Методическая статья

Конформационный Оценка ВИЧ-1 тримерных гликопротеинов с помощью мобильного основе ELISA Пробирной

DOI:

10.3791/51995

⸱

14 сентября 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre de recherche du CHUM, Department of Microbiology, Infectiology and Immunology, Université de Montréal

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Понимание конформаций вирусных поверхностных антигенов требуется для оценки нейтрализации антител и разработки эффективных иммуногенов вакцин. В данной работе мы описываем клеточный ИФА-анализ, который позволяет изучать распознавание тримерных ВИЧ-1 Env, экспрессируемых на поверхности трансфицированных клеток, специфическими антителами против Env.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ВИЧ-1 гликопротеины оболочки (Env) опосредуют проникновение вируса в клетки-мишени и играют важную роль в инфекционном цикле. Понимание того, как эти гликопротеины способны подпитывать процесс синтеза через их конформационные изменения, может привести к разработке лучших, более эффективных иммуногенов для стратегий вакцинации. В данной работе мы описываем клеточный ИФА-анализ, позволяющий изучить распознавание тримерного ВИЧ-1 Env моноклональными антителами. После экспрессии тримерного Env ВИЧ-1 на поверхности трансфицированных клеток конформационные специфические антитела к Env инкубируются с клетками. Затем для обнаружения связанных антител используют вторичное антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена, и простую реакцию хемилюминесценции. Эта система обладает высокой гибкостью и может обнаруживать конформационные изменения Env, индуцированные растворимыми CD4 или клеточными белками. Для этого требуется минимальное количество материала и не требуется узкоспециализированное оборудование или ноу-хау. Таким образом, этот метод может быть использован для скрининга антигенов и антител со средней и высокой пропускной способностью, таких как вновь выделенные антитела.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вирус иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) запись, при посредничестве тримерных вирусных гликопротеинами оболочки (ENV) является первым шагом инфекционного цикла. Будучи единственным подвергается вирусный антиген, представленный на поверхности вирионов, окр тример вызывает нейтрализации и nonneutralizing антитела. Как таковая, она представляет собой интересный кандидат на дизайн вакцина иммуногена. Тем не менее, испытания вакцинации с Env в растворимых или рекомбинантных форм были получены ответы лишь с минимальным эффективности против самых первичной ВИЧ-1 изолятов 1-3. Тем не менее, частичное эффективность наблюдается в возобновление интереса к ВИЧ-1 Env качестве кандидата иммуногена испытание вакцины RV144 4. Это было подтверждено результатами недавнего исследования, описывающего, что вакцин вызвали анти-Env антитела были достаточно для создания определенную степень защиты от SIV и ВИЧ бросает вызов 5.

После синтезированного в эндоплазматической сети, в glycoprote Envв предшественника, gp160, подвергается различным пост-трансляционных модификаций, которые имеют решающее значение для способности к топливу вирусную процесс сварки. Конверты предшественник должен сложить правильно и юрист тримеров перед расщепляется на его экстра-цитоплазматических gp120 и трансмембранный gp41 субъединиц 6-10, с нековалентных взаимодействий, поддерживая связь gp120-gp41. Инфицированная клетка техника также несет ответственность за сильно гликозилирующих Env, включающий около 50% от общей массы 11,12. В результате сложная структура позволяет окружающая среда, чтобы быть конформационно гибкой 13,14, обеспечивая при этом метастабильность, что, как полагают, позволит Конверты для адаптации и скрыть определенные высоко иммуногенные эпитопы, которые иначе могут быть доступны 15-19, подчеркнув важность, чтобы лучше понять различные конформации отбираются посредством родного Env тримера.

На сегодняшний день, несколько методов были разработаны и успешно используются для изучения Env конформационную глфланцев. Тем не менее, они различаются по их ограничений, которые часто ограничиваются конкретным условиям окр. Например, поверхностный плазмонный резонанс или иммунопреципитации с использованием конформационных специфических моноклональных антител (моноклональные антитела), опираются либо на мономерных растворимых или растворенных молекул Env, которые, как известно, иммуногенетически отличается от их тримерных форм 20,21. Недавние исследования также показывают, что расщепление влияет Env конформации в результате в экспозиции эпитопов в основном, признанных nonneutralizing антитела 14,22,23.

Здесь мы подробно описать метод, который позволяет для быстрого и легкого определения конформации клеточно-выразил Env тримеров 18,24-26. После кратковременной трансфекции в Env в линии клеток человека адгезивного связывания ENV-специфических антител обнаруживается с помощью простой реакции хемилюминесценции. Этот метод также может быть использован для описания конформационной предпочтение конформации-висимостьдент антитела. Таким образом, этот препарат обеспечивает надежную и очень гибкий метод обнаружения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 день 1 - Культура клеток

  1. Plate 2 х 10 4 человек остеосаркома (ХОС) клеток на лунку в непрозрачном, культивирования клеток 96-луночного планшета, подходящего для люминесценции чтения. Использование Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% бычьей эмбриональной сыворотки (FBS) и 100 ед / мл пенициллина-стрептомицина. Инкубируйте до следующего дня при 37 ° С, 5% СО 2.

2 День 2 - полиэтиленимина (PEI) Трансфекцию

  1. Готовят смесь для трансфекции в соответствии с последующих стадий. Регулировка реагентов и количества ДНК в зависимости от количества скважин, которые должны быть трансфицированы с тем же Env.
  2. Tube: Добавить 10 нг Тат-кодирования плазмиды (например, ПАТ-III 27) и 150 нг Конверты-кодирования плазмиды в 5 мкл DMEM, дополненной 25 мМ HEPES.
  3. Тат-кодирование плазмиды требуется только при использовании Тат-зависит окружающая среда-кодирующих такие плазмиды, как pSVIII.
  4. Трубка B: Добавить 450 нг PEI (от 1мкг / мкл раствор) в 5 мкл DMEM.
  5. Добавить содержимое трубки B для трубы А. Тщательно перемешать встряхиванием в течение 10 сек и инкубировать смесь для трансфекции 10 мин при комнатной температуре (22 ° C).
  6. Добавить 10 мкл трансфекции смеси в лунку 96-луночного планшета. Инкубируют в течение 48 ч при 37 ° С, 5% СО 2.

3 День 4 - ИФА

  1. Выполните все эксперименты при комнатной температуре, чтобы минимизировать возможное эндоцитоз ENV / антитела комплексов.
  2. Подготовьте 250 мл промывочного буфера на пластине используется в то же время. Промывочного буфера составляет 1x Трис-буферный солевой раствор (TBS), рН 7,5 (50 мМ Трис-Cl, рН 7,5; 150 мМ NaCl) с добавлением 1 мМ MgCl 2 и 1,8 мМ CaCl 2.
  3. Подготовьте 125 мл блокирующего буфера на плите, добавив 1% обезжиренное сухое молоко и 5 мМ Трис рН 8,0 к промывочным буфером.
  4. Удалить среды для культивирования клеток и трансфекции смеси (супернатанта) от 96-луночного планшета.
  5. Добавить 100 μ; Л блокирующего буфера в каждую лунку и инкубируют 20 мин при комнатной температуре.
  6. Удалить супернатант и добавить 50 мкл антитела (или сыворотки) на лунку, разбавленного до соответствующей концентрации в блокирующем буфере. Как правило, используют в концентрации 1 мкг / мл. Выдержите 1 час при комнатной температуре.
  7. Вымойте 3x с 100 мкл блокирующего буфера, а затем повторить процесс стирки 3x с 100 мкл промывочным буфером.
  8. Удалить супернатант, добавьте 100 мкл блокирующего буфера, и инкубируют 5 мин при комнатной температуре.
  9. Удалить супернатант и добавить 50 мкл вторичного антитела, разбавленного 1/3000 в блокирующем буфере. Вары разбавление оптимальное антител в соответствии с различиями производителя. Инкубировать 40 мин при комнатной температуре.
  10. Вымойте 3x с 100 мкл блокирующего буфера, а затем повторить процесс стирки 3x с 100 мкл промывочным буфером.

4 сбора данных

  1. Удалить супернатант от пластины и добавить 30 мкл 1х усиленной хемилюминесценции (ECL) субстрата на лунку.
  2. Приобретать химiluminescence сигнал в течение 1 сек / хорошо на подходит пластина-читатель соответствии с инструкциями производителя. Чтение время может отличаться в зависимости от аппаратных различий.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В соответствии с общей процедурой, описанной выше, протокол адаптирован для анализа воздействие растворимого CD4 (sCD4) и совместной экспрессии CD4 клеточной на экспозиции CD4i эпитопов по обе дикого типа (WT) или мутантного Env, как описано выше 18,24, 25,28. 1 схематически представляет общий порядок и экспозицию CD4i эпитопов после лечения sCD4 или по коэкспрессии сотовой CD4 18. На рисунке 2, мы использовали sCD4 чтобы побудить Env конформационные изменения, кот...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот анализ оптимизирован для обнаружения взаимодействие конкретных моноклональных антител ВИЧ-1 тримерного Env экспрессируется на поверхности клетки. После того, как протокол был создан, он может быть использован в среде с высокой производительностью с низким общим материальных затрат и небольших количеств антител. Так как этот анализ на основе трансфекции, он может быть легко адаптирована для совместной экспрессии клеточных белков, таких как CD4, чтобы изучить их влияние на конформацию Env.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют никакого конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим д-р Джеймс Робинсон за его щедрый дар A32, 17b, 48d, и C11 МКА. ПГТ 121 был получен посредством Программы NIH СПИДа реагента, Отдел СПИДа, NIAID, NIH (Cat # 12343). Эта работа была поддержана Канада фонда инновационного лидера Программа # 29866, на CIHR операционной # 257792, по FRQS создании Young Scientist предоставить # 24639 к AF и по CRCHUM континуума гранта, а также с помощью CIHR катализатора гранта # 126630 на АФ ​​и MR. AF является получателем FRSQ Chercheur Boursier юниоров 1 стипендий # 24639. М.В. поддержали CIHR Диссертационные исследования Award # 291485.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
HOS клеткиATCCCRL-1543
Белая непрозрачная тканевая культуральная тарелка, 96-луночная, плоское дноBD353296
полиэтиленимин, линейная, 25 000 МВтPolysciences23966Приготовлено в растворе 1 мг/мл
модифицированной орлиной среды Дульбекко (DMEM)Invitrogen11995
Козий античеловеческий IgG, пероксидаза конъюгированнаяPierce31413
Улучшенная хемилюминесцентная подложкаPerkinElmerNEL105001EA
TriStar LB 941, Считыватель пластинBerthold Technologies

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bures, R., et al. Immunization with recombinant canarypox vectors expressing membrane-anchored glycoprotein 120 followed by glycoprotein 160 boosting fails to generate antibodies that neutralize R5 primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. AIDS Res. Human Retroviruses. 16, 2019-2035 (2000).
  2. Koff, W. C. HIV vaccine development: challenges and opportunities towards solving the HIV vaccine-neutralizing antibody problem. Vaccine. 30, 4310-4315 (2012).
  3. Mascola, J. R., et al. Immunization with envelope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies against laboratory-adapted but not primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. The National Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Vaccine Evaluation. 173, 340-348 (1996).
  4. Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).
  5. Roederer, M., et al. Immunological and virological mechanisms of vaccine-mediated protection against SIV and HIV. Nature. 505, 502-508 (2014).
  6. Fennie, C., Lasky, L. A. Model for intracellular folding of the human immunodeficiency virus type 1 gp120. J. Virol. 63, 639-646 (1989).
  7. Willey, R. L., Bonifacino, J. S., Potts, B. J., Martin, M. A., Klausner, R. D. Biosynthesis cleavage, and degradation of the human immunodeficiency virus 1 envelope glycoprotein gp160. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 9580-9584 (1988).
  8. Bosch, V., Pawlita, M. Mutational analysis of the human immunodeficiency virus type 1 env gene product proteolytic cleavage site. J. Virol. 64, 2337-2344 (1990).
  9. Hallenberger, S., et al. Inhibition of furin-mediated cleavage activation of HIV-1 glycoprotein gp160. Nature. 360, 358-361 (1038).
  10. Li, Y., Luo, L., Thomas, D. Y., Kang, C. Y. The HIV-1 Env protein signal sequence retards its cleavage and down-regulates the glycoprotein folding. Virology. 272, 417-428 (2000).
  11. Leonard, C. K., et al. Assignment of intrachain disulfide bonds and characterization of potential glycosylation sites of the type 1 recombinant human immunodeficiency virus envelope glycoprotein (gp120) expressed in Chinese hamster ovary cells. J. Biol. Chem. 265, 10373-10382 (1990).
  12. Wang, W., et al. A systematic study of the N-glycosylation sites of HIV-1 envelope protein on infectivity and antibody-mediated neutralization. Retrovirology. 10 (14), (2013).
  13. Helseth, E., Olshevsky, U., Furman, C., Sodroski, J. Human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein regions important for association with the gp41 transmembrane glycoprotein. J. Virol. 65, 2119-2123 (1991).
  14. Haim, H., Salas, I., Sodroski, J. Proteolytic processing of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein precursor decreases conformational flexibility. J. Virol. 87, 1884-1889 (2013).
  15. Chen, L., et al. Structural basis of immune evasion at the site of CD4 attachment on HIV-1 gp120. Science. 326, 1123-1127 (2009).
  16. Kwong, P. D., et al. HIV-1 evades antibody-mediated neutralization through conformational masking of receptor-binding sites. Nature. 420, 678-682 (2002).
  17. Sakai, K., Takiguchi, M. Toward an effective AIDS vaccine development. Eur. J. Immunol. 43, 3087-3089 (2013).
  18. Veillette, M., et al. Interaction with Cellular CD4 Exposes HIV-1 Envelope Epitopes Targeted by Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity. J. Virol. 88, 2633-2644 (2014).
  19. Wibmer, C. K., et al. Viral escape from HIV-1 neutralizing antibodies drives increased plasma neutralization breadth through sequential recognition of multiple epitopes and immunotypes. PLoS Pathogens. 9 (e1003738), (2013).
  20. Kovacs, J. M., et al. HIV-1 envelope trimer elicits more potent neutralizing antibody responses than monomeric gp120. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 12111-12116 (2012).
  21. Yuan, W., Bazick, J., Sodroski, J. Characterization of the multiple conformational States of free monomeric and trimeric human immunodeficiency virus envelope glycoproteins after fixation by cross-linker. J. Virol. 80, 6725-6737 (2006).
  22. Guttman, M., Lee, K. K. A functional interaction between gp41 and gp120 is observed for monomeric but not oligomeric, uncleaved HIV-1 Env gp140. J. Virol. 87, 11462-11475 (2013).
  23. Ringe, R. P., et al. Cleavage strongly influences whether soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers adopt a native-like conformation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18256-18261 (2013).
  24. Desormeaux, A., et al. The highly conserved layer-3 component of the HIV-1 gp120 inner domain is critical for CD4-required conformational transitions. J. Virol. 87, 2549-2562 (2013).
  25. Haim, H., et al. Soluble CD4 and CD4-mimetic compounds inhibit HIV-1 infection by induction of a short-lived activated state. PLoS Pathogens. 5 (e1000360), (2009).
  26. Haim, H., et al. Contribution of intrinsic reactivity of the HIV-1 envelope glycoproteins to CD4-independent infection and global inhibitor sensitivity. PLoS Pathogens. 7 (e1002101), (2011).
  27. Thali, M., et al. Effects of changes in gp120-CD4 binding affinity on human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein function and soluble CD4 sensitivity. J. Virol. 65, 5007-5012 (1991).
  28. Medjahed, H., Pacheco, B., Desormeaux, A., Sodroski, J., Finzi, A. The HIV-1 gp120 major variable regions modulate cold inactivation. J. Virol. 87, 4103-4111 (2013).
  29. Thali, M., et al. Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gp120 neutralization epitopes exposed upon gp120-CD4 binding. J. Virol. 67, 3978-3988 (1993).
  30. Finzi, A., et al. Topological layers in the HIV-1 gp120 inner domain regulate gp41 interaction and CD4-triggered conformational transitions. Mol. Cell. 37, 656-667 (2010).
  31. Kassa, A., et al. Transitions to and from the CD4-bound conformation are modulated by a single-residue change in the human immunodeficiency virus type 1 gp120 inner domain. J. Virol. 83, 8364-8378 (2009).
  32. Xiang, S. H., et al. Mutagenic stabilization and/or disruption of a CD4-bound state reveals distinct conformations of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein. J. Virol. 76, 9888-9899 (2002).
  33. Mouquet, H., et al. Complex-type N-glycan recognition by potent broadly neutralizing HIV antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3268-3277 (2012).
  34. Julien, J. P., et al. Broadly neutralizing antibody PGT121 allosterically modulates CD4 binding via recognition of the HIV-1 gp120 V3 base and multiple surrounding glycans. PLoS Pathogens. 9 (e1003342), (2013).
  35. Walker, L. M., et al. Broad neutralization coverage of HIV by multiple highly potent antibodies. Nature. 477, 466-470 (2011).
  36. Moore, J. P., Willey, R. L., Lewis, G. K., Robinson, J., Sodroski, J. Immunological evidence for interactions between the first, second, and fifth conserved domains of the gp120 surface glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 68, 6836-6847 (1994).
  37. Robinson, J. E., Yoshiyama, H., Holton, D., Elliott, S., Ho, D. D. Distinct antigenic sites on HIV gp120 identified by a panel of human monoclonal antibodies. J. Cell. Biochem. Suppl. 16E (Q449), (1992).
  38. Bonsignori, M., et al. Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity-Mediating Antibodies from an HIV-1 Vaccine Efficacy Trial Target Multiple Epitopes and Preferentially Use the VH1 Gene Family. J. Virol. 86, 11521-11532 (2012).
  39. Brand, D., Srinivasan, K., Sodroski, J. Determinants of human immunodeficiency virus type 1 entry in the CDR2 loop of the CD4 glycoprotein. J. Virol. 69, 166-171 (1995).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

1CD4

Похожие статьи