Method Article

Экспериментальные и биоинформатика Протокол Секвенирование РНК Анализы ФОТОПЕРИОДИЧЕСКИХ диапаузы в Азиатско тигровый комар, Кусака бело-пёстрый

DOI:

10.3791/51961

⸱

November 30th, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Georgetown University, 2Insect Physiology Lab, EEOB, The Ohio State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA-Seq анализы становятся все более важными для определения молекулярных основ адаптивных признаков у немодельных организмов. В данной статье описывается протокол идентификации дифференциально экспрессируемых генов между комарами Aedes albopictus с диапаузой и без диапаузы, начиная с выращивания комаров и заканчивая секвенированием РНК и биоинформатическим анализом данных РНК-Seq.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фотопериодическая диапауза является важной адаптацией, которая позволяет людям избежать суровых сезонных условий с помощью ряда физиологических изменений, в первую очередь остановки развития и снижения метаболизма. Глобальное профилирование экспрессии генов с помощью РНК-Seq может дать важную информацию о транскрипционных механизмах фотопериодической диапаузы. Азиатский тигровый комар, Aedes albopictus, является выдающимся организмом для изучения транскрипционных основ диапаузы благодаря своей легкости выращивания, легко индуцируемой диапаузе и доступным геномным ресурсам. В данной рукописи представлен общий экспериментальный процесс выявления транскрипционных различий, индуцированных диапаузой, у A. albopictus. Задокументированы методы выращивания, условия, необходимые для индуцирования развития диапаузы и недиапаузы, методы оценки процента диапаузы в популяции, а также извлечение РНК и оценка целостности комаров. Рабочий процесс обработки данных RNA-Seq от секвенаторов Illumina завершается составлением списка дифференциально экспрессируемых генов. Репрезентативные результаты демонстрируют, что этот протокол может быть использован для эффективной идентификации генов, дифференциально регулируемых на уровне транскрипции у A. albopictus из-за фотопериодических различий. С небольшими корректировками этот рабочий процесс может быть легко адаптирован для изучения транскрипционных основ диапаузы или других важных черт жизненного цикла у других комаров.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стремительное развитие технологий секвенирования нового поколения (NGS) предоставляет захватывающие возможности для исследования молекулярных основ широкого спектра генетически сложных экологических адаптаций в широком разнообразии немодельных организмов1–3. Этот подход чрезвычайно эффективен, поскольку он создает основу для популяционных и функциональных геномных исследований организмов с особенно интересной и/или хорошо описанной экологией или эволюционной историей, а также организмов, представляющих практический интерес, таких как сельскохозяйственные вредители и переносчики болезней. Таким образом, технологии NGS ведут к быстрому прогрессу в области экологии и обладают потенциалом для решения таких проблем, как понимание механистических основ биологических реакций на быстрое изменение современного климата4, распространение инвазивных видов5 и взаимодействие хозяина и патогена6,7.

Экстраординарный потенциал технологий NGS для решения фундаментальных и прикладных вопросов экологии и эволюционной биологии отчасти связан с тем, что эти подходы могут быть применены к любому организму по умеренной цене, которая возможна для большинства исследовательских лабораторий. Кроме того, эти подходы позволяют получать информацию в масштабах всего генома без необходимости априорных генетических ресурсов, таких как микрочип или полная последовательность генома. Тем не менее, для максимизации продуктивности экспериментов NGS требуется тщательное рассмотрение плана эксперимента, включая такие вопросы, как сроки развития и тканеспецифичность выборки РНК. Кроме того, технические навыки, необходимые для анализа огромных объемов данных, полученных в ходе этих экспериментов, часто до нескольких сотен миллионов прочтений последовательностей ДНК, были особой проблемой и ограничивали широкое внедрение подходов NGS.

Недавние исследования РНК-Seq транскрипционных основ диапаузы у инвазивного и важного с медицинской точки зрения комара Aedes albopictus представляют собой полезный пример некоторых экспериментальных протоколов, которые могут быть использованы для успешного применения технологии NGS для изучения молекулярных основ сложной экологической адаптации у немодельного организма8–10. A. albopictus является высокоинвазивным видом, который произрастает в Азии, но в последнее время вторгся в Северную Америку, Южную Америку, Европу и Африку11,12. Как и многие насекомые умеренного пояса, умеренные популяции A. albopictus выживают зимой, входя в тип покоя, называемый фотопериодической диапаузой. У A. albopictus воздействие на куколку и взрослых самок короткой (осенней) продолжительности дня приводит к образованию яиц диапаузы, в которых эмбриологическое развитие завершается, но личинка фаратов внутри хориона яйца вступает в задержку развития, что делает яйцо невосприимчивым к стимулу вылупления15–17. Яйца диапаузы более устойчивы к высыханию5,18 и содержат больше общих липидов19, чем яйца без диапаузы. Таким образом, фотопериодическая диапауза у A. albopictus является контролируемой матерью, адаптивной фенотипической пластичностью, которая необходима для выживания в суровых условиях зимы в умеренной среде. Несмотря на хорошо изученное экологическое значение фотопериодической диапаузы у широкого круга насекомых20,21, молекулярная основа этой важнейшей адаптации не очень хорошо описана ни у одного из насекомых22. У таких организмов, как A. albopictus, которые претерпевают эмбриональную диапаузу на стадии личинок фарата, остается особенно сложной задачей понять, как фотопериодический сигнал, полученный матерью, передается потомству и сохраняется в ходе эмбрионального развития, вызывая остановку на стадии личинки фарата.

Этот протокол описывает выращивание комаров, экспериментальный дизайн и биоинформатический анализ для экспериментов NGS (секвенирование транскриптома), выполненных для выяснения транскрипционных компонентов фотопериодической диапаузы у A. albopictus. Этот протокол может быть использован для дополнительных исследований диапаузы у A. albopictus, может быть адаптирован для изучения диапаузы у других близкородственных видов, таких как другие комары aedine, которые подвергаются диапаузе яиц23, а также в более общем плане актуален для использования подходов NGS для изучения транскрипционных основ любой сложной адаптации у любого насекомого.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. личинок Разведение двух А. albopictus Группы во взрослую жизнь

  1. Установите два Фотопериод шкафы с программируемым освещения на 21 ° C для оптимального выражения диапаузы 16 и примерно 80% относительной влажности.
    1. Программа один шкаф для 16L: 8D свет: темно цикл (без диапаузы вызывая LD фотопериод). Установите второй шкаф для 8L: 16D свет: темно цикл (диапаузы вынуждающего) 13.
    2. 'Огни на "программу в то же время в обоих шкафов для синхронизации циркадного времени между фотопериодов.
  2. Рассчитайте количество яиц, необходимых для проведения эксперимента. Стремитесь к 300-500 яиц в клетке. По крайней мере, трех повторных диапаузы клетки и трех повторных без диапаузы клетки необходимы для выработки РНК. Это составляет приблизительно до 1,800-3,000 яиц в эксперименте.
    1. Люк яйца путем погружения яиц бумаги в примерно 500 мл деионизированной H 2 O.
    2. Добавить прибл. 1 мл пищевой суспензия, состоящая из пищи земля собак и креветок, как описано выше 24. Обложка контейнер с сеткой, и держать сетку в месте с резинкой.
    3. Место в LD светового дня шкафу в течение примерно 24 часов.
  3. Передача вылупившихся личинок до 10 х 10 х 2 см чашки Петри, заполненные приблизительно 90 мл деионизированной H 2 O.
    1. Поддерживать около 30 личинок на блюдо. Трансфер личинок чистую посуду каждый 48-72 ч, например, каждый понедельник, среду и пятницу (MWF) 24.
    2. Поток около 1 мл пищевой суспензия, состоящая из пищи земля собак и креветок в деионизированной воде каждый MWF, как описано выше 24.
  4. Настройка 3:57 взрослых клеток для каждой обработки в течение светового дня, где каждый клетка содержит биологическую репликации.
    1. С противоположных сторон 9.5 л ведра, вырезать один 10-By-14 см отверстие, и другое отверстие диаметром 15 см. КомпанияVer первый с сеткой. Сокращение длины одной ноги ортопедического чулок, и приклейте один конец вокруг внутренней другое отверстие.
    2. Отрежьте конец ноги чулок выходные и узлов Шут - открыть только тогда, когда доступ внутрь клетки необходим. Для крышки клетки, вырезать все интерьере, оставив только обод, и заменить внутреннюю пластика с сеткой 24.
    3. Обратите внимание на фотопериод, повторить номер, клетки дату начала и другую информацию, относящуюся к эксперименту с перманентным маркером на стороне клетки.
  5. Линия нижней части взрослых клетках с влажной фильтровальной бумаге. Смочите фильтровальную бумагу с достаточно деионизированной H 2 O, чтобы увеличить местную влажность в клетке, но избежать стоячей воде, которые могут стимулировать яйцекладку на фильтровальной бумаге 24. Проверить фильтровальную бумагу в день в течение сушки, повторно мокрым, когда это необходимо.
  6. Для получения достаточных яйца РНК библиотеке, включают в себя, по меньшей мере 100 женщин / 9,5 л CaGE, с не более, чем 500 комаров в клетке.
  7. Сбор куколки МЧЗ и место в маленькой чашке чистой H 2 O при плотности не более 50 куколок на 25 мл H 2 O. Передача куколки чашку взрослого клетке. Место клеток в соответствующей светового дня кабинета - А. albopictus куколки светочувствительная 15.
  8. Убедитесь в день, что H 2 O в чашках чист и ясен, и удалить мертвые куколки, потому что наращивание мертвой куколки может привести к массовой гибели. Удалить H 2 O чашки после того как все куколки появляются.
  9. Поместите органических изюм на верхнем сетки клетку, чтобы обеспечить сахар для появившихся взрослых. Монитор изюм, и менять их каждые 3-5 дней для предотвращения накопления плесени.

2. Поддержание взрослых Разрешить спаривания и производства яиц

  1. Поддержание клеток при высокой влажности (прибл. 80%), выравнивая дно клетки с влажной фильтровальной бумагой, и обеспечивают доступ к не-плесенью изюма, как описано выше (SectiДополнения 1.5 и 1.9).

3. Кровь грудью

  1. Подготовка к крови кормовых женщин между 5:58 дней после вылупления, чтобы убедиться, что женщины были выставлены, по крайней мере восемь однозначных коротких дней, прежде чем яйцекладка начинается в течение почти 100 яиц% диапаузирующих 14.
  2. Подготовка системы кормления Hemotek мембраны. Подключите кормовых единиц на блок питания. Отрегулируйте температуру каждого блока до 37 ° С, используя регулировочный винт. Использование электронного термометра и зонда для измерения температуры блока питания во время калибровки.
  3. Подготовьте резервуар еды. Протяните квадрат коллаген подачи мембраны над отверстием резервуара еды и закрепите его с уплотнительным кольцом. Осторожно потяните углы, чтобы убрать морщины; обрезать лишний мембрану с ножницами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коллаген мембрана не может хорошо работать для всех видов комаров, и это может быть необходимо попробовать несколько видов, чтобы найти оптимальное мембрану при работе скроме А. видов albopictus. Парафильмом хорошо работает с Комар обыкновенный.
    1. Если кровь хранили замороженной, оттепели при комнатной температуре в течение по крайней мере 1 часа перед использованием.
    2. Держите резервуар так мембрана обращена вниз, без поддержки, и порты наполнении вверх. Использование передачи пипетки или шприца, чтобы заполнить резервуар с приблизительно 3 мл цельной крови от цыплят, который имеет цитрат натрия в качестве антикоагулянта. Печать отверстия для наполнения с пластиковыми заглушками.
  4. Прикрепите подготовленную резервуар для фидера, привинтив его шпильки на теплообменной пластины на нижней части питателя. Обратить подачи и поместите его на верхней части клетки, мембраны стороной вниз, так что комары могут питаться через сетку клетки. Держите устройство подачи на клетке в течение приблизительно 45 мин, чтобы максимизировать кормление.

4. Стимулировать откладки яиц

  1. Четыре-пять дней после еды в крови, оснастить каждую клетку с темного цвета 50 мл сдо выложены небеленой прорастания семян бумаги (бумаги яйцо) или текстурированной небеленый бумажным полотенцем и заполнить наполовину дистиллированной водой 9. Если более чем 250 комаров в клетке, используйте две чашки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для маленьких клетках или одного женского флаконах, "сено настой" в яйцекладки контейнеров может увеличиться откладки яиц из-за запаха микробной флоры 25.

5. Сбор и магазин Яйца

  1. Начать сбор яиц в течение 4-5 дней кормления крови, потому что производство яиц, как правило, пики примерно через пять дней после питания кровью, а затем спадает в течение следующей недели.
  2. Вары яйцо частоту сбора на предметы первой необходимости эксперимента. Для общих целей, собирать яйца документы по установленным расписанием MWF. Удалить из яиц документы из каждой клетки и замените свежим бумаги. Поместите недавно удаленные документы в чашках Петри и хранить в SD в течение светового дня шкафу, чтобы избежать смешанное воздействие хранения яиц.
  3. Разрешить яйцо документы повторно Основной влажными в течение 2 дней после яйцекладки, чтобы образование серозный кутикулы, которая повышает устойчивость яйцо усыхание 26.
  4. Примерно через 48 часов после сбора, сухие яйца на открытом воздухе. Высушите бумагу так, что она является мягким и слегка влажной на ощупь, но не настолько мокрой, что бумага темно от H 2 O или стимулирует вылупления яиц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: "х 4" бумага 6,5 может занять около 3,5 ч для просушки. Будьте осторожны, чтобы не чрезмерно сухой яичный работ, так как это приведет в яичном высыхания 27.
  5. Резервные дополнительные яйца от обоих LD и SD фотопериодов для оценки заболеваемости диапауза и интерпретировать фотопериодическую эффект (см Измерение диапаузы, раздел 6).
  6. Для длительного хранения, держать яйца с докладами на 21 ° C и приблизительно 80% влажности в чашках Петри. Хранить чашки Петри в контейнер для хранения Tupperware с колбу воды для поддержания местной влажности, как эмбриональное развитие происходит 4:56 дней при 21 ° С.
ove_title "> 6. Измерьте диапаузы Заболеваемость

  1. Используйте дополнительные защищены эмбрионы (см Стимулировать откладки яиц, раздел 4), которые 7-20 дней для количественной оценки ответа диапауза.
  2. Запишите количество яиц, находящихся на каждое яйцо бумаги.
  3. Стимулировать яйца вылупиться, полностью погружая отдельные документы яйцо в чашку 90 мл Петри с приблизительно 80 мл деионизированной H 2 O. Добавьте примерно 0,25 мл пищевой кашицы.
  4. После 24 часов подсчитать количество вылупившихся первый личинок возрастной стадии. Поместите чашку Петри на черной поверхности, чтобы визуализировать личинок и поместить источник света на одной стороне тарелки. Личинки будут двигаться от источника света, что позволяет четкого подведения итогов индивидуального личинок. Удаление отдельных личинок с помощью пипетки, считая для предотвращения пересчета индивидуальный личинок.
  5. Место яйцо документы в новом чашку Петри и повторной сухой. Re-люк яйца после ~ 1 недели и снова подсчитать яйца вылупившихся используя данный метод.
  6. Место яйцо бумаги с оставшимся U н-вылупились яйца в новых 90 мл чашки Петри с приблизительно 80 мл отбеливающего раствора 28. Убедитесь, что яйцо документы полностью погружен в отбеливания решения и оставить под вытяжкой в ​​течение ночи, чтобы избежать запаха хлорки.
    Примечание: отбеливающий раствор может храниться в течение ~ 1 недели при 4 ° С, но в противном случае должны быть свежими.
  7. Проверьте яйца с помощью светового микроскопа в качестве отбеливания будет ясно хориона и позволяют визуализировать с эмбрионами, ООН-вылупился яйца. Если яйцо эмбрионов и, яйцо будет иметь совсем белый цвет с глазами появляются как два маленьких черных точек друг напротив друга на спинной стороне. Tally количество не-вылупились, яйцах с эмбрионами 13.
  8. Определить частоту диапауза по следующей формуле:% диапаузы = нет. эмбрионом ООН-вылупившиеся яйца / (нет. вылупившиеся яйца + нет. эмбрионом ООН штриховкой яиц) х 100 13.

7. Экстракция РНК из яиц / pharate личинок

ontent "> Примечание: Используйте Trizol в капюшоне ламинарного потока.

  1. Кисть комаров яйца, содержащие развивающихся эмбрионов или pharate личинок в различных точках времени разработки из яичного работ на стеклянные шлифовальных использованием верблюжьей шерсти. Измельчить яйца в TRIZOL (1 мл на 50-100 мг ткани) до полного измельчают. Используйте по крайней мере 400 яиц в библиотеку, чтобы дать достаточного количества РНК.
    1. Кроме того, оснастки заморозить яйца в жидком азоте и хранили при -80 ° С в микропробирок на срок до месяца перед помолом в TRIZOL.
  2. Выполните извлечение РНК в TRIZOL затем изопропанол осадков в соответствии с инструкциями изготовителя.
  3. Лечить скамейки раствором РНКазы дезактивации или других агентов, чтобы удалить любые остаточные нуклеазы, чтобы избежать деградации РНК.
    1. Лечить извлеченный РНК с ДНКазы. В соответствии с инструкциями производителя, инкубировать образцов РНК с ДНКазы в течение 30 мин при 37 ° С. Используйте 1 & #181; л ДНКазы на срок до 10 мкг РНК в реакции 50 мкл. Увеличение количества ДНКазы, если есть больше, чем 10 мкг РНК в одной реакции.
    2. Деактивированы ДНКазы путем добавления 5 мкл приостановлено ДНКазную инактивации реагента. Инкубируйте 5 минут при комнатной температуре, смешивая три раза в течение инкубационного периода (нежным вортексе).
    3. Центрифуга при 10000 х г в течение 1,5 мин. Передача супернатант, содержащий обработанные образцы РНК свежие пробирки для последующих стадий.
  4. Оценка качества общего образцов РНК флуорометрии. Отправить образцы к специальности объекта с соответствующим инструментом для решения этой задачи. Объект будет выполнять гель-электрофореза на-чипе для определения численности видов РНК в образце, визуализированных флуоресцентным красителем привили в чипе. Результаты будут возвращены как electropherogram.
    1. Определить целостность общего образцов РНК в присутствии или в отсутствие продуктов распада, о чем свидетельствует наличие OF пиков между 18 и 5S рибосомных РНК пики на полученной electropherogram (рис 1b).

8. РНК Секвенирование

  1. Отправить общие образцы РНК с достаточно высоким качеством (рис 1а) и количества (обычно> 3 мкг на библиотеку) к коммерческой секвенирования центра для строительства, обогащенных парно-концевых библиотеках мРНК и мРНК последовательности, следующих стандартных протоколов.
  2. Если более чем одна полоса используется для секвенирования одного эксперимента, разделить отдельные библиотеки в две полосы для секвенирования для учета технического различий между полосами во время секвенирования.

9. lllumina Почитать очистки

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 представлены биоинформатики часть этого протокола. Для получения полного списка всех программ и ресурсов, используемых в разделе биоинформатики этого протокола, обратитесь к таблице 1. ВКроме того, Справочная файла 1 содержит примеры командной строки для каждого из следующих шагов протокола биоинформатики.

  1. Используйте ssaha2 29 (таблица 1), чтобы определить матчи 95% идентичности или выше с базой данных NCBI Univec ядра (Таблица 1), А. albopictus рРНК (GenBank # L22060.1) и секвенирования адаптеры (примеры подробная командной строки, приведенные в Дополнительной файла 1). Удалить прочитанные пары с совпадений с использованием Perl или аналогичного инструмента сценариев, например, путем адаптации при условии Perl скрипт (Справочная файла 2).
  2. Удалите остатки читает с пакетом SolexaQA 30 (Таблица 1; Справочная файла 1): отделка области с PHRED оценка эквиваленте менее 20, используя настройки по умолчанию DynamicTrim.pl.
    1. Удалить читает меньше, чем 25 б.п. с LengthSort.pl на прямом и обратном читает одновременно. Оцените качество очищенных fastq файлов с FastQC (табл 1 ) - в частности, убедиться, что качество по-базовой последовательности и оценки в последовательности качества выше 20.

10. Цифровой Нормализация

  1. Выполните один раунд цифровой нормализации на очищенную читает с помощью инструмента кхмерской 31 (таблица 1; Справочная файла 1), в частности, normalize-by-median.py (с использованием размера K-мерный 20, покрытия отсечку 20 и Х = 1e10).
  2. Кроме того, если машина с высокой памяти доступно (сотни ГБ), используйте normalize_by_kmer_coverage.pl сценарий Троицы (таблица 1).

11. De Novo Транскриптом Ассамблея

  1. Получить доступ к компьютеру или компьютерной кластера с до 256 Гб оперативной памяти и 24 процессоров, в зависимости от размера сборки.
  2. Используйте Троицы 32 (таблице 1; Справочная файла 1), чтобы собрать цифровой нормализованное чтения набор в контигов. Для сниженияиспользование памяти, использовать --min_kmer_cov 2.

12. Ассамблея Оценка

  1. Запустите assemblathon_stats.pl из проекта Assemblathon2 33 на выходе арендуемая Троицы. Этот сценарий выполняет основные вычисления, относящиеся к оценке качества сборки, такие как количество лесов, N50, монтаж композиции и более (табл 1; Справочная файла 1).

13. Аннотация собранного Транскриптом

  1. Выполнение BLASTX (таблица 1) узла с набором ссылка белка; для комаров, дрозофилы, Anopheles gambiae, Комар обыкновенный, и Комар желтолихорадочный подходящие ссылки. В частности, формат файла FastA ссылка белка за взрыв, а затем BLASTX (Справочная файла 1).

14. Карта Читает Ассамблее Использование RSEM 34 (Таблица 1)

  1. Создайте файл 'стенограмма к генной карте », в которомПервый столбец содержит идентификаторы контрольного гена, а вторая колонка арендуемая IDS. В табличном редакторе, поменяйте местами первый и второй столбцы из вывода BLASTX, и писать эти колонки в файл .txt. Используйте программу LineBreak преобразовать разрывы строк в результате .txt файла в формате Unix.
  2. Создайте эталонный набор данных из файла FastA транскрипций, используя rsem-подготовить справочную сценарий, представленную в RSEM пакета (Справочная файла 1).
  3. Рассчитать значения выражения отдельно для каждой библиотеки, используя команду rsem просчитать-выражения, представленную в RSEM пакета (Справочная файла 1). Как гласит, использовать парные fastq файлов, полученный на стадии чтения очистки (этап 9.2).
    1. Если РНК из биологического репликации была разделена на две полосы для секвенирования, включают в себя как fastq файлов в расчете выражения для создания одного файла.
  4. Преобразование результатов выражение из каждой библиотеки к матрице легко обрабатывается другой рrograms с использованием предоставленного сценария rsem генерировать-DATA-матрицу, представленную в RSEM пакета (Справочная файла 1).

15. Дифференциальная Анализ экспрессии

  1. Установите R и обрезки (таблица 1).
  2. Используйте read.delim загрузить результаты RSEM, начиная с шага 14,3 (Справочная файла 1). При необходимости, округлить счетчики до ближайшего целого числа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: руководство обрезки рекомендует ограничить набор данных генов с достаточно высокой экспрессии обнаружить значение.
  3. Чтобы отформатировать данные для обрезки, формирования объекта DGEList из загруженного файла данных (Справочная файла 1). Затем, нормировать данные, используя ТММ нормализацию (Справочная файла 1). Оценить общие и tagwise дисперсии данных (Справочная файла 1).
  4. Определить дифференциально выраженные гены с Benjamini-Hochberg исправить значение р <0,05 (Справочная файла 1). Участок распределение лог-кратным-изменений по сравнению с обилием (Справочная файла 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Флуориметрии из двух репрезентативных образцов РНК показали две полосы примерно 2000 нуклеотидов (1А, В). 28S насекомых рибосомальной РНК состоит из двух полинуклеотидных цепей, удерживаемых вместе водородными связями, которые легко разрушается при кратковременном нагревании или агентов, которые нарушают водородные связи 35. В результате два компонента примерно такого же размера, как рибосомной РНК 18S. Второй образец РНК показали высокие уровни деградации (фиг.1В).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол представляет методы, чтобы обнаружить дифференциально выраженные гены из-за photoperiodically индуцированной диапаузы в А. albopictus. Протокол имеет важное значение в том, что она уникально сочетает в себе комаров воспитание и методы биоинформатики, чтобы сделать все экспериментальные аспекты молекулярной программы физиологии, доступной для начинающих пользователей - в частности для тех, сосредоточив внимание на фотопериодическом ответ диапаузы. Существующие методы, насколько нам известно, не обе...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения 5R21AI081041-02 и Джорджтаунским университетом.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Инкубатор - Модель 818Thermo-Scientific3751120 В
Помещение с контролируемой средойThermax ScientificN/AПомещение с контролируемой средой, построенное по индивидуальным спецификациям компанией Thermax Scientific Products. Более масштабная альтернатива инкубатору. http://thermmax.com/
Cool Люминесцентная лампаPhilips3921834 Вт
Чашка Петри 100 мм x 20 ммFisher08-772-E
Фильтровальная бумага 20,5 смFisher09-803-6J
9,5 л ВедроPlasticanBway Продуктыhttp://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
Утилита Ткань-москитная сетка БелаяJoann10173292http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html
Ортопедические чулкиAlbahealth23650-040Артикул 081420
Органический изюмNewman's OwnUPC: 884284040255
Яйцекладки для яйцекладки (коричневые)Fisher Scientific03-007-52На самом деле продукт представляет собой янтарную бутылку объемом 125 мл, крышку которой мы сняли.
Переработанные бумажные полотенцаседьмого поколения30BPT120
Modular Mates Square Tupperware SetTupperwarehttp://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
Кофемолка для стеклаCorning Incorporated7727-2Эти тканевые мельницы Tenbroeck разбивают яйца и высвобождают РНК в реагент TRI.
Реактив TRISigma AldrichT9424Нанесите 1 мл реагента TRI на 50-100 мг ткани. Осторожно — Этот реагент токсичен.
TURBOAmbion/Life TechnologiesAM1907Этот набор обеспечивает больший выход, чем традиционная обработка ДНКазой с последующей очисткой фенолом/хлороформом, и он проще в использовании.
RNaseZapAmbion/Life TechnologiesAM9782Обильно нанесите на поверхности стола и любое оборудование, которое может контактировать с образцами РНК. Раствор слабощелочной/коррозионный, может вызывать раздражение и вреден при проглатывании.
2100 БиоанализаторAgilent TechnologiesG2939AAРазмещение до 12 образцов РНК на одном чипе.
Мембранный питательHemotek Hemotek 5W1Эта система обеспечивает 5 станций кормления, которые можно использовать одновременно. В комплект входит блок питания PS5 и шнур питания; 5 кормушек FUI + резервуары для шрота и уплотнительные кольца; Пластиковые пробки, коллагеновая питательная мембрана Hemotek; Инструмент для установки температуры; и Инструмент для извлечения пробки. Почтовый адрес компании: ООО «Хемотек»; Блок 5 Союзный суд; Алан Рамсботтом Уэй; Грейт Харвуд; Ланкашир, Великобритания; ВВ6 7ФД; тел.: +44 1254 889 307.
Цифровой термометр и щупHemotek Термометр MT3KFUMicroT3 и щуп KFU. Это используется для установки температуры каждого устройства подачи FUI.
Цельная кровь курицы, нестерильная с цитратом натрияPel-Freez Biologicals33130-1500 мл крови были заморожены и хранились в аликвотах по 20 мл при температуре -80 ° C на срок до 1 года. Перед использованием разморозьте кровь при комнатной температуре не менее чем за 1 час.
без ДНК

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bilyk, K. T., Cheng, C. H. C. Model of gene expression in extreme cold - reference transcriptome for the high-Antarctic cryopelagic notothenioid fish Pagothenia borchgrevinki. BMC Genomics. 14, 634(2013).
  2. Chapman, M. A., Hiscock, S. J., Filatov, D. A. Genomic divergence during speciation driven by adaptation to altitude. Mol. Biol. Evol. 30, 2553-2567 (2013).
  3. Schwarz, D., et al. Sympatric ecological speciation meets pyrosequencing: sampling the transcriptome of the apple maggot Rhagoletis pomonella. BMC Genomics. 10, 633(2009).
  4. Barshis, D. J., et al. Genomic basis for coral resilience to climate change. P. Natl Acad. Sci. USA. 110, 1387-1392 (2013).
  5. Urbanski, J. M., Aruda, A., Armbruster, P. A. A transcriptional element of the diapause program in the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, identified by suppressive subtractive hybridization. J. Insect Physiol. 56, 1147-1154 (2010).
  6. Huang, Y. H., et al. The duck genome and transcriptome provide insight into an avian influenza virus reservoir species. Nat. Genet. 45, 776-783 (2013).
  7. Sessions, O. M., et al. Host cell transcriptome profile during wild-type and attenuated dengue virus infection. PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (3), 2107(2013).
  8. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Deep sequencing reveals complex mechanisms of diapause preparation in the invasive mosquito, Aedes albopictus. P. R. Soc B. 280, (2013).
  9. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Transcriptome sequencing as a platform to elucidate molecular components of the diapause response in Aedes albopictus. Physiol. Entomol. 38, 173-181 (2013).
  10. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Denlinger, D. L., Elsik, C. G., Armbruster, P. A. A de novo transcriptome of the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, to identify candidate transcripts for diapause preparation. BMC Genomics. 12, 619(2011).
  11. Benedict, M. Q., Levine, R. S., Hawley, W. A., Lounibos, L. P. Spread of the tiger: Global risk of invasion by the mosquito Aedes albopictus. Vector-Borne Zoonot. 7, 76-85 (2007).
  12. Lounibos, L. P. Invasions by insect vectors of human disease. Annu. Rev. Entomol. 47, 233-266 (2002).
  13. Urbanski, J. M., et al. Rapid adaptive evolution of photoperiodic response during invasion and range expansion across a climatic gradient. Am. Nat. 179, 490-500 (2012).
  14. Lounibos, L. P., Escher, R. L., Lourenco-de-Oliveria, R. Asymmetric evolution of photoperiodic diapause in temperate and tropical invasive populations of Aedes albopictus (Diptera Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 96, 512-518 (2003).
  15. Mori, A., Oda, T., Wada, Y. Studies on the egg diapause and overwintering of Aedes albopictus in Nagasaki. Trop. Med. 23, 79-90 (1981).
  16. Pumpuni, C. B. Factors influencing photoperiodic control of egg diapause in Aedes albopictus [dissertation]. , (1989).
  17. Wang, R. L. Observations on the influence of photoperiod on egg diapause in Aedes albopictus Skuse. Acta Entomol. Sinica. 15, 75-77 (1966).
  18. Sota, T., Mogi, M. Survival-time and resistance to desiccation of diapause and non-diapause eggs of temperate Aedes (Stegomyia) mosquitoes. Entomol. Exp. Appl. 63, 155-161 (1992).
  19. Reynolds, J. A., Poelchau, M. F., Rahman, Z., Armbruster, P. A., Denlinger, D. L. Transcript profiling reveals mechanisms for lipid conservation during diapause in the mosquito, Aedes albopictus. J. Insect Physiol. 58, 966-973 (2012).
  20. Andrewartha, H. G. Diapause in relation to the ecology of insects. Biol. Rev. 27, 50-107 (1952).
  21. Danks, H. V. Insect Dormancy: An Ecological Perspective. Biological Survey of Canada (Terrestrial Arthropods). , Ottowa, Canada. (1987).
  22. Denlinger, D. L. Regulation of diapause. Ann. Rev. Entomol. 47, 93-122 (2002).
  23. Rev Entomol, A. nn 59, 93-122 (2014).
  24. Armbruster, P. A., Conn, J. E. Geographic variation of larval growth in North American Aedes albopictus (Diptera). Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99, 1234-1243 (2006).
  25. Reiter, P., Amador, M. A., Colon, N. Enhancement of the CDC ovitrap with hay infusions for daily monitoring of Aedes aegypti populations. J. Am. Mosquito Contr. Association. 7 (1), 52(1991).
  26. Rezende, G. L., et al. Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized serosal cuticle. BMC Dev. Biol. 8, 182(2008).
  27. Munstermann, L. Care and maintenance of Aedes mosquito colonies. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors. Crampton, J., Beard, C., C, L. ouis , Springer. Netherlands. 13-20 (1997).
  28. Trpis, M. A new bleaching and decalcifying method for general use in zoology. Can. J. Zoolog. 48, 892-893 (1970).
  29. Ning, Z. M., Cox, A. J., Mullikin, J. C. SSAHA: A fast search method for large DNA databases. Genome Res. 11 (10), 1725-1729 (2001).
  30. Cox, M. P., Peterson, D. A., Biggs, P. J. SolexaQA: At-a-glance quality assessment of Illumina second-generation sequencing data. BMC Bioinformatics. 11, 485(2010).
  31. Brown, C. T., Howe, A., Zhang, Q., Pyrkosz, A. B., Brom, T. H. A reference-free algorithm for computational normalization of shotgun sequencing data [Internet]. , Available at: http://arxiv.org/abs/1203.4802 (2012).
  32. Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nat. Biotechnol. 29 (7), 644-652 (2011).
  33. Bradnam, K. R., et al. Assemblathon 2: evaluating de novo methods of genome assembly in three vertebrate species. GigaScience. 2, 10(2013).
  34. Li, B., Dewey, C. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 12, 323(2011).
  35. White, B. N., De Lucca, F. L. Preparation and analysis of RNA. Analytical Biochemistry of Insects. Turner, R. B. , Elsevier Scientific Publishing Company. Philadelphia, PA. (1977).
  36. Hawley, W. A. The biology of Aedes albopictus. J. Am. Mosq. Contr. Assoc. 4, 1-39 (1988).
  37. Dowling, Z., Ladeau, S. L., Armbruster, P., Biehler, D., Leisnham, P. T. Socioeconomic status affect mosquito (Diptera:Culicidae) larval habitat type availability and infestation level. J. Med Entomol. 50, 764-772 (2013).
  38. Benedict, M. Q. Chapter 2,4,10. Bloodfeeding: Membrane apparatuses and animals. Methods in Anopheles Research. , Malaria Research and Reference Reagent Resource Center(MR4). (2010).
  39. Das, S., Garver, S., Ramirez, J. R., Xi, Z., Dimopolous, G. Protocol for dengue infections in mosquitoes (A. aegypti) and infection phenotype determination. J. Vis. Exp. 5 (220), (2007).
  40. Goff, S. A., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for plant biology. Plant Sci. 2 (34), (2011).
  41. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26, 139-140 (2010).
  42. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2220 (2011).
  43. Goecks, J., et al. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), 86(2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Photoperiodic DiapauseRNA Seq AnalysisAedes AlbopictusDiapause InductionGene Expression ProfilingTranscriptome AssemblyDifferential Expression AnalysisRNA ExtractionIllumina SequencingBioinformatics Workflow

Related Articles