Используя специально разработанный гальванотаксис палаты по изучению направленной миграции из клеток простаты

Summary

Мы представляем метод приложения физиологического электрического поля к мигрирующим, увековеченным клеткам предстательной железы в специально изготовленной камере для гальванотаксиса. Используя этот метод, мы демонстрируем, что 2 линии неопухолеевых клеток предстательной железы демонстрируют разную степень направленности миграции в поле.

Abstract

Физиологический электрическое поле служит специфические биологические функции, такие как направление миграции клеток в развитие эмбриона, нейронов и эпителиальных нарост заживления ран. Применение постоянного тока электрическое поле культивируемых клеток в пробирке индуцирует направленную миграцию клеток, или гальванотаксис. 2-мерный метод гальванотаксис демонстрируется здесь модифицированный заказ поли (винилхлорида) (PVC) камер, поверхность стекла, платиновыми электродами и использования моторизованной стадии, на которой клетки изображаемого. Камеры ПВХ и платиновые электроды обладают низкой цитотоксичности и являются доступными и повторного использования. Поверхность стекла и моторизованный столик микроскопа улучшить качество изображения и позволяют возможные изменения в поверхности стекла и лечения к клеткам. Мы снимали гальванотаксис из двух не онкогенных, SV40-увековечена клеточных линий простаты, PRNS-1-1 и PNT2. Эти два клеточных линий показывает, подобные скорости миграции и, как мигрировать в направлениикатод, но они показывают различную степень направленности в гальванотаксис. Полученные результаты с помощью этого протокола предполагают, что PRNS-1-1 и клеточные линии PNT2 могут иметь различные присущие особенности, которые регулируют их направляющие мигрирующих ответов.

Introduction

Эндогенные электрические поля обнаружены в различных тканях, таких как кожа ^{1, 32, 33} и головного мозга ^2. Физиологический электрическое поле служит специфические биологические функции, в том числе направляющего развития эмбриона ^{3, 4,} направляя разрастание нервных процессов ^{5, 6} и продвижение эпителиальных и закрытие раны роговицы ^{1, 7.} В пробирке, применение постоянного тока электрического поля в культивируемых клетках имитирует физиологическую электрического поля и вызывает направленную миграцию клеток, или гальванотаксис. Гальванотаксис была изучена в фибробластах ^8, рыбные кератиноцитов <....

Protocol

1. Культивирование клеток простаты

1. Культура PRNS-1-1 и PNT2 клеток простаты на 100 мм чашки для культивирования в среде RPMI 1640 с добавлением 10% FBS и антибиотиков противогрибкового средства при температуре 37 ° С с 5% СО _2. Обновить питательной среды каждый день до тех пор, пока клетки не достигают 80% слияния для гальванотаксис экспериментов.

2. Сборка гальванотаксис палаты

1. Сборка нижней палаты
   1. Протрите пластиковую гальванотаксис камеру с 2-пропанола. Нанесите герметик Marine Grade кремния вокруг круглых отверстий на нижней стороне камеры с помощью шприца и прикрепите большой покровного....

Results

Две линии клеток предстательной железы (PRNS-1-1 и PNT2) были исследованы с помощью этого метода. Клетки обеих линий переноса при подобных скоростью 1,0 +/- 0,3 мкм / мин в течение 2 часов (фиг.5А). Тем не менее, направленность к электрическому полю составляет 0,7 +/- 0,3 для PRNS-1-1 линии, и 0,2 +/- 0,8 для PNT2 линии (фиг.5В). Результаты показывают значительное различие в гальванотаксис этих двух клеточных линий (P <0,01, 100 клетки отслеживать), предполагая, что они имеют различн.......

Discussion

Анализ ответ гальванотаксис клетки был важным функциональным показателем для многих клеточных миграционных или ростовых процессов ^{27, 28.} Здесь мы используем заказ камеру со стеклянной поверхностью, чтобы снять два сотовых простаты линий. Эти клеточные линии показали, различные степени гальванотаксис, и мы полагаем, что внутриклеточная локализация или активация гальванотаксис-посредником белков может создавать помехи в процессе генерации бессмертные линии клеток, в результате чего наблюдается различие в ответ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
pRNS-1-1 клетки			Lee, et al. (1994)
PNT2 клетки предстательной железы	Sigma-Aldrich	95012613-1VL	Berthon, et al. (1995)
Medium and solutions
RPMI 1640 medium	Инвитроген	11875-093	прогреть до 37 градусов; C перед применением
Фетальная бычья сыворотка - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	10% в PBS, прогреть до 37 градусов; C перед применением
антибиотика-антимикотика (100x)	Life Technologies	15240	добавить 5 мл к 500 мл среднего
2-пропанола	VWR	BDH1133-5GL
PBS-		-	137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 4,3 мМ Na2HPO4 и 1,5 мМ KH2PO4 в 1000 мл H2 O, pH до 7,4 и автоклавированные, прогретые до 37 °°; С перед применением
0,25% Трипсин-ЭДТА	Инвитроген	25200-056	прогреть до 37 градусов; С перед применением обрабатывать клетки в течение 3-5 мин при температуре 37 °°С; C
Galvanotaxis device
Galvanotaxis камеры	Precision Plastics Inc, CA		Специально разработанные (1/4" x 2" x 3,5"), нетоксичные, прозрачные камеры из ПВХ. Пожалуйста, свяжитесь с авторами для уточнения технического задания.
Электроды Galvanotaxis	UCD электрический магазин		платиновые спиральные электроды с гибкими шнурами
Galvanotaxis Power box	Substrate Engineering, CA		специально разработанный выход постоянного тока с вольтметром
Защитное стекло микроскопа, большой, 45 x 50 мм, No 1,5	Fisher	12-544-F
Крышка микроскопа, маленький, 25 x 25 мм, No 1	ThermoScientific	3307
Алмазный точечный маркер	ThermoScientific	750
Морской силиконовый герметик, прозрачный	3M	051135-08019
Высоковакуумная смазка	Dow Corning	2021846-0807
6 мл шприц	Fisher Scientific	05-561-64
Nichiryo Шприц, 1,5 мл	Nichiryo	SG-M
Ватные аппликаторы	Медицинские изделия Purtian	806-WC
Qtips	Johnson & Трубки из	729389
Nalgene 180	Nalgene	8000-9030	503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall
Bacto-Agar	Difco	0140-01	make 2% агаровый раствор
Бритвенное лезвие	Personna	74-0001
Оборудование и программное обеспечение
Настольная центрифуга	Eppendorf	5810R	работает с ротором A-4-62
Cellometer Auto T4	Nexcelom	Счетные камеры Авто Т4
	Nexcelom	CHT4-SD100-002	загрузки 20 μ l клеточные решения для подсчета
температуры культуры Нагревательная пластина	Bel-Art Scienceware	370150000	для поддержания камеры гальванотаксиса на уровне 37 градусов; С
Микроскоп Eclipse TE-2000 с моторизованным столиком и климатической камерой	Nikon
Plan Fluor 10X/0.30 объектив	Nikon
Retiga EX CCD камера	Qimaging		Охлаждаемая ПЗС-матрица camara, одноцветная, 12-битная
Сжатый воздух с 5% CO2	Airgas		специальный заказ
Volocity 6.3	PerkinElmer		Программное обеспечение для получения изображений
Improvision OpenLab 5.5.2	PerkinElmer		Программное обеспечение для отслеживания клеток и индивидуальное измерение углов миграции
FileMaker Pro Advanced, 8.0	FileMaker
Microsoft Excel 2008 для Mac	Microsoft