Последовательность конкретных Маркировка нуклеиновых кислот и белков с метилтрансферазы и кофактора аналогов

Summary

ДНК и белки-последовательность специально помечены близости или люминесцентных репортер групп с использованием ДНК или белка-метилтрансферазы и синтетические аналоги кофактора. В зависимости от кофактора специфики ферментов, азиридина или двойных активированных аналогов кофактора используются для одно- или двухступенчатой ​​маркировки.

Abstract

S -Adenosyl-L-метионин (AdoMet или SAM) зависимых метилтрансферазы (МТАазе) катализируют перенос активированного метильной группы от AdoMet к отдельным позициям в ДНК, РНК, белков и малых биомолекул. Это естественная реакция метилирования может быть расширена до широкого спектра реакций алкилирования с использованием синтетических аналогов кофактора. Замена реактивной сульфониевой центре AdoMet с Азиридиновое кольцо приводит к кофакторов, которые могут быть в сочетании с различными ДНК MTases ДНК. Эти кофакторы азиридиновые может быть оснащен репортерных групп в различных положениях аденина и используется для S equence конкретных М ethyltransferase- Я nduced л Abel Ing ДНК (ДНК улыбается). В качестве типичного примера приведем протокол для биотинилирования pBR322 плазмиды ДНК в последовательности 5'-ATCG Т-3 "с ДНК МТАазе M.BseCI и азиридинового кофактора 6BAz водин шаг. Расширение активированного метильной группы с ненасыщенных алкильных групп приводит к другому классу AdoMet аналогов, которые используются для м ethyltransferase-направленный Т ransfer Л ctivated G roups (MTAG). Поскольку расширенные боковые цепи активируются сульфониевой центра и ненасыщенной связи, эти кофакторы называются дважды активированные аналоги AdoMet. Эти аналоги не только в качестве кофакторов ДНК MTases, как азиридиновых кофакторов, но и для РНК, белков и малых MTases молекулы. Они обычно используются для модификации ферментативной МТАазы субстратов с уникальными функциональными группами, которые меченных репортерных групп во втором химическом этапе. Это видно на примере протокола для флуоресценции маркировки гистона H3 белка. Небольшой пропаргил группы передается от аналогового кофактором SeAdoYn с белком в гистона Н3 лизина 4 (H3K4) МТАазы Set7 / 9 с последующим щелчком маркировкиalkynylated гистонов H3 с TAMRA азида. МТАазе-опосредованной маркировки с кофактора аналогов технологией для многих интересных приложений, включая идентификацию и функциональный изучения МТАазе субстратов, а также генотипирования ДНК и обнаружения метилирования.

Introduction

Удельный маркировка нуклеиновых кислот ^1,2 и белков ^3,4 представляет большой интерес для функциональных характеристик, медицинской диагностики и (нано) биотехнологии. Здесь мы представляем ферментативного метода маркировки для этих биополимеров, который основан на S -adenosyl-L-метионина (AdoMet или SAM) -зависимых метилтрансфераз (MTases). Этот класс ферментов (EC 2.1.1.) Цели отдельных нуклеофильные позиции (азот, кислород, сера и атомами углерода) в пределах конкретных остатков нуклеиновых кислот и белков, и, естественно, передает активированного метильной группы кофактора AdoMet (1А) ^5. Кроме того, MTases....

Protocol

1. Общие инструкции

1. Магазин азиридин кофактором 6BAz (в ДМСО), и белок МТАазы Set7 / 9 при -80 ° С, и все другие реагенты, включая двойной активирована кофактора SeAdoYn и ДНК МТАазы M.BseCI (в 50% глицерина) при -20 ° С.
2. Определите концентрацию 6BAz и SeAdoYn с помощью UV / VIS спектроскопии с использованием коэффициентов экстинкции ε _269nm (6BAz) = 16000 см ^-1 М ^-1 и ε _{260 нм} (SeAdoYn) = 15400 см ^-1 М ^-1 в деионизированной воде. Определить концентрацию MTases с помощью анализа Брэдфорда или, если коэффициент экстинкции доступен, с помощью прямого поглощения при ....

Results

Один шаг Маркировка ДНК с помощью Азиридин кофакторами

В этом примере реакцию проводят с ДНК МТАазы M.BseCI, который изменяет второй аденин остаток в 5'-ATCG Т-3 'последовательности двунитевой и имеет один сайт узнавания на плазмиде pBR322 (фиг.4А). Чтобы проверить плазмиды маркировки, pBR322, стоит задача с рестриктазой (REase) R.TaqI (5'-TCGA-3 '). R.TaqI имеет семь объектов pBR322, один из которых входит в сайте M.BseCI. Если маркировка происходит, сайт M.BseCI б.......

Discussion

Один шаг маркировки ДНК с MTases ДНК и азиридиновых кофакторов (улыбается ДНК) является надежным методом, но некоторые аспекты следует учитывать при планировании эксперимента.

Азиридин кофактором: концентрация 6BAz для маркировки ДНК с M.BseCI был 60 мкм. При использовании других MTases ДНК концентрация кофактором должны быть оптимизированы, например такие низкие концентрации, как 20 мкМ были использованы с ДНК МТАазе M.TaqI ^19. Низкие концентрации 6BAz есть то п.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6BAz			Синтезирован в соответствии с Weinhold et al., патент No US 8,129,106, опубликован 6 марта 2012 года.
β-Меркаптоэтанол	Serva	28625
Уксусная кислота	Fisher Scientific	10304980
Акриламид/Бис Раствор, 37,5:1	Serva	10688
Ультрачистый агарозный	инвитроген	16500100
персульфатом аммония (APS)	Serva	13375
Bis-Tris	Gerbu	1304
Борная кислота	Gerbu	1115
Бромфенол синий Na соль	Serva	15375
Сульфат меди (II)	Aldrich	C1297
Хлороформ	Fisher Scientific	10020090
Coomassie Brilliant Blue	Serva	17525
ЭДТА динатриевая соль	Gerbu	1034
Этанол	Merck	100983
GelRed (10 000x в воде)	Biotium	41003
Glycerin (99,5%)	Gerbu	2006
FastRuler Low Range DNA Ladder	Thermo Scientific	SM1103
Histone H3			Экспрессия плазмиды получена от доктора Филиппа Фойгта и профессора Дэнни Рейнберга; экспрессия и выделение по T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311.
M.BseCI			Экспрессия плазмиды получена от д-ра Майкла Коккинидиса; экспрессия и выделение согласно Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14.
Метанол	Fisher Scientific	10675112
хлорид магния  гексагидрат	J.T. Baker	4003
MOPS	Gerbu	1081
Хлорид натрия	Gerbu	1112
pH-полоска (нейтралит)	Merck	1,095,330,001
pBR322	Thermo Scientific	SD0041
R.TaqI (10 u/µ l)	Thermo Scientific	ER0671
SeAdoYn			Синтезирован в соответствии с Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.
Set7/9			Экспрессия плазмиды, полученной от профессора Дэнни Рейнберга, экспрессия и выделение по D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489.
Стрептавидин	Gerbu	3058
(+)-L-аскорбат натрия	Sigma Life Science	A7631
SDS Гранулированный	Gerbu	1833
ди-гидрогенфосфат натрия	Merck	106,586
Азид			Синтезирован в соответствии со ссылкой 30: Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.
Буфер TaqI (10x)	Thermo Scientific	B28
N,N,N',N'-Тетраметилэтилендиамин (TEMED)	Acros Organics	42058
Tris-HCl	Gerbu	1028
Tris-X (TRIS-основание)	Gerbu	1018
Tris(3-гидроксипропилтриазолил-метил)амин (THPTA)	Sigma-Aldrich	762342