточено на косвенном контакте с системой фибробласты десны человека (клеток в присутствии тестируемых композитных экстрактов). Как ранее сообщал Даля и сотрудниками, ответы цитотоксичности были ранжированы как тяжелая (<30%), умеренная (30-60%), незначительное (60-90%) или не-цитотоксических (> 90%), на основе деятельности в отношении к значения, полученные для управления 45. Таким образом, в соответствии с этом рейтинге и в свете полученных результатов (таблица 1), композитный ELS дополнительная низкая усадка может быть оценен как веру слегка цитотоксическое и показали сопоставимую поведение с контрольными клетками в течение всего периода времени истечения. Использование в точно такой же метод расследования, результаты этого исследования можно было бы сравнить с теми, о недавно опубликованном исследовании. ELS дополнительная низкая усадка композита продемонстрировали превосходную биосовместимость по сравнению с двумя ранее протестированных композитов, используемых для одной и той же клинического применения, что является прямым восстановление 11. Дальнейшие исследования по-прежнему необходимо установить более полный сравнение.

При определении того, какие цитотоксичности одобрить для конкретной конечной точки оценки, важно понимать, преимущества и недостатки каждого анализа. Основной целью конфокальной микроскопии является достижение 3-D архитектуру клеток и органов. Техника способна выявить не только поверхность образца, но также его недр. Протокол, описанный здесь подчеркивает использование 3D CLSM времени визуализации промежуток конфокальной, как СенсиМетод ный для оценки в пробирке биосовместимость поведение стоматологического композита. Тем не менее, для того, чтобы избежать ограничений, возникающих в этой работе, рабочие станции Антивибрационные могут быть использованы для того, чтобы позволить более стабильный и длительный изображений промежуток времени; настольный могли изолировать используется конфокальной системы от негативного воздействия, что колебания в лаборатории может привести. Кроме того, материалы, используемые в полости рта в идеале должно быть безвредным для тканей десны и не должны содержать вещества, которые могут привести к системной токсичности. В соответствии с методологией, используемой и результатов, полученных от данного исследования можно сделать вывод, что тестируемый композитный (ELS дополнительная низкая усадка) не цитотоксичным в настоящих условиях эксперимента. Поскольку метод CLSM может дать чутко начальную скорость жизнеспособных клеток, другие возможности могут быть предусмотрены для оценки более конечных точек. В частности, как это было недавно сообщила, что композитные мономеры воздействуют на клетки Четух активные формы кислорода (АФК) 46- 48, дальнейшее исследование, необходимые для оценки корреляции если между цитотоксичности сигнализации сетей и АФК. Будущее протокол может быть предназначен для одновременного оценить АФК (H 2 O 2 и / или O 2 - окрашивание) и отношение цитотоксичности (Live / мертвых окрашивание) с помощью времени визуализации промежуток CLSM.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов, им нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Компании Saremco Dental Switzerland и Olympus Microsystems France выражают благодарность за их финансовую поддержку. Компания Saremco Dental также отмечена за щедрое пожертвование стоматологических композитов ELS с экстра низкой усадкой. Авторы также выражают свою признательность доктору Саймону Бэнксу с химического факультета Университетского колледжа Лондона за его помощь в редактировании английского языка.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Olympus Fluoview FV10i Конфокальный микроскопOlympus
O2/CO2 ИнкубаторPnasonicMCO 5MCell Incubation
Live/Dead KitInvitrogen MP 03224Морилка 
ELS сверхнизкая усадка  Саремко Стоматологический композит
DMEM средаSigmaD 6046Культуральная среда
ТрипсинSigmaT1426
камерная система забора клеток   PAA14220040XКультуральная камера
пенициллин/стрептомицинPAAP11-010Клеточная культура
амфотерицин BPAAP11-001Клеточная культура
Фетальная бычья сыворотка PAAA11-101Счетчик клеток клеточных культур
Merck Millipore00110230TP1Подсчет клеток 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Van Landuyt, K. L., et al. How much do resin-based dental materials release? A meta-analytical approach. Dent. Mater. 27 (8), 723-747 (2011).
  2. Moharamzadeh, K., Van Noort, R., Brook, I. M., Scutt, A. M. Cytotoxicity of resin monomers on human gingival fibroblasts and HaCaT keratinocytes. Dent. Mater. 23 (1), 40-44 (2007).
  3. Santerre, J. P., Shajii, L., Leung, B. W. Relation of dental composite formulations to their degradation and the release of hydrolyzed polymeric-resin-derived products. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 12 (2), 136-151 (2001).
  4. Geurtsen, W. Biocompatibility of resin-modified filling materials. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 11 (3), 333-355 (2000).
  5. Hensten-Pettersen, A. Skin and mucosal reactions associated with dental materials. Eur. J. Oral Sci. 106 (2), 707-712 (1998).
  6. Paranjpe, A., Sung, E. C., Cacalano, N. A., Hume, W. R., Jewett, A. N-acetyl cysteine protects pulp cells from resin toxins in vivo. J. Dent. Res. 87 (6), 537-541 (2008).
  7. Falconi, M., Teti, G., Zago, M., Pelotti, S., Breschi, L., Mazzotti, G. Effects of HEMA on type I collagen protein in human gingival fibroblasts. Cell. Biol. Toxicol. 23 (5), 313-322 (2007).
  8. Jontell, M., Hanks, C. T., Bratel, J., Bergenholtz, G. Effects of unpolymerized resin components on the function of accessory cells derived from the rat incisor. 74 (5), 1162-1167 (1995).
  9. Urcan, E., Scherthan, H., Styllou, M., Haertel, U., Hickel, R., Reichl, F. -X. Induction of DNA double-strand breaks in primary gingival fibroblasts by exposure to dental resin composites. Biomaterials. 31 (8), 2010-2014 (2010).
  10. Sigusch, B. W., et al. Resin-composite cytotoxicity varies with shade and irradiance. 28 (3), 312-319 (2012).
  11. Attik, G. N., Pradelle-Plasse, N., Campos, D., Colon, P., Grosgogeat, B. Toxicity Evaluation of Two Dental Composites: Three-Dimensional Confocal Laser Scanning Microscopy Time-Lapse Imaging of Cell Behavior. Microsc. Microanal. 19, 596-607 (2013).
  12. Ausiello, P., et al. Cytotoxicity of dental resin composites: an in vitro evaluation. J. Appl. Toxicol. 33 (6), 451-457 (2011).
  13. Durner, D., Obermaier, J., Draenert, M., Ilie, N. Correlation of the degree of conversion with the amount of elutable substances in nano-hybrid dental composites. Dent. Mat. 28 (11), 1146-1153 (2013).
  14. Sigusch, B. W., Völpel, A., Braun, I., Uhl, A., Jandt, K. D. Influence of different light curing units on the cytotoxicity of various dental composites. Dent. Mater. 23 (11), 1342-1348 (2007).
  15. Knezevic, A., Zeljezic, D., Kopjar, N., Tarle, Z. Influence of curing mode intensities on cell culture cytotoxicity/genotoxicity. Am. J. Dent. 22 (1), 43-48 (2009).
  16. Krifka, S., Seidenader, C., Hiller, K. -A., Schmalz, G., Schweikl, H. Oxidative stress and cytotoxicity generated by dental composites in human pulp cells. Clin. Oral Investig. 16 (1), 215-224 (2012).
  17. Harorli, O. -T., Bayindir, Y. -Z., Altunkaynak, Z., Tatar, A. Cytotoxic effects of TEGDMA on THP-1 cells in vitro. Med. Oral Patol. Oral Cir. Bucal. 14 (9), 489-493 (2009).
  18. Reichl, F. X., et al. Cytotoxicity of dental composite (co)monomers and the amalgam component Hg(2+) in human gingival fibroblasts. Arch. Toxicol. 80 (8), 465-472 (2006).
  19. Aranha, A. M. F., Giro, E. M. A., Hebling, J., Lessa, F. C. R., Costa, C. A. deS. Effects of light-curing time on the cytotoxicity of a restorative composite resin on odontoblast-like cells. J. Appl. Oral Sci. 18 (5), 461-466 (2010).
  20. Schulz, S. D., König, A., Steinberg, T., Tomakidi, P., Hellwig, E., Polydorou, O. Human gingival keratinocyte response to substances eluted from Silorane composite material reveal impact on cell behavior reflected by RNA levels and induction of apoptosis. Dent. Mater. 28 (8), 135-142 (2012).
  21. Tadin, A., Marovic, D., Galic, N., Kovacic, I., Zeljezic, D. Composite-induced toxicity in human gingival and pulp fibroblast cells. Acta Odontol. Scand. 72 (4), 304-311 (2014).
  22. Schweikl, H., Schmalz, G. Toxicity parameters for cytotoxicity testing of dental materials in two different mammalian cell lines. Eur. J. Oral Sci. 104 (3), 292-299 (1996).
  23. Issa, Y., Watts, D. C., Brunton, P. A., Waters, C. M., Duxbury, A. J. Resin composite monomers alter MTT and LDH activity of human gingival fibroblasts in. 20 (1), 12-20 (2004).
  24. Brambilla, E., Gagliani, M., Ionescu, A., Fadini, L., García-Godoy, F. The influence of light-curing time on the bacterial colonization of resin composite surfaces. 25, 1067-1072 (2009).
  25. Modareszadeh, M. R., et al. Cytotoxicity of set polymer nanocomposite resin root-end filling materials. Int. Endod. J. 44, 154-161 (2011).
  26. Tamilselvam, S., Divyanand, M. J., Neelakantan, P. Biocompatibility of a conventional glass ionomer, ceramic reinforced glass ionomer, giomer and resin composite to fibroblasts: in vitro study. J. Clin Pediatr. Dent. 37 (4), 403-406 (2013).
  27. White, J. G., Amos, W. B., Fordham, M. An evaluation of confocal versus conventional imaging of biological structures by fluorescence light microscopy. J. Cell Biol. 105 (1), 41-48 (1987).
  28. Alpino, P. H. P., Pereira, J. C., Svizero, N. R., Rueggeberg, F. A., Pashley, D. H. Use of fluorescent compounds in assessing bonded resin-based restorations: a literature review. J. Dent. 34 (9), 623-634 (2006).
  29. Chen, Y., Liang, C. -P., Liu, Y., Fischer, A. H., Parwani, A. V., Pantanowitz, L. Review of advanced imaging techniques. J. Pathol. Inform. 3, 22(2012).
  30. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced Fluorescence Microscopy Techniques—FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  31. Stoddart, M. J., Furlong, P. I., Simpson, A., Davies, C. M., Richards, R. G. A comparison of non-radioactive methods for assessing viability in ex vivo cultured cancellous bone: technical note. Eur. Cell Mater. 12, 16-25 (2006).
  32. Louvet, J. N., Attik, G., Dumas, D., Potier, O., Pons, M. N. Simultaneous Gram and viability staining on activated sludge exposed to erythromycin: 3D CLSM time-lapse imaging of bacterial disintegration. Int. J. Hyg. Environ. Health. 214 (6), 470-477 (2011).
  33. Dentistry - Preclinical evaluation of biocompatibility of medical devices used in dentistry - Test methods for dental materials. International Standards Organization. , (2009).
  34. Biological evaluation of dental devices. International Standards Organization. , (2009).
  35. Elshahawy, W. M., Watanabe, I., Kramer, P. In vitro cytotoxicity evaluation of elemental ions released from different prosthodontic material. Dent. Mater. 25 (12), 1551-1556 (2009).
  36. Williams, D. F. On the mechanisms of biocompatibility. Biomaterials. 29 (20), 2941-2953 (2008).
  37. Illeperuma, R. P., et al. Immortalized gingival fibroblasts as a cytotoxicity test model for dental materials. J. Mater. Sci. Mater. Med. 23 (3), 753-762 (2012).
  38. Wataha, J. C., Lockwood, P. E., Bouillaguet, S., Noda, M. In vitro biological response to core and flowable dental restorative materials. Dent. Mater. 19 (1), 25-31 (2003).
  39. Ergun, G., Egilmez, F., Yilmaz, S. Effect of reduced exposure times on the cytotoxicity of resin luting cements cured by high-power led. J. Appl. Oral Sci. 19 (3), 286-292 (2011).
  40. Yap, A. U., Han, V. T., Soh, M. S., Siow, K. S. Elution of leachable components from composites after LED and halogen light irradiation. Operative Dentistry. 29 (4), 448-453 (2004).
  41. Lee, S. Y., Greener, E. H., Menis, D. L. Detection of leached moieties from dental composites in fluids stimulating food and. 11 (6), 348-353 (1995).
  42. Anselme, K., Davidson, P., Popa, A. M., Giazzon, M., Liley, M., Ploux, L. The interaction of cells and bacteria with surfaces structured at the nanometre scale. Acta Biomateriala Journa. 6 (10), 3824-3846 (2010).
  43. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  44. Gupta, S. K., Saxena, P., Pant, V. A., Pant, A. B. Release and toxicity of dental resin composite. Toxicol. Int. 19 (3), 225-234 (2012).
  45. Dahl, J. E., Frangou-Polyzois, M. J., Polyzois, G. L. In vitro biocompatibility of denture relining materials. Gerodontology. 23 (1), 17-22 (2006).
  46. Krifka, S., Seidenader, C., Hiller, K. A., Schmalz, G., Schweikl, H. Oxidative stress and cytotoxicity generated by dental composites in human pulp cells. Clin. Oral Investig. 16 (1), 215-224 (2012).
  47. Krifka, S., Spagnuolo, G., Schmalz, G., Schweikl, H. A review of adaptive mechanisms in cell responses towards oxidative stress caused by dental resin monomers. Biomaterials. 34 (19), 4555-4563 (2013).
  48. Chang, M. C., et al. The role of reactive oxygen species and hemeoxygenase-1 expression in the cytotoxicity, cell cycle alteration and apoptosis of dental pulp cells induced by BisGMA. Biomaterials. 31, 8164-8171 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Confocal Time Lapse ImagingDental Composite BiocompatibilityHuman Gingival FibroblastsLive Dead Staining3D CLSM ImagingCytotoxicity AssessmentFluorescent Signal AnalysisCell Viability MeasurementComposite Extract PreparationMaximal Projection Images

Related Articles