Используя специально разработанный гальванотаксис палаты по изучению направленной миграции из клеток простаты

Summary

Мы представляем метод приложения физиологического электрического поля к мигрирующим, увековеченным клеткам предстательной железы в специально изготовленной камере для гальванотаксиса. Используя этот метод, мы демонстрируем, что 2 линии неопухолеевых клеток предстательной железы демонстрируют разную степень направленности миграции в поле.

Abstract

Физиологический электрическое поле служит специфические биологические функции, такие как направление миграции клеток в развитие эмбриона, нейронов и эпителиальных нарост заживления ран. Применение постоянного тока электрическое поле культивируемых клеток в пробирке индуцирует направленную миграцию клеток, или гальванотаксис. 2-мерный метод гальванотаксис демонстрируется здесь модифицированный заказ поли (винилхлорида) (PVC) камер, поверхность стекла, платиновыми электродами и использования моторизованной стадии, на которой клетки изображаемого. Камеры ПВХ и платиновые электроды обладают низкой цитотоксичности и являются доступными и повторного использования. Поверхность стекла и моторизованный столик микроскопа улучшить качество изображения и позволяют возможные изменения в поверхности стекла и лечения к клеткам. Мы снимали гальванотаксис из двух не онкогенных, SV40-увековечена клеточных линий простаты, PRNS-1-1 и PNT2. Эти два клеточных линий показывает, подобные скорости миграции и, как мигрировать в направлениикатод, но они показывают различную степень направленности в гальванотаксис. Полученные результаты с помощью этого протокола предполагают, что PRNS-1-1 и клеточные линии PNT2 могут иметь различные присущие особенности, которые регулируют их направляющие мигрирующих ответов.

Introduction

Эндогенные электрические поля обнаружены в различных тканях, таких как кожа ^{1, 32, 33} и головного мозга ^2. Физиологический электрическое поле служит специфические биологические функции, в том числе направляющего развития эмбриона ^{3, 4,} направляя разрастание нервных процессов ^{5, 6} и продвижение эпителиальных и закрытие раны роговицы ^{1, 7.} В пробирке, применение постоянного тока электрического поля в культивируемых клетках имитирует физиологическую электрического поля и вызывает направленную миграцию клеток, или гальванотаксис. Гальванотаксис была изучена в фибробластах ^8, рыбные кератиноцитов ^9, человеческого эпителия и роговицы кератиноцитов ^10-12, лимфоциты ^13, нейробласты ^2, и нервных клеток-предшественников ^14. При воздействии приложенного поля, большинство исследованных клеток мигрировать направленно к катодной (-) полюса. Тем не менее, несколько раковых клеток, в том числе высокой метастатическойчеловека клетки рака молочной железы и простаты человека линии раковых клеток РС-3М, перейти к анодной (+) полюса ^{15, 16.} Некоторые механизмы, как предложено в качестве посредника гальванотаксис или объяснить способность клеток ощущать электрическое поле, в том числе активации рецепторов эпидермального фактора роста ^12, эпителиальных натриевых каналов ^17, PI3K и PTEN ^18, и выпуск ионов кальция ^{15, 19.} Механизм еще не полностью изучены, и вполне возможно, что несколько сигнальных путей участвуют в гальванотаксис.

2-мерный метод гальванотаксис демонстрируется здесь полезно характеризовать направленную миграцию адгезивных, подвижных клеток, либо контролировать отдельные миграцию клеток ^{10, 12, 17} или миграцию листе сливающихся клеток ^{18, 20.} Этот метод модифицированной из Пэн и Джаффе ^21, а Нисимура и др. ¹⁰ с на заказ, четких камер ПВХ, со съемным coverslIPS позволяет легко поиска клеток после гальванотаксис для вторичного анализа, такие как томография иммуно-флуоресценции. Стекло поверхность гальванотаксис камер оптико-совместимый, которая позволяет съемку на высоких увеличениях и с флуоресцентно-меченых клеток. Это также позволяет экспериментальную конструкцию с модификацией поверхности стекла, например, изменение поверхностного покрытия или сборы. Распорки из № 1 покровного стекла используются в камерах, чтобы минимизировать ток через клеток; Поэтому джоулева тепла, которое пропорционально квадрату тока, не перегреть клетки в ходе эксперимента. Соединительные агар мосты предотвратить непосредственный контакт электродов с клетками и предотвратить изменение рН среды или концентрации ионов при гальванотаксис.

Два не-онкогенные линии предстательной железы человека клеток были исследованы на их ответ гальванотаксис в данном исследовании. В PRNS-1-1 ²² и PNT2 ²³ оба SV40-иммортализованные, фактор роста-зависимой линии клеток, экспрессирующих эпителиальные маркеры Цитокератин 5, 8, 18 и 19 с низким или вообще без экспрессии простатического специфического антигена (ПСА). Обе клеточные линии поддерживают многоугольную морфологию нормальных эпителиальных клеток, но хромосомных аномалий наблюдался в кариотипированием ^{22, 24.} Несмотря на то, PRNS-1-1 и PNT2 схожие поведения в большинстве экспериментов, они показывают различия в формировании структуры ацинозной и в гальванотаксис. На 3-D матрицы, Matrigel, что PRNS-1-1 клетки образуют полые ацинарные структуры с просветами, напоминающих нормально предстательной железы ткани ^25. Тем не менее, PNT2 клетки образуют твердые сфероидов без просвета или поляризованного эпителия ^26. В PRNS-1-1 клетки также демонстрируют более высокую galvanotactic ответ, чем PNT2 в данном исследовании. Корреляция между образованием структуры ацинозной и гальванотаксис в PRNS-1-1 предположить, что galvanotactic сигналы могут играть определенную роль в организации PRostate железы движения ткани в ответ на эндогенные электрических полей, а также предоставляет дополнительные характеристики для различения этих 2 клеточных линий.

Protocol

1. Культивирование клеток простаты

1. Культура PRNS-1-1 и PNT2 клеток простаты на 100 мм чашки для культивирования в среде RPMI 1640 с добавлением 10% FBS и антибиотиков противогрибкового средства при температуре 37 ° С с 5% СО _2. Обновить питательной среды каждый день до тех пор, пока клетки не достигают 80% слияния для гальванотаксис экспериментов.

2. Сборка гальванотаксис палаты

1. Сборка нижней палаты
   1. Протрите пластиковую гальванотаксис камеру с 2-пропанола. Нанесите герметик Marine Grade кремния вокруг круглых отверстий на нижней стороне камеры с помощью шприца и прикрепите большой покровного стекла (рисунок 1). Используйте обратную сторону ватным аппликатором надавите покровного стекла и протрите излишки клея с ватным тампоном. Круглые отверстия позволяют среда и электрический ток протекать в течение клеток, расположенных между двумя внутренними средних резервуаров.
   2. Вырезать небольшой покровного стекла, чтобы сделать 6 мм х 25 мм проставки с алмазным маркером.
   3. Переверните камеру. Применение 2 полосы кремниевой клеем с помощью шприца и / или металлическим шпателем, чтобы создать 10 мм х 25 мм поверхности канала для прикрепления клеток между 2 круглых отверстий на нижней стекла. Клей 2 кусочков стекла прокладки между 2 круглыми отверстиями. Используйте обратную сторону хлопковых аппликаторов надавите распорки и протрите излишки клея с ватным тампоном и / или зубочисток.
   4. Высушите камеру в течение 24 часов, пока кремния клей не вылечить. Замачивание камеру в дистиллированной воды в течение ночи, чтобы удалить остаток уксусной кислоты из клея. Высушите камеру для немедленного использования, и не храните камеру для последующего использования в чистой емкости.
      
      Рисунок 1: Монтаж нижней гальванотаксис камеры. ) Большое покровного стекла крепится к нижней части чистой камере. B) ТWO осколки стекла прокладок приклеены между 2 круглыми отверстиями, чтобы создать 10 мм х 25 мм канал для клетки для вложения.
2. Сеялки клетки на гальванотаксис камер
   1. Подготовка требует количество гальванотаксис камер, необходимых для эксперимента. Каждая ячейка строки или лечение требует одного гальванотаксис камеру. Протрите гальванотаксис камеры с 2-пропанола. Вымойте камеры стерильными PBS 3 раза и проверьте поток жидкости между 2 круглыми отверстиями в камерах.
   2. Приложить камер в стерильной чашки для культивирования клеток и дать им возможность уравновешивания при 37 ° С в течение 15 мин. Открепления клеток простаты из их культуральной чашке с использованием 5 мл 0,25% трипсина-ЭДТА при 37 ° С в течение 5 мин. Нейтрализовать трипсина-ЭДТА с 5 мл 10% FBS в PBS.
   3. Передача клетки 15 мл пробирки и центрифугировать клетки в течение 5 мин при 200 х г, 37 ° С. Аспирата супернатант и вновь приостановить клеток в 1 мл культуральной среды.
   4. Возьмите 20 μл раствора для загрузки клеток в счетной камере, и подсчитать число клеток. Отрегулируйте концентрацию клеток до 8 х 10 ⁴ клеток / мл культуральной среды.
   5. Возьмите гальванотаксис камеры из 37 ° C инкубатора. Семенной 350 мкл клеточной суспензии на каждой камере.
   6. Инкубируйте клетки в камерах в течение ночи в культуральной чашке с влажным Kimwipe или в камере влажности в инкубаторе при 37 ° С с 5% СО _2.

Рисунок 2:. Посев клеток в камере нижнюю камеру сушат и очищают) клеток предстательной железы трипсином, подсчитаны и переданы в камеру и инкубировали в течение ночи B) сверху покровного стекла крепится к герметизации камеры до съемок...

3. ssembling верхние камеры
   1. Соберите верхнюю камеру до съемок. Микроскоп может разместиться только с изображениями одного гальванотаксис камеру в одно время. Разминка 10 мл культуральной среды на 37 ° С для каждого гальванотаксис камеры. Передача гальванотаксис камеру от инкубаторов в 37 ° C потепления пластины.
   2. Промойте клетки с культуральной среде для удаления одиноких клеток. Оставьте 400 мкл среды в камере. Использование шприца для применения в высоком вакууме смазку поверх обеих стеклянных спейсеров.
   3. Добавьте небольшое покровного стекла, чтобы запечатать камеру. Осторожно надавите на покровного стекла с задней стороны хлопка аппликатора. Протрите излишки среду с ватными тампонами.
   4. Высушите поверхность стекла и применять высокий вакуум смазку, чтобы запечатать разрыв между покровного стекла и камеры. Используйте металлическую лопаточку, чтобы распространить смазку. Добавить 4 мл культуральной среды на внутренних водоемах и проверить поток жидкости между резервуарами.
4. Сделать агармосты
   1. Вырезать пару 2 дюйма длиной ПВХ трубы (503/16 ID х 5/16 OD х 1/16 Wall), переверните и вставьте их в мл стакане 100.
   2. Мера 200 мг бактоагар и добавить его в колбу на 50 мл с 10 мл культуральной среды, чтобы сделать 2% гель агара. Микроволновая печь в течение 30 сек. Загрузите гель агара в пластиковой трубки с передачей пипетки. Оставьте агара мосты при комнатной температуре в течение 10 мин для отверждения агара.
   3. Добавить 2 мл культуральной среды к внешним водоемах гальванотаксис камеры. Вставка агара мосты к внутренней и внешней среды резервуаров проводить ток.

Рисунок 3:. Съемка клеток на камеру-схема для демонстрации окончательную сборку гальванотаксис камеры. Камера полностью изолирована с высокой вакуумной смазки. Средний добавляют тО заполнить резервуары, и два агар мостов вставляются в камеру. Затем гальванотаксис камеры передается на столик микроскопа и электроды присоединены применять электрическое поле. Боковой вид собранного гальванотаксис камере показано, чтобы продемонстрировать, что электрический ток протекает по ячейкам через агар мостов и пространство между покровным стеклом.

3. Покадровый изображений

1. Переключатель на окружающую камеру до 37 ° C с 5% CO ₂ в циркулирующем воздухе 2 ч до обработки изображений.
2. Включите микроскоп и начать программу обработки изображений, эквайринг. Калибровка столик микроскопа и выберите цели в 10 раз.
3. Передача гальванотаксис камеры на столике микроскопа, закрепите камеру с лентой и сосредоточиться на клетки. Вставьте гальванотаксис электроды к внешним резервуаров с катода на правой стороне. Закрепите провод и электроды с лентой.
4. Включите источник бох применять электрическое поле в камере. Измерить выходное напряжение с вольтметром через камеру, чтобы достичь 2,5 вольт для 25 мм длиной камеры (100 мВ / мм). Поддержание напряженности поля во время эксперимента путем регулировки выходного тока.
5. Выберите 10 точек по всей камере снимать в программном обеспечении для создания десять покадровой фильмов. Настройка условий приобретения с интервалами 10-минутных в течение 2 ч.
6. Начало съемок и регулировки выходного тока по мере необходимости.
7. В конце эксперимента, удалить камеру от сцены и зафиксировать клетки с 95% -ным спиртом. Взламывай камеру с лезвием бритвы, чтобы очистить и повторно использовать ее.

4. Количественная оценка гальванотаксис

1. Поворот покадровой фильмы и переориентировать катода к верхней части изображения. Экспорт фильмов в программное обеспечение для отслеживания клеток.
2. Вручную отслеживать (х, у) положение 10-20 клеток в каждой временной точке из каждого фильма (Рисунок 4 A, B).Расстояния миграции и углы по отношению к северо-южном направлении, же ориентация электрического поля, будет рассчитываться в отслеживая клеток программного обеспечения (рис 4C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: средняя скорость миграции преобразуется из общего расстояния миграции и общее время съемок. Направленность преобразуется из углами к значению косинуса. Если клетки мигрируют со случайным направленности, средняя чистой косинус будет близка к нулю. Если клетки мигрируют непосредственно к катоду, значение косинуса будет 1. Если клетки мигрируют непосредственно к аноду, значение косинуса будет -1.

Рисунок 4: Отслеживать сотового измерить направленности) Наложение слежения линий с изображений клеток.. (Х, у) позиций клеток ManuaLLY отслеживаются в покадровой фильмов. . Если клетки мигрируют случайным образом, средний косинус близка к нулю В) Однако, если клетки мигрируют к катоду или аноду, величина среднего косинуса близко к + (катода) или -. (Анод) 1,0 С ) направленность представлена ​​значением косинуса, который превращается из углов миграции (θ). Косинус (θ) равен отношению расстояния (расстояния миграции) в расстоянии Ъ (расстояние проецируется на направление электрического поля).

3. Сохранить измерения. Импорт данных в базе данных приложения для расчета объединенные результаты.
4. Экспорт объединенные данные о средней скорости миграции и среднего значения косинуса в электронную таблицу для построения гистограммы (рисунок 5).

Results

Две линии клеток предстательной железы (PRNS-1-1 и PNT2) были исследованы с помощью этого метода. Клетки обеих линий переноса при подобных скоростью 1,0 +/- 0,3 мкм / мин в течение 2 часов (фиг.5А). Тем не менее, направленность к электрическому полю составляет 0,7 +/- 0,3 для PRNS-1-1 линии, и 0,2 +/- 0,8 для PNT2 линии (фиг.5В). Результаты показывают значительное различие в гальванотаксис этих двух клеточных линий (P <0,01, 100 клетки отслеживать), предполагая, что они имеют различн...

Discussion

Анализ ответ гальванотаксис клетки был важным функциональным показателем для многих клеточных миграционных или ростовых процессов ^{27, 28.} Здесь мы используем заказ камеру со стеклянной поверхностью, чтобы снять два сотовых простаты линий. Эти клеточные линии показали, различные степени гальванотаксис, и мы полагаем, что внутриклеточная локализация или активация гальванотаксис-посредником белков может создавать помехи в процессе генерации бессмертные линии клеток, в результате чего наблюдается различие в ответ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
pRNS-1-1 клетки			Lee, et al. (1994)
PNT2 клетки предстательной железы	Sigma-Aldrich	95012613-1VL	Berthon, et al. (1995)
Medium and solutions
RPMI 1640 medium	Инвитроген	11875-093	прогреть до 37 градусов; C перед применением
Фетальная бычья сыворотка - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	10% в PBS, прогреть до 37 градусов; C перед применением
антибиотика-антимикотика (100x)	Life Technologies	15240	добавить 5 мл к 500 мл среднего
2-пропанола	VWR	BDH1133-5GL
PBS-		-	137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 4,3 мМ Na2HPO4 и 1,5 мМ KH2PO4 в 1000 мл H2 O, pH до 7,4 и автоклавированные, прогретые до 37 °°; С перед применением
0,25% Трипсин-ЭДТА	Инвитроген	25200-056	прогреть до 37 градусов; С перед применением обрабатывать клетки в течение 3-5 мин при температуре 37 °°С; C
Galvanotaxis device
Galvanotaxis камеры	Precision Plastics Inc, CA		Специально разработанные (1/4" x 2" x 3,5"), нетоксичные, прозрачные камеры из ПВХ. Пожалуйста, свяжитесь с авторами для уточнения технического задания.
Электроды Galvanotaxis	UCD электрический магазин		платиновые спиральные электроды с гибкими шнурами
Galvanotaxis Power box	Substrate Engineering, CA		специально разработанный выход постоянного тока с вольтметром
Защитное стекло микроскопа, большой, 45 x 50 мм, No 1,5	Fisher	12-544-F
Крышка микроскопа, маленький, 25 x 25 мм, No 1	ThermoScientific	3307
Алмазный точечный маркер	ThermoScientific	750
Морской силиконовый герметик, прозрачный	3M	051135-08019
Высоковакуумная смазка	Dow Corning	2021846-0807
6 мл шприц	Fisher Scientific	05-561-64
Nichiryo Шприц, 1,5 мл	Nichiryo	SG-M
Ватные аппликаторы	Медицинские изделия Purtian	806-WC
Qtips	Johnson & Трубки из	729389
Nalgene 180	Nalgene	8000-9030	503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall
Bacto-Agar	Difco	0140-01	make 2% агаровый раствор
Бритвенное лезвие	Personna	74-0001
Оборудование и программное обеспечение
Настольная центрифуга	Eppendorf	5810R	работает с ротором A-4-62
Cellometer Auto T4	Nexcelom	Счетные камеры Авто Т4
	Nexcelom	CHT4-SD100-002	загрузки 20 μ l клеточные решения для подсчета
температуры культуры Нагревательная пластина	Bel-Art Scienceware	370150000	для поддержания камеры гальванотаксиса на уровне 37 градусов; С
Микроскоп Eclipse TE-2000 с моторизованным столиком и климатической камерой	Nikon
Plan Fluor 10X/0.30 объектив	Nikon
Retiga EX CCD камера	Qimaging		Охлаждаемая ПЗС-матрица camara, одноцветная, 12-битная
Сжатый воздух с 5% CO2	Airgas		специальный заказ
Volocity 6.3	PerkinElmer		Программное обеспечение для получения изображений
Improvision OpenLab 5.5.2	PerkinElmer		Программное обеспечение для отслеживания клеток и индивидуальное измерение углов миграции
FileMaker Pro Advanced, 8.0	FileMaker
Microsoft Excel 2008 для Mac	Microsoft