Методы клеточной прилагается измерения емкости в мышь надпочечников хромаффинных Cell

Summary

После экзоцитоза слившаяся плазматическая мембрана восстанавливается с помощью процесса, известного как эндоцитоз. Этот механизм преобразует новые синаптические везикулы для следующего раунда высвобождения. Отдельные эндоцитарные события регистрируются и анализируются с помощью емкостных записей прикрепленных к клеткам надпочечников хромаффинов мышей.

Abstract

Нейронная передача является неотъемлемой частью клеточной коммуникации в мозге. Деполяризация пресинаптической мембраны приводит к слиянию везикул, известному как экзоцитоз, который опосредует синаптическую передачу. Последующее извлечение синаптических везикул необходимо для генерации новых везикул, заполненных нейротрансмиттерами, в процессе, определяемом как эндоцитоз. Во время экзоцитоза слияние мембран везикул приведет к увеличению площади поверхности, а последующий эндоцитоз приведет к уменьшению площади поверхности. Здесь наша лаборатория демонстрирует базовое введение в емкостные записи одиночных эндоцитарных событий в хромаффинной клетке надпочечников мыши. Этот тип электрической регистрации полезен для регистрации экзоцитоза и эндоцитоза с высоким разрешением на уровне одного везикулы. В то время как этот метод может обнаруживать как везикулярный экзоцитоз, так и эндоцитоз, основное внимание в нашей лаборатории уделяется везикулярному эндоцитозу. Кроме того, эта методика позволяет анализировать кинетику одиночных эндоцитарных событий. Здесь описываются методы диссекции ткани надпочечников мыши, культивирование хромаффинных клеток, основные методы прикрепления клеток и последующие примеры отдельных следов, измеряющих единичное эндоцитарное событие.

Introduction

Синаптической передачи опосредуется экзоцитоза нейромедиаторов содержащих синаптических пузырьков, и эти пузырьки должны пройти местную переработку эндоцитотических внутри нервного окончания поддерживать нейронов связи в долгосрочной перспективе. Учитывая важнейшую роль синаптической передачи в головном мозге, понимая молекулярные машины, составляющие синаптической цикл пузырек представляет собой краеугольный камень в сторону лучшего понимания в сотовой связи в целом. Среди модельных клеток систем, надпочечников хромаффинных клеток предоставил некоторые из самых окончательного прозрения молекулярных машин, лежащей в основе синаптической переработки пузырьков. Экзоцит....

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура была проведена в соответствии с руководящими принципами Национальных Институтов Здоровья, утвержденный уходу и использованию комитета животных из Университета Иллинойса в Чикаго на.

1. Решения и Культура Медиа Препараты

1. Держите все решения при -20 ° С в течение до шести месяцев. Держите питательных сред при 4 ° С в течение 3 месяцев.
2. Приготовьте 100 мл культуральной среды путем смешивания 1 мл пера-Strep раствора и 1 мл ITSX (инсулин-трансферрин-Селен-надбавок) до 100 мл DMEM.
3. Готовят раствор фермента путем смешивания 250 мл DMEM, 2,5 мл 100 мМ CaCl ₂ и 2,5 мл 50 мМ ЭДТА.....

Results

Жизнеспособность клеток и качество gigaohm печатью имеют решающее значение в определении качества записей клеток подключением емкости. Поэтому, очень важно, чтобы обеспечить эффективный и действенный клеточную культуру до электрофизиологических записей, и типичных жизнеспособных клеток показаны на рисунке 1. Практика и время будет полезно в достижении gigaohm печать с высоким качеством. Если можно четко видеть деформацию клеток, когда патч пипетки приближается ячейку, как описано в протоколе Шаг 5,3, ес.......

Discussion

Измерения емкости Сотовые подключением требуют несколько критических шагов для того, чтобы успешно получить записи с высоким качеством: 1) жизнеспособные и здоровые клетки, полученные из надпочечников; 2) PDL покрытием из покровных; 3) формирование gigaohm уплотнение; 4) уровень шума системы; и 5) фаза коррекции.

Для животных хирургии, модификации можно потенциально делают это, чтобы отрегулировать хирургический подход, который наиболее соответствует ловкости и для предотвращения повреждения.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Поли-D-лизин	Sigma	P0899
DMEM		15066024	Беречь от ультрафиолета
Dulbecco' s Модифицированное защитное стекло Eagle Medium	Life Technologies
	Carolina Biological	633029	12 мм
Пенициллин Стрептомицин	Life Technologies	15140122	100 мл
инсулин-Транс-Сел-Х	Life Technologies	51500056	Только размораживание на ЛЬДУ!
Papain	Worthington	39S11614
EPC-7 plus патч-усилитель	HEKA
BNC-2090 плата сбора данных	National Instruments
Igor программное обеспечение для сбора данных	Wavemetrics
P-97 пипетка	Sutter Instruments
Microforge	Scientific Instruments
Капилляры из боросиликатного стекла	Sutter Instruments	B150-110-10	Наружный диаметр: 1,5 мм<бр/> Внутренний диаметр: 1,10 мм<бр/> Длина: 10 см