Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Подготовка крови культуры Пелле для быстрого идентификации бактерий и чувствительности к антибиотикам

36K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51985

⸱

15 октября 2014 г.

 ,  ,  , 
1Institute of Microbiology, University Hospital Center and University of Lausanne

В этой статье

Краткое содержание

Быстрое бактериальный препарат гранул с положительной культуры крови может быть использована в качестве образца для таких применений, как идентификации по MALDI-TOF, окрашивание по Граму, тестирование чувствительности к антибиотикам и тест на основе ПЦР. Полученные результаты могут быть быстро доведены до врачей, чтобы улучшить результаты лечения больных, страдающих от инфекций кровотока.

Аннотация

Инфекций кровотока и сепсис являются одной из основных причин заболеваемости и смертности. Успешное завершение пациентов, страдающих от бактериемии зависит от быстрой идентификации инфекционного агента, чтобы вести оптимальное лечение антибиотиками. Анализ грамотрицательных пятна от положительной культуры крови может быть проведено быстро и уже существенно повлиять на режим антибиотиками. Тем не менее, точная идентификация возбудителя инфекции по-прежнему требуется, чтобы установить оптимальный целенаправленного лечения. Приведем здесь простой и быстрый бактериальный препарат гранул с положительной культуры крови, которые могут быть использованы в качестве образца в течение нескольких существенных последовательных применений, таких как идентификация по MALDI-TOF MS, тестирование чувствительности к антибиотикам (АСТ) на диск диффузии анализа или автоматизированных систем AST и автоматизированная основе ПЦР диагностическое тестирование. Производительность этих различных идентификационных и АСТ систем, применяемых непосредственно на посев крови бактериальных гранул очень сиMilar к производительности обычно получают из изолированных колоний, выросших на чашках с агаром. По сравнению с традиционными подходами, быстрое приобретение бактериальной гранул значительно снижает время, чтобы сообщать как идентификацию и АСТ. Таким образом, следующие культура положительность крови, идентификация MALDI-TOF может быть сообщено в течение менее 1 ч, тогда как результаты АСТ автоматизированными системами AST или диск диффузии анализов в пределах от 8 до 18 часов, соответственно. Точно так же результаты экспресс ПЦР-анализа могут быть доведены до сведения врачей менее 2 ч после доклада на карбункул. Вместе, эти результаты показывают, что быстрое приготовление питательной крови бактериальный осадок имеет значительное влияние на идентификации и АСТ выполнения заказа и, таким образом, на успешный исход пациентов, страдающих от инфекций кровотока.

Введение

Инфекций кровотока и сепсис у госпитализированных пациентов являются основной причиной заболеваемости и смертности. Таким образом, смертность от инфекций кровотока наблюдается примерно в 14% до 37% госпитализированных пациента и может увеличиться до 35% в отделениях интенсивной терапии пациентов 1-3. Быстрое выявление инфекционного агента является ключевым для руководства оптимальное антимикробной терапии и увеличить успешный исход антимикробной 4,5 терапии. Экспресс-анализ по Граму от положительной культуры крови уже имеет значительное влияние на адаптацию антимикробной терапии 6,7, но точной идентификации инфекционного агента требуется обеспечить лучший адаптированный лечения антибиотиками для пациентов. Например, различные схемы лечения антибиотиками должны быть реализованы следующие бактериемии с энтерококков и стрептококков, которые трудно отличить от окрашивания Грама. Аналогично, идентификация на видовом ЛевEL требуется для обнаружения грамотрицательных энтеробактерий, кодирующий хромосомной AMPC ген, сообщающий повышенную устойчивость к β-лактамы 8.

С положительной культуры крови, обычный диагностический подход является субкультура инфекционного агента на разных чашках с агаром, который требует несколько часов дополнительного инкубационного предварительного идентификации с различными подходами в том числе биохимических тестов, роста на различных селективных средах и автоматизированных систем микробной идентификации. Время результатам обычного диагностического подхода является то, приблизительно от 1 до 3 дней.

Появление технологии матрица-лазерной десорбцией / ионизацией время-пролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF) для быстрой идентификации микроорганизмов предоставил новый инструмент для быстрого выявления микроорганизмов из колоний, выросших на чашках с агаром, но и непосредственно от положительной крови культуры (рис 1) 9-12. Чтэ использование MALDI-TOF для идентификации инфекционного агента из крови значительно сократила время к результатам до нескольких минут, а не часы и дни, требуемых традиционными методами. Как обсуждалось Croxatto соавт. 13, эффективность идентификации MALDI-TOF зависит от различных параметров, в том числе чистоты и количества микроорганизма в. Эти два критерия легко получаются из дискретных колоний, выросших на чашках с агаром, но требует предварительной аналитической лечение бактериального обогащения и очистки от сложных образцов, таких как культура крови, которые содержат несколько клеточных и белковых компонентов, которые могут помешать идентификации MALDI-TOF.

Методы изоляции различных микроорганизмов »от культуры крови были использованы в ряде исследований, включая сапонина или другим способом мягкие моющие средства для бактериального извлечения 9,14, метод сыворотки сепаратора 10, лизиса методы центрифугирования 12 (Рисунок 2) 15. Этот препарат крови культура окатышей также предоставить образец для других прямых последовательных применений, таких как окрашивание Грама, автоматизированные диагностические тесты, основанные на ПЦР, такие как POCT-ПЦР для быстрого обнаружения метициллин-устойчивый Staphyloccocus стафилококк (MRSA) и чувствительности к антибиотикам с автоматизированные системы АСТ и / или дисковыми диффузии анализов на чашках с агаром (Рисунок 3).

В этой работе мы описываем различные шаги для подготовки крови культуры бактерий крупинки, как объясняется Prod'hom соавт. 15 (Рисунок 4). Мы также деписец протоколы для трех основных приложений, которые могут выполняться на культуры крови пеллет: Идентификация по MALDI-TOF 15, идентификационный (ID) и тестирование чувствительности к антибиотикам (АСТ) с автоматизированными системами 16 для энтеробактерий и стафилококков и автоматизированной ПЦР диагностический тест основан на обнаружении MRSA 17.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол был разработан и утвержден следующий процессы исследований и разработок, а также этические правила нашего заведения до начала ее осуществления в качестве обычного инструмента.

1 Подготовка Кровь культуры бактериальный осадок от аммония хлорид эритроцитов-лизирующим процедуры

  1. Получение положительной культуры крови для последующего центрифугирования.
    1. Стерилизовать культуры крови крышку. Добавить 70% этанола на крышке бутылки и записать его.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не выполняйте этот шаг под капотом ламинарного потока.
    2. Перемещение бутылку ламинаре. Собирают 5 мл культуры крови с 20 г шприца.
    3. Добавьте 5 мл культуры крови в 50 мл центрифужную пробирку, содержащую 45 мл стерильной воды (H 2 O) и перемешайте пробу.
  2. Приготовление питательной крови бактериальный осадок центрифугированием лизисом.
    1. Центрифуга образца при 1000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
    2. Ремове супернатант (который содержит в основном H 2 O и клеток крови) с помощью лабораторного вакуумного насоса.
    3. Ресуспендируют гранул в 1 мл самодельного хлорида аммония лизирующих решение (0,15 М NH 4 Cl, 1 мМ КНСО3). Пробивное гранул путем соскабливания и при интенсивном перемешивании трубку и центрифуги образца при 140 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
    4. Удалите супернатант, который в основном содержит эритроцитов мусора.
      1. Если гранулы оставались геморрагический, ресуспендируют осадок в 2 мл стерильной дистиллированной воды и 2 0 дальнейшего лизиса остаточные красные клетки крови и промывать осадок. Центрифуга образца при 140 х г в течение 10 мин при комнатной температуре, и отбросить супернатант.
    5. Ресуспендируют гранул в 200 мкл H 2 O
  3. Субкультура культуры крови на различных селективного и неселективного среде агара.
    1. Собирают 1 мл культуры крови с 20 г шприца.
    2. Привить 1 каплю культуры крови междунаро четыре квадранта на кровяной агар, шоколадный агар, McConkey агара и Schaedler агара.
    3. Инкубировать при 37 ° C в кровяной агар и шоколад агаром в 5% СО 2 атмосферы, агар Мак-Конки в нормальной атмосфере и агаром Schaedler в анаэробных условиях.
    4. Следуйте рост бактерий на различных средах.
    5. Проверьте бактериальной чистоты.

2 Идентификация по MALDI-TOF MS

  1. Прямая идентификация из осадка крови.
    1. Передача 1 мкл осадка крови на MALDI целевой пластины и дайте ему высохнуть на 42 ° C отопительной платформы.
    2. Overlay образца с 1 мкл 70% муравьиной кислоты и дайте ему высохнуть на 42 ° C отопительной платформы.
    3. Наложение образца с 1 мкл MALDI матрицы (насыщенный раствор α-циано-4-гидроксикоричной кислоты в 50% ацетонитрил-2,5% трифторуксусной кислоты) и дать высохнуть на 42 ° C нагрева платформы.
    4. Перейдите к MALДИ-TOF МС анализ с помощью системы MALDI-TOF MS, как описано производителем.
    5. Если счет идентификации является недействительным на видовом уровне (например со счетом <2), выполнить извлечение белка в образце пеллет крови.
  2. Идентификация после экстракции белка из культуральной крови гранул.
    1. Смешать 20 мкл гранул с 1 мл 70% этанола и центрифугируют при 13000 х г в течение 2 мин при комнатной температуре.
    2. Жидкость над осадком сливают и добавляют 25 мкл 70% муравьиной кислоты и 25 мкл 100% ацетонитрила в таблетки. Вихревой энергично ресуспендируют гранул. Ресуспендируют жесткие гранулы, разбивая их вниз с наконечников пипеток до встряхивания.
    3. Центрифуге при 13000 х г в течение 2 мин при комнатной температуре. Передача 1 мкл супернатанта (которые содержат извлеченные белки) на MALDI целевой пластины и дайте ему высохнуть на 42 ° C отопительной платформы. Действуйте, как описано в 2.1.2.

3 Бактериальный IDENTIFication и чувствительности к антибиотикам с помощью автоматизированной системы микробной

  1. Приготовление бактериальной суспензии для идентификации бактерий и АСТ с автоматизированной системой микробного.
    1. Подготовить пластмассовую трубку, содержащую 3 мл стерильного 0,45% раствора NaCl, совместимого с автоматизированной системой микробного.
    2. Добавить достаточный объем питательной крови гранул в 0,45% растворе NaCl, чтобы получить бактериальной суспензии, соответствующей мутности McFarland 0,6 до 0,8. Измерьте мутности с помощью денситометра машину.
      Примечание: объем культуральной крови бактериальный осадок варьирует от 50 до 200 мкл для достижения мутности McFarland 0,6 до 0,8.
  2. Привить автоматизированные грамположительных (GP) или грамотрицательных (GN) карты для идентификации и автоматизированные AST карты для тестирования антимикробной восприимчивости грамположительных кокков и грамотрицательных бактерий, как описано производителем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Identificatioн с терапевтом или GN карт не применяется, если MALDI-TOF MS идентификация оценка значение> 2. Проверьте чистоту бактериальной суспензии путем пересева бактериальной суспензии на кровяной агар (GP и GN) и MacConkey агар (GN) пластин.

4 чувствительности к антибиотикам по диффузии диска Пробирной

Диск диффузии анализ описан Европейским комитетом по антимикробной восприимчивости (EUCAST, Версия 3.0, апрель 2013, www.eucast.org).

  1. Приготовление бактериальной суспензии для выполнения антимикробной чувствительности диском диффузии анализа.
    1. Приготовьте стеклянную трубку, содержащую 3 мл стерильного 0,9% раствора NaCl.
    2. Добавить достаточный объем питательной крови гранул в 0,9% растворе NaCl, чтобы получить бактериальной суспензии, соответствующий McFarland мутности 0,5. Измерьте мутности с помощью денситометра машину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем культуры кровиБактериальный осадок варьирует от 50 до 200 мкл для достижения мутности McFarland 0,6 до 0,8.
    3. Vortex бактериальной суспензии.
  2. Прививка бактериальной суспензии на Мюллера-Хинтона агар (MH) или Мюллера-Хинтона агар-агар требовательный организмов (MHF) (МН с добавлением 5% дефибринированной лошадиной крови, и 20 мг / л β-никотинамид-аденин-динуклеотид).
    1. Dip стерильного ватного тампона в бактериальной суспензии и осторожно удалить лишнюю жидкость, вращая тампон на внутренней стенке стеклянной трубки.
    2. Распространение бактериальной суспензии равномерно на всей поверхности агаровой пластины MH / минимального теплового потока моечные в трех направлениях, или с помощью автоматизированного пластины ротатор.
  3. Применение противомикробных дисков на привитых пластин агара.
    1. Применение внимательно диски на поверхности высушенных инокулированных чашках с агаром вручную или с помощью диска восприимчивость дозатор.
    2. Инкубировать на соответствующем Температура и атмосфера, как описано в тестирования антимикробной восприимчивости методом EUCAST диффузии диска (Версия 3.0, апрель 2013, www.eucast.org).

5 Автоматизированная основе ПЦР диагностической проверки для обнаружения MRSA

  1. Использование микропипетки, передать 50 мкл культуральной крови гранул во флакон реагента образца, снабженного MRSA автоматизированной ПЦР-диагностики на основе тест-комплект и вихрь в течение 20 сек.
  2. Использование 1 мл микропипетки, обойтись образец в образце порт картриджа. Вставьте картридж в автоматизированной системе ПЦР и начать испытание, как описано производителем.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В исследовании, проведенном Prod'hom соавт. 15, бактериальные осадки, полученные хлорида аммония для лизиса центрифугирования 122 положительной культуры крови от 78 пациентов были проанализированы с помощью MALDI-TOF MS. Из 122 положительных культуры крови, 95 (77,9%) были правильно определены на уровне видов и одного (0,8%) на уровне рода. Остальные 26 (21,3%) культуры крови гранулы не дал надежную идентификацию по MALDI-TOF. Среди тех, 21 были грамположительных бактерий, включая 13 стрептококков и ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

По сравнению с обычными положительной культуры крови диагностических подходов, быстрое приобретение бактериальной гранулы с помощью аммония хлорида лизиса центрифугирования подход сократить время, чтобы сообщать идентификацию на 16 до 24 часов, и время, чтобы сообщить AST на 24 до 48 часов (рисунки 1 и 3).

Быстрое внедрение соответствующей антибиотикотерапии имеет решающее значение для улучшения результатов пациентов, страдающих от инфекций кровотока. Таким образом, раннее в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Благодарности

Мы благодарим техников бактериологической лаборатории Университетского больничного центра Лозанны за помощь в реализации методы в лаборатории.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Игла 20 гTerumo, Лёвен, БельгияNN-2038R
50 мл Falcon tubeBD, Franklin Lakes, NJ, США35207050 мл центрифужные пробирки
Хлорур аммонияMerck, Дармштадт, Германия101145
Гидрокарбонат калияFluka, Сент-Луис, Миссури, США 60340
Муравьиная кислотаSigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США F0507Легковоспламеняющаяся, коррозионная
α-Циано-4-гидроксикоричная кислотаФлюка, Сент-Луис, Миссури, США 70990Острая токсичность
ацетонитриласигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури, США 271004Легковоспламеняющаяся, острая токсичность
трифторуксусная кислотаSigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США T6508Коррозионная, острая токсичность
Vitek 2 60 instrumentBiomé rieux, Marcy-l'Etoile, France27202автоматизированная микробная система прибор
Vitek 2 грамположительная (GP) картаBiomé rieux, Marcy-l'Etoile, France21342автоматизированная GP  идентификационная карта
Vitek 2 AST-P580 cardBiomé rieux, Marcy-l'Etoile, France22233автоматизированная микробная система AST
Vitek 2 Gram-negative (GN) cardBiomé rieux, Marcy-l'Etoile, France21341автоматизированная идентификационная карта GN 
Vitek 2 AST-N242 картаBiomé rieux, Марси-л'Этуаль, Франция413391автоматизированная микробная система AST
Xpert MRSACepheid, Саннивейл, Калифорния, США  GXMRSA-100N-10технология амплификации нуклеиновых кислот MRSA
GeneXpert IV инструментCepheid, Саннивейл, Калифорния, СШАGXIV-4-Dтехнология амплификации нуклеиновых кислот
инструмент Microflex LT MALDI-TOF MS прибор BrukerDaltonics, Бремен, ГерманияBDAL microflex LT/SH
MSP 96 мишень сталь BCBruker Daltonics, Бремен, Германия280799мишенная пластина MALDI
Денситометр Densicheck приборBiomé rieux, Marcy-l'Etoile, France27208
MALDI Sepsityper kit 50Bruker Daltonics, Бремен, Германия8270170
Mac Conkey agarBiolife, Milano, Italy4016702
агар Mueller-HintonOxoid, Hampshire, EnglandCM0337Mueller-Hinton agar (MH) 
МГЧ агарбиом; rieux, Marcy-l'Etoile, France43901Агар Мюллера-Хинтона - привередливые организмы агар (MHF)
BD columbia III агарBD, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США254071кровяной агар
BD шоколадный агар BD, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США254089шоколадный агар
BD schaedler agarBD, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США 254084Schaedler agar

Ссылки

  1. Alberti, C., et al. Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentre cohort study. Intensive care medicine. 28, 108-121 (2002).
  2. Angus, D. C., et al. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Critical care medicine. 29, 1303-1310 (2001).
  3. Vincent, J. L., et al. Sepsis in European intensive care units results of the SOAP study. Critical care medicine. 34, 344-353 (2006).
  4. Micek, S. T., et al. Empiric combination antibiotic therapy is associated with improved outcome against sepsis due to Gram-negative bacteria a retrospective analysis. Antimicrob Agents Chemother. 54, 1742-1748 (2010).
  5. Seifert, H. The clinical importance of microbiological findings in the diagnosis and management of bloodstream infections. Clin Infect Dis. 48, S238-S245 (2009).
  6. Barenfanger, J., et al. Decreased mortality associated with prompt Gram staining of blood cultures. American journal of clinical pathology. 130, 870-876 (2008).
  7. Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J Clin Microbiol. 41, 495-497 (2003).
  8. Clerc, O., et al. Impact of matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry on the clinical management of patients with Gram-negative bacteremia a prospective observational study. Clin Infect Dis. 56, 1101-1107 (2013).
  9. Meex, C., et al. Direct identification of bacteria from BacT/ALERT anaerobic positive blood cultures by MALDI-TOF MS MALDI Sepsityper kit versus an in-house saponin method for bacterial extraction. Journal of medical microbiology. 61, 1511-1516 (2012).
  10. Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16, 1631-1638 (2010).
  11. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49, 543-551 (2009).
  12. Stevenson, L. G., Drake, S. K., Murray, P. R. Rapid identification of bacteria in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 48, 444-447 (2010).
  13. Croxatto, A., Prod&34hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol Rev. 36, 380-407 (2012).
  14. Chen, J. H., et al. Direct bacterial identification in positive blood cultures by use of two commercial matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry systems. J Clin Microbiol. 51, 1733-1739 (2013).
  15. Prod&34hom, G., Bizzini, A., Durussel, C., Bille, J., Greub, G. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for direct bacterial identification from positive blood culture pellets. J Clin Microbiol. 48, 1481-1483 (2010).
  16. Prod&34hom, G., Durussel, C., Greub, G. A simple blood-culture bacterial pellet preparation for faster accurate direct bacterial identification and antibiotic susceptibility testing with the VITEK 2 system. Journal of medical microbiology. 62, 773-777 (2013).
  17. Clerc, O., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry and PCR-based rapid diagnosis of Staphylococcus aureus bacteraemia. Clin Microbiol Infect. , (2013).
  18. Martiny, D., et al. Impact of rapid microbial identification directly from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry on patient management. Clin Microbiol Infect. 19, E568-E581 (2013).
  19. Stoneking, L. R., et al. Would earlier microbe identification alter antibiotic therapy in bacteremic emergency department patients. The Journal of emergency medicine. 44, 1-8 (2013).
  20. Nordmann, P., Dortet, L., Poirel, L. Rapid detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 50, 3016-3022 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

МАЛДИ-TOF масс-спектрометрияметод диффузии в агаравтоматизированный ПЦР-тестлизис хлоридом аммонияпротокол центрифугированиямутность по МакФарландуокрашивание по Граму
Подготовка крови культуры Пелле для быстрого идентификации бактерий и чувствительности к антибиотикам
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.