Методы клеточной прилагается измерения емкости в мышь надпочечников хромаффинных Cell

Краткое содержание

После экзоцитоза слившаяся плазматическая мембрана восстанавливается с помощью процесса, известного как эндоцитоз. Этот механизм преобразует новые синаптические везикулы для следующего раунда высвобождения. Отдельные эндоцитарные события регистрируются и анализируются с помощью емкостных записей прикрепленных к клеткам надпочечников хромаффинов мышей.

Аннотация

Нейронная передача является неотъемлемой частью клеточной коммуникации в мозге. Деполяризация пресинаптической мембраны приводит к слиянию везикул, известному как экзоцитоз, который опосредует синаптическую передачу. Последующее извлечение синаптических везикул необходимо для генерации новых везикул, заполненных нейротрансмиттерами, в процессе, определяемом как эндоцитоз. Во время экзоцитоза слияние мембран везикул приведет к увеличению площади поверхности, а последующий эндоцитоз приведет к уменьшению площади поверхности. Здесь наша лаборатория демонстрирует базовое введение в емкостные записи одиночных эндоцитарных событий в хромаффинной клетке надпочечников мыши. Этот тип электрической регистрации полезен для регистрации экзоцитоза и эндоцитоза с высоким разрешением на уровне одного везикулы. В то время как этот метод может обнаруживать как везикулярный экзоцитоз, так и эндоцитоз, основное внимание в нашей лаборатории уделяется везикулярному эндоцитозу. Кроме того, эта методика позволяет анализировать кинетику одиночных эндоцитарных событий. Здесь описываются методы диссекции ткани надпочечников мыши, культивирование хромаффинных клеток, основные методы прикрепления клеток и последующие примеры отдельных следов, измеряющих единичное эндоцитарное событие.

Введение

Синаптической передачи опосредуется экзоцитоза нейромедиаторов содержащих синаптических пузырьков, и эти пузырьки должны пройти местную переработку эндоцитотических внутри нервного окончания поддерживать нейронов связи в долгосрочной перспективе. Учитывая важнейшую роль синаптической передачи в головном мозге, понимая молекулярные машины, составляющие синаптической цикл пузырек представляет собой краеугольный камень в сторону лучшего понимания в сотовой связи в целом. Среди модельных клеток систем, надпочечников хромаффинных клеток предоставил некоторые из самых окончательного прозрения молекулярных машин, лежащей в основе синаптической переработки пузырьков. Экзоцитоз, заключительный шаг в высвобождения нейромедиатора, была безмерно изучены и рассмотрены с помощью надпочечников хромаффинной ячейки ^1,2. На самом деле, большинство молекулярных игроков, которые руководят этими образование, адресности, стыковку, и слияние секреторных гранул были выявлены благодаря применению делметоды ERSE в хромаффинных клеток ^1. Кроме того, путем предоставления возможность позволить для разрешения одного пузырька от машин белка, участвующего в экзоцитоза, хромаффинных клетка остается мощной моделью для решения вопросов слияния пузырьков ^3.

Измерения емкости Сотовые подключением были впервые использованы в решении одной слияния пузырьков во время экзоцитоза ^3. Экзоцитоза пузырьков размером до ~ 60 нм в диаметре были продемонстрированы быть обнаружены с помощью измерений допуска клеточных мембран с техникой патч зажима в конфигурации клеток присоединены ^4-7. Прием определяется как мера того, насколько легко схема или устройство позволит току течь; это обратная импеданса. Таким образом, измерения допуска обеспечить понимание мембранного емкости. Это достигается путем введения везикулярного мембрану в плазматической мембране; это включение показывает изменения в поверхностиплощадь ^8. Каждый слияния пузырьков вызывает ступенчатое увеличение мембрана емкости ^9,10. Кроме того, это измерение допуска обеспечивает проводимости мембраны и поры слияния проводимость во время экзоцитоза события ^3. Как эта техника предоставил уникальный инструмент на установления единых-пузырек кинетики во экзоцитоза, наша лаборатория недавно применил эту концепцию для обнаружения эндоцитоз одиночных пузырьков ^11,12.

Наши конкретные интерес клатрин-эндоцитоз (CME), который был рассмотрен в качестве основного компонента домашнего хозяйства во многих клетках ¹³ и в качестве основного пути для синаптических пузырьков эндоцитоза в нейронных терминалов ^14,15. CME, как известно, биологически важно, однако, его кинетика остаются не до конца понятны связи с техническими ограничениями в мониторинге особых эндоцитотических события. Учитывая сходство в exocytic механизмов между хромаффинных клеток и нейронов ^1, это плausible, что механизмы деления клеток в хромаффинных может, вероятно, относится к эндоцитоза синаптических пузырьков в нейронах. Измерения емкости сотовых подключением были использованы для мониторинга отдельных эндоцитотических события и анализа кинетики деления, которые большинство методов не в состоянии разрешить. В наших сотовых подключением записей, синусоида с частотой 20 кГц накладывается на проведения потенциал, а выходной ток разделяется на проводимости мембраны в одном канале и мембраны емкости в другой канал от двухфазного синхронного усилителя ^{16- 18.} Из изменений в мембранной проводимости и емкости, можно рассчитать кинетики деления порами, что, вероятно, соответствует трубчатой ​​шеи мембраны, которая соединяет интернализации пузырек в плазматическую мембрану до везикул отсечки. В совокупности эта техника дает нам возможность изучить нормативные механизмы пузырьков деления во время CME.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура была проведена в соответствии с руководящими принципами Национальных Институтов Здоровья, утвержденный уходу и использованию комитета животных из Университета Иллинойса в Чикаго на.

1. Решения и Культура Медиа Препараты

1. Держите все решения при -20 ° С в течение до шести месяцев. Держите питательных сред при 4 ° С в течение 3 месяцев.
2. Приготовьте 100 мл культуральной среды путем смешивания 1 мл пера-Strep раствора и 1 мл ITSX (инсулин-трансферрин-Селен-надбавок) до 100 мл DMEM.
3. Готовят раствор фермента путем смешивания 250 мл DMEM, 2,5 мл 100 мМ CaCl ₂ и 2,5 мл 50 мМ ЭДТА.
4. Готовят раствор инактивации путем смешивания 225 мл DMEM, 25 мл FBS, 625 мг альбумина и 625 мг ингибитор трипсина.
5. Приготовьте раствор Локка 154 мМ NaCl, 5,6 мМ KCl, 5,0 мМ HEPES, 3,6 мМ NaHCO3, 5,6 мМ глюкозы. Доводят рН до 7,3 с помощью NaOH.
6. Подготовка поли-D-лизином (PDL) Раствор, содержащий 50 мг / мл. С помощью конечной концентрации 1 мг / мл для покрытия покровные.
7. Подготовка внеклеточный раствор 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl _2, 1 мМ MgCl _2, 10 мМ HEPES-NaOH, и 10 мМ глюкозы. Доводят рН до 7,3 с помощью NaOH с осмолярности ~ 310 нмоль / кг.
8. Подготовка пипетки раствор 50 мМ NaCl, 100 мМ TEACl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl _2, 1 мМ MgCl _2, и 10 мМ HEPES. Отрегулируйте рН до 7,3 с помощью NaOH с осмолярности ~ 290 нмоль / кг.

2 надпочечников Изоляция

1. Автоклав пару больших и малых ножницами рассечение и две пары щипцов. Надевайте перчатки во время всего процесса и поместите рассекает лоток на ведерке со льдом.
2. Используйте мышей, принятые на День 0-3. Усыпить животных с CO ₂ бака под давлением с последующей декапитацией.
3. Использовать меньший набор ножницы, чтобы вырезать вниз по задней части щенка следующие позвоночника от Cervi кал в хвостовой части. Обязательно обрежьте поверхностно под кожей, а не проколоть в полость тела.
4. Далее, корки от позвоночника так, чтобы мускулатура подвергается иметь четкое представление о позвоночнике. Отсюда, сделать transectional сокращение в шейного отдела спинного мозга, а затем сделать два параллельных разрезов по бокам позвоночника.
5. С одной парой щипцов, занимающих основную часть животного, использовать другую пару щипцов, чтобы захватить позвоночник и отогните позвоночник до почки подвергаются.
6. В этот момент, визуализировать надпочечники на верхней части почек. Затем осторожно переместите два желез от каждого животного в коническую трубку, заполненную раствором Локка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда железы будут придерживаться пинцетом. Если это так, мягко использовать другую пару щипцов, чтобы помочь в удалении желез от щипцов и в раствор в Локка. Железы могут храниться в этом состоянии в течение до 2 часов.

е "> 3. Tissue Пищеварение

1. В то же время, пузырь раствора фермента с 5% CO ₂ + 95% O ₂ в течение 15 мин перед использованием. Убедитесь, что уравновешивают решение превращается из яркого розового цвета в розовато / оранжевого цвета.
2. Добавьте папаин в свеже барботируют раствора фермента до конечной концентрации 20-25 ед / мл. Инкубируйте каждую пару желез у каждого животного в течение 40-60 мин при 37 ° С в растворе фермента папаина с.
3. Добавить 75% инактивации раствора в каждую пробирку и инкубируют при 37 ° С в течение еще 10 мин. Это инкубирование инактивирует фермент активности папаина.
4. После 10 мин инкубации с инактивации решения, мягко передать желез во вновь помеченную пробирку и затем промыть железы 3x культуральной средой.

4 диссоциации клеток и покрытия

1. После мытья, разместить два желез в 200 мкл культуральной среды, а затем аккуратно титруйте желез ивниз через наконечника пипетки с 200 мкл пипетки до тех пор, пока больше не большой кусок ткани в растворе.
   Примечание: При титровании, поддерживать железы в нижней части трубки с направленной вниз силы от кончика пипетки 200 мкл и участвовать в ткань осторожно и медленно. Будьте уверены, чтобы использовать медленные, непрерывные удары, никогда не пипетки быстро или резким.
2. Добавление дополнительного 250 мкл культуральной среды, чтобы довести общий объем культуральной среды до 450 мкл.
3. Пластина 60 мкл этой клеточной раствора, содержащего на каждый из семи 12 мм покровные PDL-пре-покрытием, которые размещены в 60 х 15 мм чашки для культивирования.
4. После покрытием, положите блюдо в инкубатор, который установлен до 37 ° С и поддерживается с постоянным потоком / поставку 5% CO ₂ в течение 30 мин, чтобы обеспечить условия для жизнеспособности клеток. После инкубации, мягко добавить 5 мл подогретого культуральной среды в блюдо культуры и вернуть блюдо обратно в инкубатор на 24 ч до клеток-атташед записи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, эти клетки могут быть использованы для электрофизиологических записей на срок до 4 дней.

5 Сотовый Идентификация и Gigaohm Seal Формирование

1. Поместите 12 мм покровное в внеклеточный раствор. Поскольку весь надпочечники используются для клеточного препарата, смешать хромаффинных клетки (как правило, очень яркие с коричневатым / бежевый окраски и почти идеальной круглой формы (рисунок 1) в культуре с корковых клеток (более мелкие и более призрачной, чем хромаффинных клетки).
2. Потяните патч пипетки в четыре этапа, используя программируемый P-97 съемник. Погрузите наконечник пипетки в расплавленный воск, который поможет уменьшить емкость стекла, а затем уволить ногтей чаевые "Blow-далеко" это воска изнутри пипетки.
   Примечание: Если наполненный патч пипетки раствора, патч-пипетки обычно имеют сопротивление ~ 2 МОм.
3. Подойдите к патч пипетки близко к клетке с точностью в несколько метровicrons. Для достижения конфигурацию клеток-прилагается, посмотрите на слабое деформации клеток во время подхода патча пипетки ближе к камере. Нежный всасывание до ГОм печать не будет достигнута.

6. Сотовые подключением емкости Записи

1. После ГОм печать раскрывается, сделать сотовые подключением записи с помощью усилителя EPC-7 плюс патч-зажим и замок усилитель аналогового двухфазный (см прилагаемую таблицу оборудования). Нанесите синусоиды с амплитудой 50 мВ (RMS) и частотой 20 кГц от усилителя блокировки в.
2. Установите выходной фильтр усилителя блокировки в в 1 мс постоянной времени и 24 дБ. Установите фазу усилителя блокировки в таких, что временные изменения емкости, производимые нежных импульсов всасывающих появляются только в патч емкость (Im) следа, без проекции на патч проводимость (Re) следа (рис 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, видеть детали для калибровки системы в реФеренц 19.
3. Определить типичные изменения емкости от "вниз" шагов (рисунок 3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: твердый запись будет рассматриваться как "лестница" типа сходства со многими вниз шагов, что свидетельствует интернализации одиночные пузырьки. Процесс исправления служит в качестве механической стимуляции, так как текущее действие может быть, как правило, записанной в большинстве клеток.
4. Имя файлы в виде отдельных папок, включая дату: дд / мм / год и каждой записи клеток-прилагается в качестве своей собственной индивидуальной нумерации (XX) в этом файле.

Результаты

Жизнеспособность клеток и качество gigaohm печатью имеют решающее значение в определении качества записей клеток подключением емкости. Поэтому, очень важно, чтобы обеспечить эффективный и действенный клеточную культуру до электрофизиологических записей, и типичных жизнеспособных клеток показаны на рисунке 1. Практика и время будет полезно в достижении gigaohm печать с высоким качеством. Если можно четко видеть деформацию клеток, когда патч пипетки приближается ячейку, как описано в протоколе Шаг 5,3, ес...

Обсуждение

Измерения емкости Сотовые подключением требуют несколько критических шагов для того, чтобы успешно получить записи с высоким качеством: 1) жизнеспособные и здоровые клетки, полученные из надпочечников; 2) PDL покрытием из покровных; 3) формирование gigaohm уплотнение; 4) уровень шума системы; и 5) фаза коррекции.

Для животных хирургии, модификации можно потенциально делают это, чтобы отрегулировать хирургический подход, который наиболее соответствует ловкости и для предотвращения повреждения...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Поли-D-лизин	Sigma	P0899
DMEM		15066024	Беречь от ультрафиолета
Dulbecco' s Модифицированное защитное стекло Eagle Medium	Life Technologies
	Carolina Biological	633029	12 мм
Пенициллин Стрептомицин	Life Technologies	15140122	100 мл
инсулин-Транс-Сел-Х	Life Technologies	51500056	Только размораживание на ЛЬДУ!
Papain	Worthington	39S11614
EPC-7 plus патч-усилитель	HEKA
BNC-2090 плата сбора данных	National Instruments
Igor программное обеспечение для сбора данных	Wavemetrics
P-97 пипетка	Sutter Instruments
Microforge	Scientific Instruments
Капилляры из боросиликатного стекла	Sutter Instruments	B150-110-10	Наружный диаметр: 1,5 мм<бр/> Внутренний диаметр: 1,10 мм<бр/> Длина: 10 см