Руководство маленькая молекула экрана Подойдя высокой пропускной Использование эмбрионов данио

Summary

Данио является отличным экспериментальным организм для изучения позвоночных процессы развития и модели болезни человека. Здесь мы опишем протокол о том, как выполнить ручной химический экран высокой пропускной у эмбрионов рыбок данио с целый монтажа в гибридизация (жаль) читать при отъезде.

Abstract

Данио рерио стали широко использоваться модель организм исследовать механизмы, лежащие в основе биологии развития и изучать патологию человека болезни из-за их значительной степени сохранения генетических ресурсов с человека. Химические генетика предполагает тестирование эффект, что небольшие молекулы оказывают на биологический процесс и становится все более популярным поступательное метод исследования для выявления терапевтических соединений. Данио рерио специально привлекательным для использования в химических генетики из-за их способности производить большие лапы прозрачных эмбрионах, которые внешне оплодотворенных. Кроме того, эмбрионы данио может быть легко препарат обрабатывают путем простого добавления соединения к эмбриону массовой информации. Использование цельного монтировать в гибридизация (жаль), экспрессия мРНК может быть четко визуализируется в эмбрионов рыбок данио. Вместе с использованием химических генетики и желаем, данио становится мощным весь контекст организм, в котором для определения клеточного и физиологическиеЭффекты малых молекул. Инновационные успехи были достигнуты в области технологий, которые используют процедуры проверки машины на базе, однако для многих лабораториях такие варианты не доступны или остаются непомерно. Протокол, описанный здесь описано, как выполнить вручную с высокой пропускной химическую генетический экран, который требует базовых ресурсов и может быть выполнена с помощью одного индивидуального или небольшой группы в качестве эффективного периода времени. Таким образом, этот протокол обеспечивает посильную стратегии, которые могут быть реализованы с помощью научно-исследовательских групп для выполнения химических генетику у рыбок данио, которые могут быть полезны для получения фундаментальных понимание процессов развития, механизмов болезни, а также для выявления новых соединений и сигнальные пути, которые имеют медицинской соответствующие приложения ,

Introduction

Идентификация эффективных лекарственных препаратов для лечения заболевания людей является эндшпиль для многих биомедицинских исследований. В то время как идентификация и характеристика потенциальных фармакологических средств для клинического применения имеет очевидное значение для здравоохранения, он остался собой значительную проблему. В конечном счете, развитие многих терапевтических соединений происходит от знания того, как конкретные типы клеток либо развивать или функция. Данио, Danio rerio, является пресноводной костистых семьи карповых, которая стала основной модельный организм в биологии развития ^1. Данио рерио генетически податливые позвоночные, которые легко поддерживать и управлять для научных исследований ^2,3. Данио эмбрионов является прозрачным, внешне оплодотворенной, и могут быть получены сотни из одной пары взрослых спаривания только в течение недели ^2,3. Кроме того, данио доля основных систем органов и обладают большой дegree генетического сходства с млекопитающих, включая человека ^4. Поразительно, 70% человеческих генов имеют данио ортолог ^4. Благодаря этому сходству, данио были весьма актуальны экспериментальная система для изучения механизмов развития позвоночных и физиологии, и были использованы резюмировать множество заболеваний человека ^5-7. Эти причины, в частности, сделали данио идеальным кандидатом для продолжения генетических допросы и привело к постоянному росту признательности за полезности данио в биомедицинских исследованиях ^6,7.

За последние несколько десятилетий, обилие генетических инструментов были разработаны в данио. Данио геном поддается мутагенеза и трансгенеза ^3. На сегодняшний день, множество прямом и обратном генетические исследования были проведены, что приводит к генерации более 9000 мутантов ^3. Кроме того, многочисленные трансгенные линии имеют бытьан создан, которые позволили маркировки и выделения специфических типов клеток ^3. Там были значительные усилия, предпринимаемые на централизацию и распределение этих ресурсов в научно-исследовательского сообщества, которые доступны для лабораторий на довольно низкой стоимости через Международный центр данио рерио ресурсов (Zirc) ^8. Кроме того, обширная хранилище биологической информации и молекулярных инструментов, начиная от паттернов экспрессии генов в морфолино последовательности и протоколы, которые были постепенно аннотированный на информационной сети данио рерио (ZFIN) ^9-11. Эти данио исследовательских инфраструктур стало возможным благодаря значительной поддержке NIH и пропаганды этого животного модели ^8. Это кэш данио мутантов, трансгенных линий и соответствующей информации по-прежнему вызывает исключительную ценность для научного сообщества биологической в ​​целом. Тем не менее, в то время как данио теперь хорошо установлено и выдающийся модельный организм, они представляют лаrgely неиспользованный резервуар для изучения биологии и болезнь развития за счет использования химических генетических экранов.

Химические генетика является использование малых молекул, таких как лекарственных препаратов или других соединений, чтобы воздействовать на биологические процессы в системе живого ^12. Химические генетика может быть реализован понять молекулярные механизмы функции гена, например, для идентификации агентов, что спасение или усугубить определенный генетический дефект ^12. Кроме того, химические генетика представляет один крупный проспект проводить трансляционные исследования ^12. В то время как традиционные вперед генетический скрининг на животных моделях были чрезвычайно мощный в увязать конкретные гены болезней, им не хватает временное измерение, что затрудняет, а иногда невозможно наблюдать фенотипы, которые могут возникнуть после раннего эмбриогенеза. Кроме того, резервирование ген может сделать результаты, наблюдаемые с передовых генетики трудно интерпретировать. Альтернативно, химические генетический скринингпозволяют мелким временным контролем и одновременно обеспечивают ценную отправную точку для открытия новых лекарств ^12,13.

Химические генетика может быть выполнена с использованием в пробирке систем (например, клеточные линии, белков), или с использованием системы в живом организме, такие как целого организма. Использование системы в пробирке для химических генетики может быть выгодным, потому что это проще, чем системы организма в целом, легче работать с в большом масштабе, менее дорогостоящей, и меньше времени интенсивно. В результате системы в пробирке позволяют как для высокопроизводительного скрининга (HTS) и высокого содержания скрининга (HCS). Есть ряд преимуществ в использовании системы в пробирке, что следует учитывать при приближении химические генетику, но и существенные ограничения. Одним из основных ограничений на использование линии клеток является то, что малые молекулы могут быть эффективными и нетоксичными в определенной клеточной линии, но становятся токсичными при введении в целом организме. Таким образом, сутьвопроса является то, что в пробирке системы не захватить широкий контекст организма и, следовательно, не всегда в состоянии точно имитировать то, что происходит в целом организме. В то время как соединение тестирование в целых организмах могут обойти эти проблемы, использование млекопитающих целых моделей организма создает ряд физических и этических ограничений. Например, скрининг лекарств в мыши логистически мешает пространстве и за его счет, необходимой для проверки надлежащего размера выборки. Кроме того, вопросы развития может быть трудно изучить, в связи с тем, что млекопитающие развиваются в утробе матери. Наконец, в то время как проведение биомедицинских исследований имеет огромное социальной значимости, есть, тем не менее существенные потребности в защите благополучия животных, ограничивая интенсивные исследования и облегчение боли и страданий животных, используемых для научных исследований. Данио рерио обеспечить жизнеспособную замену, чтобы работать с высших позвоночных, как млекопитающие, и, кроме того, много тем можно изучать с помощью химических генетики вэмбриональные и личиночных стадий, когда неврологическое обработка отсутствует или оперативное на низком уровне ^12,13.

На сегодняшний день, несметное число химических генетических экранов были выполнены с использованием эмбрионов данио рерио, в частности, как соединение доставки может быть достигнуто путем погружения эмбрионов в среде, содержащей лекарственное средство интереса ^12-15. Кроме того, были многочисленные научные и технологические достижения, чтобы сделать химические генетический скрининг можно и управляемым ^16-20. Петерсон и его коллеги были первыми, чтобы использовать данио в химической генетическом скрининге в 2000 году, а позже в 2004 году выявили соединения, которые подавлены аорты мутации коарктации в данио ^21,22. Химические экраны, так как был реализован изучать несколько развивающимся тканей (например, сердце, кровь, сосуды) ^23-25 ​​физиологические функции (например, неврологические основы для поведения) ^26, взрослый регенерации ^27,28, и diseas е модели (например, мышечная дистрофия и рака) ^29,30. Из этих рыбок данио химических экранов, открытие, что простагландины регулируют гемопоэтических стволовых клеток было принято в ходе клинических испытаний на людях, демонстрируя силу, чтобы перейти от "танка к постели" ^23,31-33 (NIH, Клиническая Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). Совсем недавно, перспективные кандидаты терапевтические появились для сложных органов, таких как почки, которые рекультивации клеточной патологии в поликистозом почек (ДОК) ³⁴ и острой почечной травмы ^27,35, хотя они до сих пор не переехать в клинических испытаниях. Эти химические генетический скрининг широко продемонстрировать полезность тестирования небольших соединений в развивающихся данио и способности применять химические генетику допросить функцию взрослых тканей. Кроме того, существует растущий список имеющихся в продаже коллекций фармакологии, которые доступны для академических исследований ^19.

ove_content "> В последние несколько лет, были видные достижения в химической генетических технологий скрининга, в том числе с использованием автоматизированных систем роботов для дозирования препарата и обращения, а также автоматизированных систем обработки изображений ^36-38. Такие системы позволяют возможности тестирования многие тысячи соединений, чтобы достичь обеих HTS и ЖКХ ^36-38. К сожалению, предприятие химической генетических экранах с этих инновационных роботизированных предприятий, как правило, требуют значительных ресурсов. Эти типы ресурсов являются существенным препятствием для многих учреждений, которые не имеют капитал, чтобы приобрести , эксплуатировать и обслуживать такой аппаратуры. В то время как создание инфраструктуры для роботизированной обработки химических библиотек, в том числе перенос эмбрионов в упорядоченной пластины, остается стоимость непомерно высокой для многих лабораториях, автоматизированный изображений и анализа, как правило, более доступными ^12. Автоматизированная скрининг изображения позволяет количественно флуоресцентного трансгенных реносильщики и облегчает конкретных фенотипический анализ ^12,15.

Хотя автоматизированные системы представляют полезные технические достижения, многие вопросы можно решить с помощью более целенаправленных ручных экранов, таких как запрос из нескольких тысяч биологически активных соединений на процесс развития с целым-горе гибридизация (жаль) считывания ³⁹ в. Кроме того, в то время как все большее число лабораторий ссылались данио химические экраны исследовать вопрос исследования, мало (если таковые имеются) усилия достигли насыщения и много тем до сих пор не нарушил использованием химических генетику. Химические экраны могут быть выполнены с помощью небольшого данио колонию, состоящую всего из нескольких дикого типа или трансгенных танков. Таким образом, эта форма генетической допроса должны быть достижимы большинством данио исследовательских групп, заинтересованных в расширении / диверсификации в этой области. Химические библиотеки различного размера могут быть приобретены с коммерческой дистрибьютора и / или седловинеlaborators. По этим причинам, химические генетика может быть экономически целесообразным даже в суровых финансирования климатических условиях. Тем не менее, существуют препятствия для начала экран химические генетики, такие как, как планировать логистические аспекты экрана: например, количество персонала, необходимого для успешного экране, ассигнований из выделенного времени и склеивания физическое протокол вручную образцы процесс что количество от сотен до нескольких тысяч. Здесь мы подробно руководство протокол высокой пропускной выполнять химические генетику в эмбрионов рыбок данио с WISH как показания. Этот метод предполагает медикаментозное лечение эмбрионов данио, а затем обнаружения Riboprobe транскриптов мРНК. Используя этот протокол, небольшая группа или даже одного человека может разумно экран и анализировать скромный химической библиотеки около 600 соединений в промежутке 9 недель.

Protocol

Процедуры для работы с данио, описанной здесь были одобрены Комитетом по уходу и использованию Институциональная животных по в Университете Нотр-Дам. Руководство научно-исследовательской дизайн для этого экрана вручную небольшой молекулы в данио предоставляется (рисунок 1). Обзор методик, описанных в данном протоколе предусмотрен в качестве блок-схемы (рисунок 2). Пожалуйста, обратитесь к пример системы маркировки (рисунок 3) планировать этапы обработки эмбрионов, описанные в частях 4-10. Для постановки эмбрионов, пожалуйста, обратитесь к данио промежуточной серии ^40, и для подготовки WISH антисмысловых рибонуклеотидными зондами, используемых в частях 9-10 см недавно опубликованных методов ^41.

1. Подготовка данио ПАРЫ палат

1. Разместить взрослый мужчина данио и взрослых женщин данио в брачный камеры, разделенные на камеры делителя O / N.
   Примечание: Масс вязки, напримерS эти помощью группы 2-3 самок и 2-3 самцов может генерировать больше эмбрионов по сравнению с одиночными парных скрещиваний, и может быть выполнена с соответствующего размера спаривания камер.
2. Повторите шаг 1,1 таким образом, чтобы в общей сложности 25 пар данио являются настройки для каждого 96-луночный планшет из небольших молекул, которые будут протестированы.

2. Сбор эмбрионов данио

1. На следующий день, удалить разделитель, отделяющий каждую пару рыбы и после 1 часа, собирать эмбрионов данио использованием тонкой сетчатый фильтр и поместите их в чашку Петри, содержащую E3 эмбриона среды (см список материалов для рецепта).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сбор эмбрионов после 1 ч гарантирует, что эмбрионы на подобных стадиях развития.
2. Использование пластиковой пипетки передачи для удаления мусора (например, питание и твердые отходы). Затем с помощью стереомикроскопа наблюдать каждый сцепление эмбрионов и удалять любые неоплодотворенные яйца.
3. Слейте эмбрион СМИ E3 и заменить свежим E3, затем поместите каждый диш эмбрионов в 28,5 ° С инкубатор. Через 2 часа наблюдать за каждым сцепление эмбрионов с использованием стереомикроскопа и удалять любые неоплодотворенные яйца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: неоплодотворенных яиц могут отравить других эмбрионов и будет выглядеть как на стадии одной клетки или непрозрачным.
4. Продолжайте следить за ходом развития эмбрионов, используя стереомикроскопа пока они не достигнут 40% Эпиболия. Соблюдайте форму сферы эмбриона, который выглядит, будет состоять из двух отдельных слоев в 40% Эпиболия этапе ^40.

3. Химическая Разведение Подготовка

1. Извлеките химической библиотеки пластину от хранения при -80 ° С, покрывают его алюминиевой фольгой и оттаивать его при комнатной температуре.
   Примечание: Различные библиотеки растает с различной скоростью в зависимости, прежде всего, от растворителя используется. Как правило, химические библиотека замораживали при -80 ° С будет полностью размораживают в приблизительно 3 ч при комнатной температуре. Магазин оттаивания пластина (ы) в безопасном месте с соответствующей HAZMAT маркировки. Носитеppropriate очки, лабораторный халат, и два комплекта перчаток при обращении с химикатами.
2. Используйте многоканальную пипетку 8 каналов, чтобы добавить 99 мкл E3 в колонках 2-12 из 96-луночного планшета.
   Примечание: По нашему опыту, соответствующий диапазон начиная препарат находится между 10 мкМ - 50 мкм, а также, как описано в текущих протоколов ^39. Здесь мы показываем, лечение 10 мкм при использовании 1 мм химический библиотечный фонд тарелку.
3. Используйте многоканальную пипетку 8 каналов добавить 1 мкл каждого соединения с соответствующим скважины с E3.
4. Использование P10 с пипеткой 1 мкл ДМСО (или соответствующий растворитель) в колонну управления (здесь, колоночной 12).
5. Обложка химический разбавления тарелку с алюминиевой фольгой, как алюминиевая фольга защитит любые светочувствительные соединения в библиотеке, и вернуть библиотеку пластину акций химического чтобы -80 ° С для хранения.

4. выстроив Эмбрионы рыбок данио

1. Выберите чашку Петрисодержащий эмбрионов данио на 40% Эпиболия этапе. Использование передачи пипетки, осторожно поместите около 10 эмбрионов внутри каждую лунку (1,1 мл) глубокого 96-луночного планшета. Разлить эмбрионов в колонках 2-12 из глубокого 96-луночного планшета.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Исследователь должен выбрать временной точке лекарственной того, что лучше всего приспособлены к процессу развития они хотят допросить. Использование пластиковой передачи пипетки может минимизировать ущерб эмбриона. Поскольку медикаментозное лечение до 40% Эпиболия может привести к увеличению эмбриона летальности, развивать эмбрионы для дольше перед воздействием наркотиков, особенно когда изучаются более поздние процессы развития. Размещение более 15-20 эмбрионов в каждую лунку может привести к задержки развития вследствие вытеснения и его следует избегать. Важно отметить, что в глубине 96-луночный планшет, содержащий зародыши отличается от химической луночного планшета разбавления 96.
2. Используйте стекло пипетки передачи, чтобы удалить избыток E3 из каждой лунки, и исключить избыточное E3 вконтейнер для жидкости отходов.
   Примечание: Этот процесс, как правило, занимает от 30 мин до 1 ч в зависимости от скорости исследователя, так эмбрионы от 50% до 60% по завершении Эпиболия, который является стадия развития мишенью для того химической разбавления, описанной здесь. Пластина может быть наклонена под углом 45 °, чтобы вызвать эмбрионы, чтобы упасть на дно колодца так, чтобы кончик пипетки может быть прижата к нижней части скважины, чтобы отводить излишек E3.

5. Добавление химических обработок

1. Используйте многоканальную пипетку 8 каналов для передачи 100 мкл химические разведения в своих скважин в глубоком 96-луночного планшета, содержащего выстроенных эмбрионов данио.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что оригинальное расположение хорошо соединения совпадает с расположением скважин в соответствующей глубокой 96-луночного планшета (например, расположение B1 хорошо в химической разбавления пластины пипеткой в месте В1 а в глубине96-луночный планшет).
2. Смочите бумажное полотенце и положите его в светочувствительной контейнер, достаточно большой, чтобы провести пластиной с 96.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Влажный бумажное полотенце поможет предотвратить испарение химического разбавления.
3. Затем, используйте уплотнительное коврик для герметизации планшет, глубоко 96, поместите его в светочувствительной контейнере, и инкубировать ее в 28,5 ° С.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пусть эмбрионы рыбок данио не развивать до следующего утра. С другой стороны, пусть эмбрионы развиваются, пока соответствующая стадия развития процесса не анализируются.

6. Удаление химических веществ

1. Используйте многоканальную пипетку 8 каналов, чтобы добавить 300 мкл E3 для каждой строки из наркотиков лечение скважин. Откачать и выбросьте / химическое растворение E3 из каждой строки скважин. Вымойте эмбрионов 3 раза 300 мкл E3.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Откажитесь наркотиков-отходов в маркированный контейнер используется только для этой цели. Для удобства мытья, использовать стеклянную таз, наполненный E3 достаточно широкий, чтобы использовать MultIChannel пипетки.

7. проназы и крепления Эмбрионы рыбок данио

1. Трансфер эмбрионов данио, используя пластиковую передачи пипетки на четыре 24-луночных планшетах, затем удалить все мертвые эмбрионы. Этикетка также пластины 24 таким образом, что они соответствуют оригинальным местах также препарат. Поместите пипетку перед темном фоне после каждой передачи также для визуализации эмбрионов в пипетку и предотвратить пересечение а эмбриона.
2. Использование пластиковой пипетки передачи оттянуть Е3, чтобы эмбрионы едва погружен в жидкость.
3. Используйте стеклянную пипетку, чтобы добавить 2 капли проназой складе (50 мг / мл) в каждую лунку. Пусть эмбрионы инкубировать в проназы в течение 5 мин и затем перемешивание скважины, чтобы вызвать хориона распадаться. В качестве альтернативы, проназа эмбрионов, прежде чем они в нужной стадии развития для анализа.
4. Использование пластиковой пипетки передачи мыть эмбрионов дважды E3.
5. После того, как эмбрионы в нужной стадии анализа, компletely оттянуть и уничтожения оставшегося E3.
6. С помощью пластиковой пипетки передачи, чтобы добавить свежий 4% PFA / PBS в каждую лунку. Выдержите эмбрионов на 4 ° CO / N исправить. Используйте недавно таял PFA первоначально исправить эмбрионов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжайте выполнять свой экран анализа интереса. Детальный здесь в разделах 8-10 является процедурой обрабатывать экрана тарелки с пожелаете. Альтернативные способы могут быть замещены, как это желательно, то перейти к секции 11 и оценивать результаты.

8. Эмбрион пермеабилизирующего

1. С помощью пластиковой пипетки передачи, чтобы забор воды на 4% PFA / PBS из эмбрионов и мыть эмбрионов дважды 1x (фосфатно-солевой буфер с Tween) PBST. Перенесите эмбрионы в 48-луночных планшетах, затем оттянуть 1x PBST из эмбрионов. Этикетка также пластины 48, чтобы соответствовать исходные места также о глубокой 96-луночного планшета.
2. Вымойте, добавив 100% метанола в лунки с помощью пластиковых пипетки передачи нарисуйте его и добавить 100% метанол снова эмбрионов.
3. Поместите эмбрионов при -20 ° С, и инкубируют в течение по крайней мере 20 мин. С другой стороны, сохранить эмбрионов в 100% метаноле при температуре -20 ° С в течение длительного хранения.
4. Извлеките 100% метанола и мыть эмбрионов с 50% MeOH / 1x PBST, затем 30% MeOH / 1x PBST, и, наконец, дважды 1x PBST.
   Примечание: Эмбрионы старше 24 часов после оплодотворения (HPF) может быть беленой в этой точке, чтобы удалить пигментацию ^39.
5. Добавить 15 мкл оттаивали протеиназой К складе (10 мг / мл) в 50 мл PBST 1x подготовить протеиназы К (5 мкг / мл) рабочего раствора.
6. Снимите 1x PBST из эмбрионов и добавить рабочий раствор протеиназы K. Снимите протеиназы K после 4 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: экспериментатор должен работать быстро на этом этапе, чтобы не допустить деградации эмбриона. Концентрация протеиназы К и инкубационный период необходимо варьировать в зависимости от возраста эмбрионов, которое лечат ^41. Параметры, описанные здесь, относятся к эмбрионовчто 24 оплодотворения.
7. Вымойте эмбрионов с 1x ФБРТ, затем добавить ледяной 4% PFA / PBS. Пусть эмбрионы инкубировали при 4% PFA / PBS в течение 20 мин при комнатной температуре.

9. гибридизации и зонд для удаления

1. Использование пипетки стекла снять 4% PFA / PBS и мыть эмбрионов дважды 1x ФБРТ. Замените 1x PBST с 500 мкл HYB ⁺ и инкубировать эмбрионов в течение 4 часов при 70 ° C.
   Примечание: Предварительно гибридизации может быть выполнена для всего лишь 2 часа, 4 часа, но является идеальным. Кроме того, различные гибридизации и отмывки температура может быть идеальным для некоторых зондов, таких как 65 ° C, но должны быть проверены на индивидуальной основе.
2. Генерировать дигоксигенин-меченого рибозонды, соответствующие гена (ов), представляющие интерес ^41.
3. Добавить 16 мкг рибозонд с 16 мл Hyb ^+. Предварительно нагреть рибозонд / HYB ⁺ раствор при 70 ° С в течение по крайней мере 20 мин перед использованием. При использовании нескольких датчиков, добавить 16 мкг каждого зонда с той же HОбъем YB ⁺ (16 мл).
4. Использование передачи пипетки стекла, удалить Hyb ⁺ и использовать P1000 добавить на 200 мкл / рибозонд Hyb ⁺ смеси. Обратить Riboprobe / HYB ⁺ коктейль непосредственно перед использованием и пипетки вверх и вниз, как только перед добавлением смеси в каждую лунку. Используйте советы барьер пипеток добавить Riboprobe / HYB ⁺ решение, это предотвращает паров смеси въезд в пипетку.
5. Выдержите эмбрионов в Riboprobe / HYB ⁺ коктейль в 70 ° CO / N. Использовать клейкую пленку для покрытия лунок планшета для O / N зонда инкубации и все из следующих горячих промывок.
6. Подготовьте 50% формамид / 2x SSCT, 2x SSCT и 0.2x SSCT и предварительно тепло при 70 ° CO / N.
7. Использование P1000, удалить рибозонд / HYB ⁺ и хранить смесь при -20 ° С. При желании, повторно использовать Riboprobe / HYB ⁺ смесь до трех раз. Перед каждым повторным использованием, добавить в 3 мкг рибозонд к исходному riboprВТО / HYB ⁺ смесь.
8. Использование передачи пипетки стекла, мыть эмбрионов в два раза с 50% формамид / 2х ЦФСС в течение 30 мин при 70 ° С. Промывают один раз эмбрионов с 2x ЦФСС в течение 15 мин при 70 ° С. Промыть эмбрионы дважды 0,2 x ЦФСС в течение 30 мин при 70 ° С. Снимите 0.2x SSCT и мыть эмбрионов с MABT дважды в РТ.

10. Анти-дигоксигенин антител Инкубационный и обнаружения

1. Используйте стекло пипетки передачи, чтобы удалить MABT из каждой лунки. С помощью пластмассовой пипетки передачи, добавить свежий блок решение в каждую лунку. Пусть эмбрионы инкубировать в блоке в течение 4 ч при комнатной температуре. Добавить 8 мкл анти-антитела с дигоксигенин 40 мл раствора (блок 5000-кратное разведение).
2. С помощью пластмассовой пипетки передачи, замените блок решение с антителом / блок решения. Добавьте достаточно антител / блок решение, чтобы полностью покрыть эмбрионов.
3. Накройте планшет, с алюминиевой фольгой 48, так, чтобы свет не может проникнуть через чтобы эмбрионов. IncУбате эмбрионов O / N при 4 ° С. Используя стеклянную пипетку, удалите антитело / блок решение и мыть эмбрионов в 10 раз с MABT в течение 5-10 мин каждый.
   ПРИМЕЧАНИЕ: MABT моющие средства могут быть выполнены непрерывно, как она примет исследователь 5-10 мин, чтобы удалить MABT от каждой пластины и обойтись свежий MABT в лунки.
4. Генерировать две трубки 40 мл (80 мл общего количества) предварительно окрашивающего буфера. Добавить 180 мкл NBT (50 мг / мл) и 140 мкл BCIP (50 мг / мл) к одному из подготовленные трубки предварительно окрашивающего буфера для создания красящим раствором.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это окрашивание решение будет генерировать фиолетовый цветной подложки.
5. Заменить MABT с предварительно окрашивающего буфера и пусть эмбрионы инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин.
6. Заменить буфер предварительно окрашивания окрашивающим раствором и оставить при комнатной температуре. Монитор Колориметрическую реакцию каждые 15 мин, используя стереомикроскопа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: окрашивание реакции может занять от нескольких минут до многих часов в зависимости от зонда.
7. Репутациякружева окрашивания раствора с 1x PBST после реакции окрашивание завершена и затем промыть эмбрионов в два раза PBST с 1х в течение 5 мин.
8. Снимите 1x PBST и добавить 4% PFA / PBS исправить эмбрионов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, выполнять двойную хотите обнаружить рибозонды меченные антифлуоресцеин антитела. При выполнении дважды в месте, пропустить добавлением 4% PFA / PBS (шаг 10,9) после 1x PBST стирки (этап 10,8) и мыть эмбрионов два раза в течение 15 мин 0,1 М глицерина, дважды в течение 15 мин с MABT стирок, а затем инкубировать эмбрионов в течение 30 мин в блоке. Затем добавить на правильный антител O / N и выполните шаги 10.3-10.9 используя правильное решение окрашивания. Для обнаружения флуоресцеина меченных Riboprobe, подготовить окрашивания раствора с BCIP и INT наблюдать красную подложку (см Шаг 10,1).

11. забивая Химическая экрана эмбрионов Плиты

1. Выполните визуальную озвучивание результатов с использованием стереомикроскопа оценить эмбриона SAMPLэс в фенотипа анализа.
2. С помощью пластмассовой пипетки передачи, передачи эмбрионов от луночных планшетах 48 до 12 луночных планшетах для оптимальной визуализации. Этикетка 12-луночные планшеты, так что они соответствуют местах также от исходного глубоко 96-луночного планшета. Когда передача завершена, смотреть под стереомикроскопом.
   Примечание: Типичные эмбрионы могут быть выбраны из 12-луночных планшетах и отображаемого на предметные стекла под покровным стеклом ^41.

Results

Руководство подход, описанный здесь позволяет для одного исследователя эффективно и успешно провести высокой пропускной низкомолекулярные химические генетика экране с помощью данио модель эмбриона (рисунок 1). Используя этот метод, это практично для одного человека, чтобы выполнить экран химические генетики, например, что в течение 9 недель один человек (совершено в 40 ч рабочей недели) может провести опрос ~ 600 соединений (Рисунок 1) , Таким образом, время скамейке одного человека может обойти необходимость высокого ресурса с требованием оборудования, как автоматизированные системы. Компромисс в том, что руководство экран требуется несколько недель целенаправленные усилия. В противоположность этому, использование автоматизированных систем может сжимать время, затрачиваемое на 1-2 недели роботизированной времени, и может повлечь за собой относительно минимальных усилий исследователь в целом. Один из способов повышения эффективности и / или объем ручного экрана заручиться 2-3 исследователей в общей сложности, что позволит скрининг мрудные соединения, различной концентрации соединение, и / или скрининга в течение более короткого периода времени.

Основные этапы в протоколе, чтобы завершить экран химические генетики в эмбрионов данио с пожеланием отсчета показаны как блок-схемы (рис 2). Экспериментальные задачи можно разделить на два типа рабочей недели: (1) воздействие химических веществ и зародыш маркировки, и (2) анализа и обработки изображений. В химической работы экспозиции неделю, эти шаги включают создание данио взрослых (день 1), сбор эмбрионов, выстроив эмбрионов и медикаментозное лечение (День 2), готовится эмбрионов для гибридизация (День 3), и в гибридизация (День 4 -6). В анализ / изображений неделю, исследователь анализирует экспрессию мРНК забить эмбрионов и изображения хиты (день 7-11).

Важной частью выполнения экран химические генетики является последовательно и точно маркировать также места. Как экрана химические генетика рrocess подробно здесь включает передачу комплекта эмбрионов из колодца в одной тарелке, чтобы наилучшим образом в другом пластины несколько раз, потребность в точной и четкой маркировки имеет первостепенное значение, так что, когда химический попадание оценивается она может быть линейно и легко проследить к своей идентичности в химической библиотеки (рисунок 3). Самый простой способ гарантировать, что это маркировать пластины таким образом, что в любой момент времени расположение также для набора эмбрионов, обработанных соединением непосредственно соответствует химической библиотеки препарат пластины расположение также соединения, используемого для лечения этих эмбрионов (рис 3). Здесь двойная система колоризации и числовыми метками используется для организации образцы, которые были добавлены в экранных плит с использованием постоянных маркеров (Рисунок 3).

Анализируя результаты экране высокой пропускной существует острая необходимость в разработке метода правильно организовать, комментировать и анализировать потенциальное малую молекулухиты. Таким образом, экран химические генетика должна иметь полное и четкое систему классификации, которая тщательно разработанный и строго соблюдаться. Такая система должна легко и полностью передать важные динамику соединения и обеспечить краткий способ представить результаты готового экрана. Один из способов, чтобы построить такую ​​систему, чтобы эмбрионов класса, использующих систему классов, которые бы объяснить общую морфологическую выраженность и доверие хит. Кроме того, эти категории класса может быть в сочетании с ⁽⁺⁾ или ^(-) для описания либо экспансивной или восстановительное воздействие на области (ов), представляющие интерес. Здесь, эмбрионы рыбок данио были подвергнуты индивидуальных соединений из биологически активного библиотеки (Enzo химических веществ) с 50% Эпиболия до 24 часов после оплодотворения, а затем анализировали по желанию, используя коктейль из трех рибонуклеотидными зондами для обнаружения сегменты нефрона (рис 4а). В качестве примера системы оценок, колодец, который содержит группу эмбрионов, у которых был резко увеличенный ближний convoluTed трубочка (РСТ) из предпочки, данио эмбриональной почки, приведет к тому, соединение, используемое для лечения, что хорошо быть классифицированы как (класс I), которое в этом случае будет представлять класс, связанный с самой сильной дефекта и самый высокий уровень уверенность в фенотипа наблюдается (4В). Соединение будет затем с аннотацией (РСТ) и ^(+), полный обозначения бытия (Класс I - РСТ ⁺⁾ (рис 4В). Эта концепция классификации обеспечивает простой и быстрый способ описать клад информации, касающейся небольшой интерес молекулу, в том числе от тяжести эффекта соединений на организм, регион, который зависит от препарата и способа, которым этот регион пострадавших (Фиг.4В).

На рисунке 1. & #160;. Руководство данио стратегия эмбрион химический экран исследователь может реально проверить 96-луночный планшет химических веществ на эмбрионов данио рерио и выполнить последующую обработку WISH течение одной недели. Выполнение две недели химических испытаний (неделя 1 (День 1-6) и неделя 2 (День 7-12)) может работать в паре с третьей недели, посвященной образец анализа. Примерно две 96-луночные планшеты стоимостью образцов экранных может быть засчитан и отображаемого Неделя 3 (День 13-17). Этот сценарий составляет скрининга около 200 соединений в течение периода времени 3 недели, приравнивая к небольшой библиотеке около 600 соединений полностью экранированных 9 недель. Это руководство стратегия может быть изменена в зависимости от имеющихся ресурсов. Например, три исследователи могут сократить время, чтобы завершить экран примерно 600 соединений до 3 недель по сравнению с 9 недель было бы взять с одного исследователя. Стратегии скрининга могут быть адаптированы путем присвоения исследователей к конкретным аспектам экране, например, наркотиков удовольствияния и гибридизация или направляя исследователям самостоятельно выполнять весь процесс отбора на отдельных частях химической библиотеки.

Рисунок 2. Блок-схема:. Разбивка 6 день экрана рабочего процесса Процесс химического скрининга можно дискретно разбиты на 6 дней. День 1 состоит из создания данио спаривания пары (= /> 25) на поставку эмбрионов для каждого 96-луночный планшет будет показан. День 2 включает в себя сбор эмбрионов от сопрягаемых камер и упорядоченный массив их в глубоком 96-луночный планшет, после чего лекарственной терапии. На 3-й день, эмбрионы готовы для пожелаете, в том числе dechorionation, ткани фиксации и эмбрионов обезвоживания. Наконец, ЖЕЛАНИЕ выполняется на эмбрионах через день 4-6. Обратите внимание, что альтернативные процедуры окрашивания на фиксированных экземпляров может быть легко сubstituted для пожеланий.

Рисунок 3. Пластина передачи маркировка схематично. Эмбрионы рыбок данио облеченные и наркотиков лечение в 96-луночного планшета затем переехал в 24-луночного планшета для вывоза мусора и проназой воздействия. Эмбрионы затем переехал в 48-луночных планшетах для подготовки эмбрионов, желание, и ткани фиксации. Далее, эмбрионы переносятся в 12-луночные планшеты для скоринга, визуализации и хранения. Точная выстроив эмбрионов осуществляется с помощью системы цветокодирующей, что позволяет исследователю отслеживать химической происхождения для каждого испытуемого образца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. Пример система оценок:. Почки сегментация анализ ЖЕЛАНИЕ эксперимент позволяет исследователю испачкать конкретные типы клеток, основанные на идентичности зондов, которые выбраны, позволяя оценить изменения в зародыше фенотипов в соответствии с изменениями в месте транскрипции мРНК и / или уровней. В качестве примера, три сегмента данио почки эмбриона, Предпочка, были помечены с помощью Mix Экран 1. Экран Mix 1 является коктейль из зондов, состоящих из wt1b, которые специально локализуется в подоцитов (P), slc20a1a который знаменует собой проксимальных извитых трубочка (РСТ), и slc12a1 который маркирует дистального рано (DE) сегмент ^{47. (+)} Рядом с этикеткой области используется для аннотирования расширение или положительный сдвиг этой области, в то время как ^(-) символ используется диктовать уменьшению у региона. Здесь им,bryos препарат обрабатывали 13-цис-RA имеют увеличенный проксимальных извитых канальцев и полную потерю дистальной начале сегмента, без видимого эффекта на подоцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Химические генетика в данио может сделать решающее воздействие на прогрессирование открытия новых лекарств. Этот протокол обеспечивает ручной метод высокой пропускной выполнять химические генетику у эмбрионов рыбок данио с желанием считывания, эффективно позволяет индивидуальный или небольшую группу, чтобы провести экран малую молекулу. Этот метод минимально-ресурс расширяет возможности химических генетики для многих исследовательских групп. В частности, эта стратегия экран обеспечивает важную альтернативу использования роботизированной аппаратуры, поскольку такие системы не являются широко доступными через научно-исследовательских подразделений. Это руководство экран позволяет один человек, чтобы проверить один 96-луночного планшета соединений с пожеланием отсчета в 6 день рабочей недели. Так данио яйцекладущие, с эмбрионы разработки за пределами родительского, и эмбрионы являются достаточно большими, чтобы увидеть невооруженным глазом (между 1-3 мм), они поддаются для ручной обработки с простыми инструментами и исследователь может образцов массива вмульти-луночные планшеты без использования микроскопа. Кроме того, поскольку данио быстро развиваются, воздействие малая молекула может быть эффективным с одной обработке соединения, а не повторных доз, что сводит к минимуму дальнейшее ручной обработки. Эмбрионы рыбок данио легко культивировать, потому что их желток обеспечивает источник питания до 5-6 дней после оплодотворения, что исключает осложнения мальков кормления. Кроме того, большинство личинок органов разработали и стать функциональным в течение этого периода, что обеспечивает возможность изучить широкий спектр научно-исследовательских вопросов. Простое добавление небольших молекул в эмбрион инкубационного СМИ является неинвазивным и позволяет исследователю (ы), чтобы выбрать для дозы препарата, время того, и продолжительность экспозиции таким образом, обеспечивая жесткий контроль над многими переменными и позволяет для конкретных процессов развития Интересно быть запрошены. Как описано здесь, значительная производительность исследование может быть достигнута в короткий timefrAme используя эту методику ручного экрана. По нашему опыту, существует высокая отдача на вложенный усилий, которые могут быть усилен с помощью известного биологически активное химическое библиотеку проанализировать процесс интереса, таких как нефрона сегментации во время почечной развития (рисунок 4; Poureetezadi и Wingert, не опубликовано).

Ручной химической экран описано здесь исключительно универсален, потому что включает в себя анализ на фиксированных экземпляров рыбок данио. Например, эта стратегия может быть пересмотрен, чтобы проверить несколько пластин соединений в течение одной недели, а затем набрать эмбрионов на следующей неделе. Альтернативные анализы на образцах фиксированных данио, такие как иммуногистохимических или другой окраски ткани препаратов, также может быть заменен на желание считывания. Экспериментальные стратегии для выполнения сотовые анализы на рыбках данио адаптируются благодаря оптической ясности и прозрачности ранних стадиях развития. Кроме того, исследователи могут подавлять пигментацию на более поздний ГНАГЭС с использованием химических веществ, или избежать осложнений развития пигментной вообще за счет использования пигментных-менее генетических линий, как Каспер или чистой данио ^13. Это возможно вручную управлять малых молекул, обработать пятно (ы) интересов, и вручную набрать эмбрионов, используя простой стереомикроскопа. Тем не менее, важно иметь в виду, что автоматизированный анализ изображения может быть выполнена, и в действительности может потребоваться для анализа фенотипа с высоким разрешением. Например, может быть предпочтительным, чтобы партнера автоматизированной системы анализа изображений с прямого анализа, такие как трансгенного репортера, так как это упрощает ручную обработку образцов, количественно различия не так легко различимы невооруженным глазом, и устраняет исследователь уклон ^15. К счастью, некоторые автоматизированные системы обработки изображений являются удобным и экономичным с точки зрения расходов на программное обеспечение ^15. Использование и возможности других автоматизированных систем быстро развивалась и можетбыть использованы для ориентации организмов, администрирование медикаментозного лечения, и даже переехать организмов ^12,15. Эти автоматизированные системы ознаменовало начало новой технологической эры исследований и предоставили инновационные решения для управления в больших количествах испытуемых и, таким образом, выполнить HTS и ЖКХ подходов в целых организмах ^12,15. В то время как такие машины, несомненно, являются полезными инструментами, они также очень дорого и находятся вне досягаемости для многих основных научно-исследовательских лабораторий. Без доступа к этим автоматизированных возможностей может показаться, что химические экраны не возможно. Тем не менее, этот протокол описывает руководство о том, как провести ручной экран, который может использоваться для завершения экран химические генетики в практической плоскости в течение разумного периода времени.

Недостатки для ручных скрининга и химических генетики в целом существует, и следует иметь в виду при рассмотрении химического экран. В частности, этот способ требует продемонстрировали здесь умеренную степеньфизической ловкости. Эта проблема является уменьшенной или полностью устраняется через повторение, как ловкость улучшится с практикой. Кроме того, существует минимальный номер для грубой ошибкой, поскольку есть только 10 эмбрионов на лунку для анализа. Малые молекулы могут варьироваться в пенетрантностью фенотипа, индуцированной, так разумный режим подсчета очков для идентификации соединений, представляющих интерес обязательные для исполнения. Очень важно, чтобы исследователи, использующие этот протокол разработать соответствующим строгим критериям для того, что они будут рассматривать хит. Важно также иметь в виду, что характер этой формы экрана, скорее всего, дают определенную часть ложных срабатываний, которые могут быть выделены путем дальнейшего химического обработки с. Кроме того, очень важно, чтобы устроить эмбрионов точно и собрать муфты для скрининга вскоре после оплодотворения, а асинхронный развитие может привести к осложнениям в точно оценить эффект от медикаментозного лечения. Кроме того, в отношении химического скрининга как бывшийэкспериментальное стратегия, есть множество ограничений. Соединение растворимость и токсичность молекул-носителей (например, диметилсульфоксид (ДМСО)) может также представлять собой проблему, и могут быть непомерно высокими в тестировании много молекул. Хориона также может выступать в качестве барьера для воздействия наркотиков. Наконец, даже при том, что данио являются мощными и поступательное модель для химических генетики, следует всегда быть приняты при определении того, альтернативной стратегии химической экрана, например, с использованием системы в пробирке, таких как линии клеток, может быть заменен на использовании целое животные. Тем не менее, химическая обработка по всей данио системы считается предпочтительным проведение аналогичных подходов в млекопитающих, так как она обеспечивает преимущество сбора системных эффектов соединений и может позволить исследователям сортировку списка тестируемых соединений в модели млекопитающих.

На сегодняшний день, данио химические экраны обеспечили мощный экспериментальный инструмент тO очертить механизмы развития и чтобы установить кандидатов фармакологических агентов для применения в медицине, например, идентификации молекул, способных профилактики патологий, болезней. Например, исследование, проведенное Бернс и его коллеги разработали автоматизированную анализа микро-а для частоты сердечных сокращений с помощью трансгенных эмбрионов данио, что высказанные GFP в миокарде ^42. Они использовали эту трансгенной линии для анализа сердечного ритма в развитии, и как это повлияло на лечение наркозависимости ^42. Еще одно исследование, проверяя плотность населения гемопоэтических стволовых клеток в эмбрионов рыбок данио, установлено, что простагландин E2 регулирует HSC нишу ^23. Эта находка была подтверждена в мышь, и позже был реализован для клинических испытаний в трансплантации пуповинной человека ^23,31-33 (NIH, Клиническая Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). Через несколько недавних исследований, химические генетика доказала, что полезно в изучении болезни почек с помощью данио 43. Данио почек обеспечивает отличную парадигму для изучения нефрогенеза или регенерации нефрона, функциональное устройство, которые включают почки во время развития и острой почечной травмы ^43. Структура Nephron высоко консервативен между данио почки эмбриона и взрослого почек млекопитающих ^44-50. Несколько исследований, посвященных изучению данио эмбриональной почки наглядно иллюстрируют присущую поступательное потенциал в сочетании с химическими генетики. Экран химические генетика была выполнена на двух рыбок данио мутантов, которые были сопоставлены с PKD2 генов и ift172, которые, как известно, являются ключевыми игроками в поликистозом почек (ДОК) ^34. Результатом экран в определении пан-гистондезацетилазу (HDAC) ингибитор трихостатин A (TSA), как небольшой молекулы, которые могут свести на нет морфологические дефекты обычно видели в мутантных эмбрионов. Иной подход, принятый де Гро и коллег скрининг соединений, которые inducред отек в дикого типа эмбрионов данио, которые указывали бы на нарушение функции почек ^35. После выявления PTBA как хит, они отметили, что в дополнение к вызывая отек, PTBA также повышал экспрессию pax2a, маркер для почечных клеток-предшественников. Важно отметить, что оптимизированный производная PTBA тогда показали, чтобы уменьшить процентную фатальность взрослых данио, что была гентамицин-индуцированной повреждение почек и, кроме того, ускоренное восстановление мышей, которые страдали от повреждения почек ^27. Взятые вместе, эти взносы данио химических генетики продемонстрировать типы открытий, которые могут быть сделаны с использованием метода, описанного в этом протоколе.

В то время как исследования химических генетика несет существенную заслугу, это не без некоторых проблем. Исключительно с использованием химических генетики подход может сделать это сложно определить конкретный ген или гены, которые под воздействием соединения. Даже если цель (ы) найдена, сиgnificant разрыв может остаться между идентификации соединений и понимания механизма (ов) действий, в котором маленькая молекула ведет себя. Например, это может быть трудно определить механизм, в котором малая молекула, действующую так как одно соединение способно имеющий диапазон различных эффектов в организме. Тем не менее, с появлением новых технологий и более химических генетических экранов завершается у рыбок данио, задача определения механизма сокращается. Один из способов, чтобы помочь определить молекулярные эффекты определенных соединений, чтобы выбрать библиотеку наркотиков известных биоактивных для скрининга, где механизмы могут быть потенциально вывести из ранее аннотированных данных. Кроме того, chemoinformatic алгоритмы, как ворота Discovery, доступны для использования, что может сравниться структурные сходства соединения с базой данных соединений с приписываемыми механизмов ^14. Еще один способ выяснить механизм соединения будет генерировать MICRoarray профиль после лечения, а затем запросить эту анкету в составлении профилей наркотиков микрочипов, таких как Connectivity карте, поиск механистически определенных соединений, которые вызывают подобный эффект ^14. Этот подход также может быть использован, чтобы идентифицировать генетические мутанты, которые имеют такой же эффект, что и соединение, представляющее интерес. Нахождение связи между соединением и мутанта можно предположить, что соединение работает молекулярно до или после соответствующего гена, который может быть очерченной путем обработки мутанты с соединением и Morpholinos. Другим вариантом было бы масс-спектрометрии, который продолжает становиться более оптимизирован для рыбок данио. Этот метод может быть использован, чтобы очертить конкретные изменения белка или посттрансляционных модификаций после лечения препаратом. Наконец, малые молекулы и даже целые библиотеки иногда способен быть помечены для выпадающем связывающих партнеров. Стоит также отметить,, что в то время как механизм, как маленький функций молекул яы значительного импорта, есть FDA-одобренных лекарственных препаратов, механизмы остаются неизвестными.

Хотя данио демонстрируют много общего с млекопитающими и генетически и физиологически, есть еще вопрос наркотиков кроссовера ^14. Одно исследование исследовали кроссовера возможность хитов с экрана для ингибиторов клеточного цикла в эмбрионов рыбок данио ^50. Результатом экран в идентификации 14 хитов, которые ранее были неизвестны обладают активностью клеточного цикла. Из этих 14 соединений, 6 было установлено, что активность клеточного цикла в обоих человеческих и данио клеточных культурах, 3 было показано, что в сыворотке крови инактивированной в клеточных культурах, 1 был активен только в данио клеток, и 4 не обладал активностью в любом данио или человека на культурах клеток, но только в данио всего организма. Примечательно, что 4 соединения, которые только имели активность в данио демонстрируют, что существуют различия между данио и млекопитающих, которые могут prohiбит поступательное потенциал некоторых соединений. Это является важным фактором не забывать о, однако есть примеры малых молекул, как PGE _2, который усиливает способность ГСК привить в человека получателей и PTBA производных, которые улучшают скорость почечной восстановления млекопитающих, обеспечивая тем самым доказательство из принципа, что кроссовер можно ^23,31-33.

Независимо от этих ловушек, химических генетики и этого подхода минимальной ресурсов может многое предложить научному сообществу. Химические генетика особенно полезно в данио и будет продолжать играть важную роль в молекулярной допроса пути и открытия новых лекарств. Химические экраны на основе дискретных молекулярных мишеней исторически подвергались высокой интенсивности отказов из-за того, что известно как сочетание адсорбции, распределения, обмена веществ, выведения и токсикологических (ADMET) свойств ^51. Химические экраны, использующие данио, чтобысосредоточиться на процессе, а не дискретной цели, может обойти несколько проблем ADMET и идентификации соединений, которые являются эффективными в контексте всего организма. С увеличением пула доступных для рыбок данио исследований, в том числе текущих мутантных штаммов и способности использовать редактирование генома для создания целевых генетических мутантов и трансгенных ресурсов, есть практически неограниченное количество потенциальных химических генетических экранов с использованием данио. Многие химические библиотеки были куратором, и диапазона коллекции с известными биоактивных, новых соединений, структурно разнообразных и структурно подобных. Эти реагенты обеспечивают богатство захватывающих возможностей для комбинаций экранов, которые доступны в настоящее время и, вероятно, еще больше расти в ближайшие годы. С этими возможностями в стороны, это руководство и высокой пропускной протокол обеспечивает практический и удобный способ увеличить способность исследовательских групп для проведения химических генетические экраны с помощью данио.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1 - 10 μ l натуральные наконечники для пипеток	США Scientific	1111-3800
1x E3			Генерируйте с использованием 50x E3 и DI воды.
1x PBST			Генерирует 0,1% Tween-20 в 1x PBS.
10x PBS	Американская биоаналитическая	AB11072
12-луночная чашка для окрашивания	BD-Falcon	35-3225
20x SSC	Американская биоаналитическая	AB13156
24-луночная пластина	BD-Falcon	35-3226
4% PFA/1x PBS			Сгенерировать 4% PFA (w/v) в 1x PBS - кипятить, затем замораживать и хранить при -20 °C.
48-луночный планшет	CytoOne	CC7672-7548
50x E3			Генерирует 16,5 мМ CaCl2, 16,5 мМ MgSO4, 250 мМ NaCl и 8,5 мМ KCl в деионизированной воде.
96 глубоколуночная пластина	VWR	100-11-940
96 луночная пластина герметизирующий коврик	VWR	10011-946
антитела к дигоксигенину	Roche	11-093-274-910	Держать при -20 °C.
BCIP	Stock Sigma	B8503	Сгенерируйте 50 мг/мл с использованием 100% DMF - заморозьте и храните при -20 °C.
блочный раствор			Сгенерируйте 50 мл, используя 10 мл BSA (10%), 5 мл FCS и 35 мл MABT. (Оттаивание BSA и FCS при 37 и °C.)
БСА (бычий сывороточный альбумин) стоковый	американский биоаналитический	AB00448	Получите 10% БСА путем перемешивания хлопьев БСА в МАБ при комнатной температуре, затем заморозьте и храните при -20 °C. (Храните неиспользованные хлопья BSA при температуре 4 °C.)
DIG/FLU меченый рибозонд реагенты реакции транскрипции in vitro	Roche	11175025910; 11685619910	Проконсультируйтесь с производителем по процедуре.
ДМФ (диметилформальдегид)	Американский биоаналитический	AB00450
ингибитор ДНКазы 1, 10x буфер ДНКазы 1	Roche	4716728001
инкубационная чашка для эмбрионов	Falcon	35-1005
epT.I.P.S 20-300 μ l	Eppendorf	22492284
этанол (EtOH)	Sigma	E7023	Сгенерируйте 50 мл 70% EtOH с молекулярным H<суб>2O и 100% EtOH, затем храните при температуре -20 °C.
FCS (сыворотка для телят плода) поголовье	Invitrogen	16140089	Держать при -20°С.
блок стерилизации фильтра	Corning	430516	0,45 μ m CA / 1 л
объема тонких щипцов	Roboz	RS-1050
плоскодонная микроцентрифужная трубка	VWR	87003-300; 87003-298
Формамид	американский биоаналитический	AB00600	держать при -20°С.
стеклянный таз 90 x 50	Kimax Kimble	23000
стеклянная пипетка	VWR	14673-010
стеклянный флакон	Wheaton	225012
глицерин	Sigma	G7893
глицин	Sigma	G8898
гликоген	Roche	10901393001
HYB+			Генерируйте 50% формамида, 0,1% Tween-20, 5x SSC, 5 мг/мл РНК торулы дрожжей и 50 μ л/μ l гепарин
INT стоковый	Sigma	I8377	Сгенерировать 55 мг/мл с использованием 70% DMF и 30% H2O - заморозить, затем хранить при -20°C.
MAB			Генерируйте путем добавления 55,0 г основания трисмы, 8 мл 1 M Tric-HCl pH 9,5, 23,2 г малеиновой кислоты и 17,5 г NaCl к 1,5 л деионизированного H2O. Затем залейте деионизированный H2O до 2 л и автоклав.
MABT			Generate 0,1% Tween-20 in MAB
MeOH	Sigma	34860-4L
сетчатое ситечко для чая	English Tea Store	Артикул #ASTR_KEN, MPN#1705
молекулярная дистиллированная вода	Mediatech	25-055-CM
мульти 8-канальный пипетка 0,5 - 10 μ l	Eppendorf	3122000.019
мульти 8-канальный дозатор 30 - 300 μ	l Eppendorf	3122000.051
nanodrop	Thermo	ND-2000c
NBT stock	Sigma	N6876	Сгенерируйте 50 мг/мл с использованием 70% DMF и 20% H2O - заморозьте, затем храните при -20 °C.
параформальдегид	Услуги электронной микроскопии	19210
ПЦР-пленочный клей	Eppendorf	30127.48
тарелка контейнер (Коробка для карандашей)	Стерилит	1722
буфер			Генерируйте 0,1% Tween-20, 50 мМ MgCl<суб>2, 100 мМ NaCl и 100 мМ Tris pH 9,5. (Каждый раз готовьте свежие для использования.)
Pronase	Roche	11459643001	Сгенерировать 50 мг/мл с помощью E3, заморозить, затем хранить при температуре -20°C.
Протеиназа K	Roche	03-115-879-001	Получить 10 мг/мл в воде DI, затем заморозить и хранить при температуре -20°C.
ингибитор РНКазы	1 Roche	3335399001
резиновая груша	Fisherbrand Fisher Scientific	03-448-22
раствор для окрашивания-фиолетовый	Н/Д Н	/Д	Сгенерировать с помощью 45 μ л НБТ и 35 μ л BCIP на каждые 10 мл, необходимые в буфере для предварительного окрашивания.
окрашивание раствора-красный			Сгенерировать с использованием 31.5 μ l of INT и 35 μ л BCIP на каждые 10 мл, необходимые в буфере для предварительного окрашивания.
стереомикроскоп	Nikon	SMZ645, SMZ1000
Т3 РНК-полимераза	Roche	11031171001
Т7 РНК-полимераза	Roche	10881775001
переносная пипетка	Samco	202, 204
Tween-20 стоковая	американская биоаналитическая	AB02038
водяная баня	Thermo	51221073	( Модель # 2831)