Методическая статья

Выделение и функциональный анализ митохондрий из культивируемых клеток и мышь ткани

DOI:

10.3791/52076

⸱

23 марта 2015 г.

 ,  ,  ,  , 
1Chemistry Department, Elon University, 2Department of Neurobiology and Anatomy, Wake Forest School of Medicine, 3Neuroscience Graduate Program, Wake Forest School of Medicine, 4ALS Center Translational Science Unit, Wake Forest School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сравнение потенциала митохондриальной мембраны между образцами дает ценную информацию о клеточном статусе. Подробно описаны шаги по выделению митохондрий и оценке ответа на ингибиторы и разъединители с помощью флуоресценции. Метод и полезность этого протокола иллюстрируются использованием клеточной культуры и животной модели клеточного стресса.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сравнение двух или более различных групп, таких как здоровые и больные, необходимо для определения клеточного статуса. Митохондрии находятся на стыке клеточного здоровья из-за их роли как в клеточном метаболизме, так и в производстве энергии, а также в контроле апоптоза. Таким образом, прямая оценка изолированных митохондрий и митохондриальных возмущений дает возможность определить, имеет ли место органелло-специфическая (дис)функция. Методы, описанные в этом протоколе, включают выделение интактных, функциональных митохондрий из культивируемых клеток HEK и печени и спинного мозга мыши, но могут быть легко адаптированы для использования с другими культивируемыми клетками или тканями животных. Функция митохондрий, оцениваемая с помощью TMRE, и использование распространенных митохондриальных разъединителей и ингибиторов в сочетании с флуоресцентным считывателем планшетов позволяют этому протоколу быть не только универсальным и доступным для большинства исследовательских лабораторий, но и обеспечивают высокую пропускную способность.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Живые клетки банк метаболической энергии в виде жиров и углеводов и использовать эту энергию для биосинтеза, мембранного транспорта и движения. Часть энергии получают в цитозоле путем преобразования пищевых сахаров непосредственно в процессе гликолиза АТФ. Тем не менее, главным источником производства АТФ в клетке задействовать в митохондриях с помощью митохондриальной дыхательной цепи 1. Архитектура митохондрий обеспечивает необходимую пространственную ориентацию для эффективного и действенного АТФ производства. Митохондрии обладают двойную мембрану, разделенные межмембранном пространстве, и вместе с матрицей, самой внутренней митохондриальной отсека, дом компонентов и координировать химических реакций, участвующих в ATP поколения. Внутренняя мембрана содержит ряд мембраносвязанных белковых комплексов, которые включают дыхательную цепь, а также АТФ-синтазы, белкового комплекса, который приносит АДФ и Pi вместе для образования АТФ. Гостиницаэ мембрана сложена в крист и электроны передаются по дыхательной цепи комплексов через цитохром С, растворимого электронного носителя, который движется между комплексами в пределах межмембранном пространстве. Как двигаться электроны, окисление восстанавливающих эквивалентов происходит, и ионы водорода закачивается из матрицы в межмембранном пространстве. Как следствие высокой концентрации ионов в межмембранном пространстве, электрохимического градиента создает в результате чего мембранного потенциала через внутреннюю мембрану митохондрий (Δψ) 2. Кислород является окончательным акцептором электронов в цепи переноса электронов, а ионы водорода течь через синтазы АТФ из межмембранного пространства обратно в матрице, и при этом непосредственно вызвать образование АТФ. Этот процесс, как описано в целом известен как окислительного фосфорилирования. Складки крист увеличить площадь поверхности внутренней мембраны, что позволяет максимально электронного транспорта и производства АТФ вкаждый митохондрии. Белки, ферменты и другие молекулы, участвующие в окислительном фосфорилировании получены из обоих ядерных и митохондриальных генов. Митохондрии содержат свой ​​собственный кольцевой ДНК, кодирование для 13 белков, а также тРНК и мРНК, необходимых для производства АТФ 3. Тем не менее, многие другие белки необходимы, и, таким образом, ядерная закодирован. Большинство из этих атомных кодируемых белков ориентированы в митохондриях по использованию presequences на N-конце белка-предшественника, и их импорта частично вызвано Δψ 4,5.

За вклад в биоэнергетике клетки, митохондрии и влиять на основные метаболические процессы, такие как TCA и бета-окисления, клеточной сигнализации через регулирующего кальция, а также ключевую роль в апоптозе 6. В частности, во время клеточного стресса, Bcl-2 белки семейства, которые находятся на или взаимодействовать в митохондриальной наружной мембраны может вызвать митохондриальнуюВнешняя проницаемость мембраны (MOMP) 7,8. Во MOMP, цитохром с и другие белки высвобождаются в цитозоль, и вместе с несколькими цитозольных белков образуют комплекс под названием Апоптосома 9,10. Апоптосома активирует каспазы, которые выходят на расщеплять клеточных белков и ДНК во время фазы выполнения апоптоза. Как только происходит MOMP, ΔΨ свернут и производство АТФ остановился. Таким образом, как апоптоза инициируется функции митохондрий нарушена, и изменения в ΔΨ могут быть соотнесены с митохондриальной и клеточной здоровья 12. В то время как апоптоз конечная точка во многих моделях болезни, функции митохондрий и изменения ΔΨ также может дать ценную информацию о возникновении заболевания и / или прогрессирования. Например, митохондриальные структурные и функциональные изменения были зарегистрированы в ходе нейродегенеративных заболеваний 13,14.

В первой части протокола, ISOтельства интактных митохондриях, которые сохраняют свою ΔΨ описано. НЕК-293Т клетки подвергали воздействию различных концентраций и комбинаций рекомбинантного TNF-α, β-IL1 и IFN-γ индуцировать апоптоз. Эти цитокины были выбраны потому, что они часто сообщалось, с высоким содержанием первичных проб человека септических 15 и внешнего пути апоптоза могут быть вызваны взаимодействием TNF-α с его рецептором 6. Так есть тонкие различия, необходимые для выделения функционального митохондрии из первичных тканей по сравнению с культивируемых клеток, и из-за много исследований использует животных, протокол также описывает, как изолировать митохондрии из печени и спинного мозга передних боковой склероз (ALS) модель мыши.

Вторая часть протокола была разработана для мониторинга возмущений в митохондриальной мембране потенциала с использованием потенциал-чувствительный флуоресцентный краситель с флуоресцентным планшет-ридере. Разницас между сотовой статуса (например, по сравнению с здоровым здоровья) дифференцируются путем количественного прочность ΔΨ изолированных митохондрий в сочетании с разобщающих агентов, ингибиторов дыхательной цепи, сложные ингибиторов и ионофоров, все из которых вызывают диссипацию митохондриальной мембранного потенциала. Здоровыми митохондрии, тем больше изменение в ΔΨ при обработке митохондриальных ингибиторов, следовательно, реакция митохондрий могут быть использованы в качестве индикатора функции митохондрий (Dys).

Использование изолированных митохондриях, а не в месте оценки функции предлагает окончательное доказательство того, что патология или лечение непосредственно модулирует изменения в органелл 16-18. Хотя существуют методы в литературе, чтобы изолировать митохондрии от культивируемых клеток, они являются неточными 17 и / или использовать специальное оборудование 16. Этот протокол описывает в деталях метод изоляции имогут быть легко адаптированы к другим клеточных линий, в том числе первичной ткани и культур 13,14,19,20. Многие изолированные митохондрии исследования используют одни и те же митохондриальной разобщители и ингибиторы, используемые в данном протоколе, но с электродом Кларка (21 является типичным примером многих работах, описанных в литературе), что опять-таки является очень специфический и специализированный элемент оборудования. Кроме того, этот традиционный способ имеет недостатки, такие как низкая пропускная способность и высокой сложности 22,23 и требует значительного количества митохондрий (~ 500 мкг / реакция). В этом протоколе, флуоресцентный мембраны зондирования потенциал TMRE зонд используют в сочетании с флуоресцентным планшет-ридере, который является стандартным машина во многих лабораторий. TMRE широко известен, поскольку он быстро проникает в клетку и изолированные митохондрии и может быть использован в низких концентрациях 24. Несколько реакции может быть быстро создана в тандеме и партии анализируют с использованием этого протокола. Кроме того, реакцияс требуют много небольшое количество изолированных митохондрий (~ 10 мкг / реакция). К требует меньше материала, меньше, ткани или клеточной культуры образцы могут быть использованы в качестве отправной точки для изоляции митохондрий, более параллельных или реакции могут быть созданы, и достаточно потенциально материал для других изолированных экспериментах митохондрий, таких как производство АТФ, потребление кислорода, или импорта анализы возможно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на животных соответствовала Национальных Институтов руководящих принципов Здоровья и были одобрены Wake Forest University Уход за животными и использование комитета. Гнездящихся пар для SOD1G93A [B6SJL-Тя (SOD1-G93A) 1Gur] мышиной модели были получены из лаборатории Джексона (Бар Харбор, ME). Нетрансгенных дикого типа (WT) самки и SOD1G93A мужчины [B6SJL-Тя (SOD1-G93A) 1Gur] были выведены для получения SOD1G93A мышей и нетрансгенных однопометными WT, которые были использованы в экспериментах.

1. моделей для исследования

  1. Клеточная культура
    1. Поддержание клеток эмбриональной почки человека (НЕК-T293) клеток в среде DMEM, дополненной 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки, 1% пенициллина-стрептомицина и 1% L-глутамина, при 37 ° С в 5% СО 2.
    2. Рост клеток в Т75 колбы и позволяют им достичь 90% слияния.
    3. Провести клетки расщепление с помощью обработки трипсином (0,25% трипсин-ЭДТА) в течение 3-5 мин при температуре 37 ° С в 5% СО 2 , Инактивации трипсина с равным объемом клеток сред, и центрифугированием клеток в течение 5 мин при 700 мкг в 4 ° С.
    4. Аспирируйте СМИ и ресуспендируют осадок клеток в культуральной среде.
    5. Семенной клеток в соответствующем колбу или пластины 7 х 10 4 клеток в T75 колбу 48 ч до цитокинов лечение. Это должно дать ~ 70% Плотность во время лечения.
    6. Сыворотка голодать клетки 24 ч позже аспирации средства массовой информации и заменить его таким же объемом сыворотки среде (DMEM, стерильный).
    7. Подготовка TNF-α, IL1-β, и IFN-γ, из лиофилизированного порошка с ультра-чистой воды на рабочих концентрациях 5 мкг / мкл, 10 нг / мкл, и 10 нг / мкл, соответственно, и добавить их в лунки / колбы.
    8. Treat сыворотки голодали клеток путем добавления растворенных цитокинов непосредственно к клеточной культуральной среде в колбах соответствующих. Лечение состояло из отдельных цитокинов, коктейль из всех 3 (именуемые "* 3"), или стерIle воды в качестве контроля (упоминается как "0").
    9. Выдержите клеток, обработанных 24, 48 или 72 часов до оценки и сбора урожая.
  2. Оценка жизнеспособности клеток
    1. Сделать 5 мг / мл раствора 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразоли (МТТ) в 1X PBS.
    2. Для 12-луночных планшетах, добавить 100 мкл раствора МТТ в каждую лунку и осторожно встряхните, чтобы обеспечить равномерное распределение.
    3. Планшеты инкубируют в течение 15 мин-1 час при 37 ° С в 5% СО 2, и проверить под микроскопом на наличие фиолетового окрашивания. Если нет фиолетовый не присутствует, вихревой снова и позволить клетки инкубируют в 5-минутными интервалами до фиолетового не наблюдается. Количество времени, необходимого должна быть определена каждым исследователем.
    4. Использование повторного пипетки, добавьте 700 мкл МТТ растворителе (4 мМ НСl и 0,1% NP40 в изопропаноле) в каждую лунку и рок пластину (ы) при комнатной температуре в течение 5-10 мин, или пока все фиолетовый цвет не оставил клетки , Если фиолетовыйцвет не выходит из клеток, добавить дополнительные 200 мкл растворителя и продолжают циркулировать.
    5. Для анализа, принимают по 100 мкл из каждой лунки и поместить в 96-луночный планшет и читать на планшет-ридере использованием 570 нм и опорной длине волны 630 нм, 595 нм, однако также допустимо, если показания берутся в соответствии настроек.
  3. Животной модели ALS
    1. Все эксперименты на животных соответствовала Национальных Институтов руководящих принципов Здоровья и были одобрены Wake Forest University Уход за животными и использование комитета. Гнездящихся пар для SOD1G93A [B6SJL-Тя (SOD1-G93A) 1Gur] мышиной модели были получены из лаборатории Джексона (Бар Харбор, ME). Нетрансгенных дикого типа (WT) самки и SOD1G93A мужчины [B6SJL-Тя (SOD1-G93A) 1Gur] были выведены для получения SOD1G93A мышей и нетрансгенных однопометными WT, которые были использованы в экспериментах.
    2. Выполните генотипирование со стандартными праймеров против мутанта SOD1 25.

2. Выделение митохондрий

ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы работать быстро и держать все на льду в течение всей процедуры.

  1. Подготовка митохондриальной буфер для выделения (MIB), спинного буфер для выделения шнур (SC MIB) и экспериментальным буфера (EB)
    1. Подготовьте следующие растворы загодя для MIB и EB.
    2. Сделать 1 М Трис / MOPS путем растворения 12,1 г трис-основания в 70 мл H 2 O. Добавить сухие MOPS, чтобы получить рН до 7,4. Регулировка громкости до 100 мл финале. Фильтр стерилизуют и хранят при температуре 4 ° С.
    3. Сделайте 1 M Kphos путем смешивания 80,2 мл K 2 HPO 4 и 19,8 мл KH 2 PO 4. Хранить при комнатной температуре.
    4. Сделать 0,2 М Трис / EGTA добавлением 3,8 г EGTA в 10 мл H 2 O. Добавить 1 M Трис / MOPS до полного растворения, ~ 30-40 мл. Отрегулируйте до 50 мл, стерильный фильтр и хранят при комнатной температуре. Обратите внимание, что pH будет ~ 6,7.
    5. Сделайте 1 М глутамата путем 10 мл1 М раствор глутаминовой кислоты. Фильтр стерилизовать и хранить 4 ° C.
    6. Сделать 1 М малат, сделав 10 мл 1 М раствора яблочной кислоты. Добавить Трис / MOPS до 50 мм. Фильтр стерилизуют и хранят при температуре 4 ° С.
    7. Сделать MIB в концентрации 200 мМ сахарозы, 10 мМ Трис / MOPS, рН 7,4, и 1 мМ EGTA / Трис. Фильтр стерилизуют и хранят при температуре 4 ° С.
    8. Сделать SC MIB в концентрации 250 мМ сахарозы, 20 мМ HEPES-KOH, рН 7,5, 10 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl 2, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ EGTA, 1 мМ DTT, и коктейль ингибитора протеазы.
    9. Сделать EB в концентрации 125 мМ KCl, 10 мМ Трис / MOPS, рН 7,4, 5 мМ глутамата, 2,5 мМ малат, 1 мМ К фосфат, рН 7,4, и 10 мМ EGTA / Трис. Фильтр стерилизуют и хранят при температуре 4 ° С.
  2. Подготовка до сбора клеток оборудование.
    1. Промыть небольшие стеклянные судна и гомогенизации пестиком три раза стерильной водой и поставить на лед.
    2. Соберите необходимые предметы, такие как стандарт дрель, мобильный Госкомиссии по делам религийчел, 1,5 мл, 15 мл и 50 мл пробирок и решений.
  3. Митохондрии Изоляция
    1. Культивируемых клетках
      1. Для каждого типа образца, используйте две T175 колбы клеток.
      2. Убедитесь, что клетки ~ 90% сливной и использовать в контрольных экспериментах, или пластины и лечения, как описано выше на стадии 1.2.
      3. На скамье, аспирация СМИ и промыть прилипшие клетки дважды 15 мл 1x PBS каждый раз.
      4. Аспирируйте буфер и очистить колбы, чтобы удалить прилипшие клетки со дна колбы.
      5. Добавить 15 мл 1x PBS в каждую колбу, вихря, и передать отдельных 15 мл конические пробирки и поместите на льду.
      6. После того, как выскабливание делается, центрифуги пробирки в течение 5 мин при 700 мкг, 4 ° C, используя настольную центрифугу с использованием ротора Бакет.
      7. Вытяжку супернатанты и ресуспендируйте каждый шарик в 1 мл MIB.
      8. Объединить оба суспензий и трансфер в небольшой стеклянный сосуд для гомогенизации.
      9. Добавить MIBна судне, пока буфер не достигает первой линии. Перемешать клетки с пестиком, подключенных к дрели на средней скорости в течение трех проходов. Убедитесь, что судно находится на льду во время этого шага, чтобы не удалить над жидкостью пестик и использовать постоянную скорость с непрерывными проходами.
      10. Передача гомогенизированный раствор до 50 мл коническую трубку.
      11. Нарисуйте раствор в 3 мл шприц использованием 18 калибра 1 ½ дюйма иглы и изгнать его обратно в коническую пробирку на льду с 27 калибра ½ дюйма иглы. Заботиться, чтобы изгнать решение в отношении внутренней стенке трубки, чтобы использовать эту силу для разрушения клеточной мембраны.
      12. Повторите шаги шприцев в общей сложности пять раз.
      13. Переносят раствор в 15 мл коническую трубку и центрифуги в течение 5 мин при 600 мкг, 4 ° C в настольной центрифуге с использованием ротора Бакет.
      14. Осторожно удалите супернатант и распространять среди трех 1,5 мл пробирки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Mitochondria в надосадочной жидкости после первого, низкой скорости вращения, в то время как клеточные мембраны и цельные клетки осаждали.
      15. Центрифуга трубки в ротор с фиксированным углом в 10 000 мкг, 4 ° С в течение 5 мин.
      16. Вытяжку супернатанты и объединить гранул в 100 мкл MIB и сразу же поставить на лед.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Митохондрии являются в осадке после этого высокоскоростного вращения. Митохондрии, как правило, поддерживать их мембранный потенциал для ~ 2-3 ионного льда после выделения и наиболее устойчивы в виде концентрированного раствора в MIB.
    2. Изоляция митохондрий мыши ткани
      1. Обезболить мышь в соответствии с протоколом IACUC. Установите испаритель на уровне 5,0% для анестезии. Подтвердил, что животное находится под наркозом из-за отсутствия рефлекса для ног крайнем случае или мигают рефлекс, когда глаз приблизился или постукиванием с помощью ватного тампона. Держите мышь под наркозом для всей хирургической процедуры, сохраняя испарителя между 1,5% и 2,0%.
      2. ОтлISE печени и спинного мозга у каждого животного и места отдельно в ледяной 1x PBS - / -, чтобы смыть любой крови.
      3. Для печени, передавать ткани на взвешивания блюдо на льду и нарезать на мелкие части с использованием свежей лезвие в течение 1 мин.
      4. Добавить ткани и соответствующий буфер (MIB для печени или SC MIB для спинного мозга) в сосуд, пока буфер не достигает первой линии. Перемешать ткани с пестиком вручную в течение пяти проходов. Убедитесь, что судно находится на льду во время этого шага, чтобы не удалить над жидкостью пестик и использовать постоянную скорость с непрерывными проходами.
      5. Трансфер гомогенаты для очистки 15 мл трубки.
      6. Центрифуга трубки в ротор с фиксированным углом в 750 мкг, 4 ° С в течение 10 мин.
      7. Сохранить супернатантами в чистые пробирки и поместите их на лед.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Митохондрии находятся в надосадочной жидкости после первого, низкой скорости вращения, в то время как клеточные мембраны и цельные клетки осаждали.
      8. Повторное приостановить позвоночника гранулы шнур яN 500 мкл SC MIB.
      9. Re-гомогенизации каждые три раза, только заполнении емкости наполовину с SC MIB этот раз.
      10. Передача нового гомогената в свежую пробирку.
      11. Центрифуга в роторе с фиксированным углом в 750 мкг, 4 ° С в течение 10 мин.
      12. Сочетание этих новых супернатантов, которые содержат больше митохондрий, с первого супернатанта от каждого образца.
      13. Центрифуга трубки в ротор с фиксированным углом в 10 000 мкг, 4 ° С в течение 5 мин.
      14. Аспирируйте супернатанты и ресуспендируют гранул печени в 500 мкл MIB и спинного мозга гранул в 50 мкл SC MIB и сразу же поставить на лед.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Митохондрии являются в осадке после этого высокоскоростного вращения. Митохондрии, как правило, поддерживать их мембранный потенциал для ~ 2-3 ионного льда после выделения и наиболее устойчивы в виде концентрированного раствора в MIB.
      15. Выполните концентрации белка анализа для оценки концентрации митохондрий в растворе. Следуйте инструкциис по использованием коммерческого набора Protein Assay или подобный метод 26. Типичные концентрации митохондрий являются: 2 T175 колбы дает ~ 2 мг / мл, 1 печень мыши ~ 3-5 мг / мл, и один мыши спинного мозга ~ 1-3 мг / мл.
  4. Цитохром с анализа с использованием R & D Крыса / мышь цитохром С Quantikine ELISA Kit (адаптировано из протокола, предоставленной производителем).
    1. Непосредственно перед настройке реакции, развести митохондрий 0,5 мг / мл рабочей концентрации с EB и распространять разводненной митохондрии в 1,5 мл пробирки для реакций (как правило, 30-50 мкл митохондрий на пробирку).
    2. Добавить либо EB или ДМСО, при 1% от общего объема, в разбавленных митохондрий и инкубировать реакции на станке в течение 7-10 мин. Эти реакции являются стабильными в течение 30 мин при комнатной температуре, если более длительный срок не требуется.
    3. Пелле митохондрии путем центрифугирования в роторе с фиксированным углом в 10 000 мкг, 4 ° С в течение 5 мин и осторожнылы отделить супернатант и поместить каждый в отдельной 1,5 мл пробирки.
      Примечание: Трубы могут быть либо замораживали при -20 ° С для анализа позже или использовать сразу.
    4. Определить высвобождение цитохрома с помощью сравнения концентрации цитохрома с в осадок и надосадочную жидкость 27.
      1. Подготовка образцов путем растворения гранул в первоначальном объеме реакции с 0,5% ТХ-100 в 1x PBS.
      2. Для каждого образца, подготовить 2 скважин на ELISA пластины, один для теперь растворенного гранул и один для супернатанта из реакции путем добавления 100 мкл цитохрома С, сопряженной (используйте прямо из бутылки) плюс 100 мкл 0,5% Tx- 100 в 1x PBS, а затем все гранулы или надосадочной пробе.
      3. Осторожно вихрь пластины низкое значение (уровень 2-4) в течение 20 сек для смешивания, крышку и инкубируют в течение 1 ч, 37 & deg; С.
      4. Далее, мыть пластины четыре раза промывочным буфером разводненной в соответствии с производстИнструкции Эра. Удалите излишки раствора, нажав скважин на бумажном полотенце.
      5. Затем добавьте 150 мкл 1: 1 + B проявляющего раствора в каждую лунку и инкубируют пластинки в течение 20-30 мин в темноте при комнатной температуре.
      6. Наконец, добавьте 50 мкл стоп-раствора в каждую лунку и принять оптической плотности при 540 нм с использованием микропланшет-ридера. Рассчитайте количество цитохрома с из митохондрий путем сравнения количества цитохрома с в осадке против супернатанта для каждой реакции.

3. Оценка функции митохондрий (Dys)

  1. Непосредственно перед реакции создан, разбавленных митохондрии до 0,5 мг / мл рабочей концентрации в EB и помещают в 1,5 мл пробирки для реакции (обычно 30-50 мкл митохондрий используются на пробирку).
  2. Митохондриальная лечения
    1. Добавить соответствующего лечения (контроль Е.Б., 1 мкМ FCCP смешивали с 50 нМ валиномицина, 10 мкМ ротенон, 5 мкМ олигомицин, 2 мМ KCN, или 200 мкМ АДФ, конечные концентрации), чтобы отделить реакции на 1/10 от общего объема разбавленных митохондрий. Инкубируйте реакции на станке в течение 7 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо соблюдать осторожность при обращении с этими веществами, как случайного проглатывания или поглощения через кожу могут быть вредными.
    2. Развести TMRE, восстанавливали в стерильной воде при рабочей концентрации 100 мкМ и хранили при -20 ° С, до 2 мкм и добавить объем, равный митохондриальной реакционного объема.
    3. Инкубируйте реакции на станке в течение 7 мин.
    4. Гранул митохондрии центрифугированием в роторе с фиксированным углом в 10 000 мкг, 4 ° С в течение 5 мин.
    5. Нагрузка половины объема супернатанта каждого образца на 396-луночный планшет с чтения и флуоресценции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: возбуждения и эмиссии длин волн TMRE должны быть оптимизированы в соответствии с инструкциями производителя, используя объем и пластину, которая будет использоваться дляАнализ. Использование стандартного 384-а черной пластины с 25 мкл 1 мкМ TMRE (конечная концентрация реакции) получали самый сильный сигнал с использованием длин волн возбуждения / эмиссии   485 нм / 535 нм.
    6. Рассчитать загнутой разницу в флуоресценции между контролем (EB) и каждой обработки путем деления значения относительной флуоресценции (RFU), полученного от считывающего устройства для экспериментального образца РФС от контрольного образца.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лечение НЕК-293Т с 200 мкг / мл TNF-α, 40 нг / мл IL1-β, и 75 нг / мл IFN-γ (* 3) в течение 24-48 ч приводит к прогрессирующему количеств клеточной гибели (фиг.1А ). Жизнеспособность клеток оценивали с помощью МТТ анализов и последовательно демонстрирует, что составляет ~ 10% снижение жизнеспособности клеток при лечении 24 ч и ~ 20% меньше при лечении 48 ч. Клетки, обработанные с аналогичными концентрации (100 мкг / мл TNF-α, 40 нг / мл IL1-β, и 75 нг / мл IFN-γ) дают аналогичные результаты клеточной ги...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лечение НЕК-293Т с рекомбинантных цитокинов вызывает умеренное количество клеточной смерти в течение 48 ч (рис 1). Количество гибели клеток, индуцированной ФНО-альфа лечения аналогичен ранее опубликованных исследований 30 и жизнеспособность клеток уменьшается после совместного введения нескольких цитокинов, которые больше итоговой суммы с любой цитокин одна также согласуется с литературой 31,32. Возможность регулировать количество и типы цитокинов, лечения, а также сравнение коктей...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было частично поддержано грантом NSF CHE-1229562 (VDGM), Офисом студенческих исследований в Университете Элона, Химическим факультетом Элона и премией Элона Люмена (TL и TAD), Программой стипендиатов колледжа Элона (JAC) и Программой отличия колледжа Элона (TAD).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
L-глутаминовая кислотаSigmaG1251Вместо нее можно использовать калийную соль.
Яблочная кислотаSigmaM8304Вместо нее можно использовать калийную соль.
KH2PO4SigmaP0662
K2HPO4SigmaP3786
EGTASigmaE3889
Trisma baseSigmaT6066
MOPSSigmaM3183
CCCPSigmaC2920Разбавляем до 100  μ М в качестве оборотного сырья в этаноле и хранить при -20  °С.
ВалиномицинSigmaV0627Производить в ДМСО и использовать в качестве 5  μ М оборотный состав. Магазин в -20  °С.
сахарозаFisherS5-500
KCNMallinckrodt6379Сделать концентрированный бульон в этаноле и затем разбавить водой 
ротенонSigmaR8875высокотоксичен. Изготовлен на этаноле.
олигомицинSigmaO4876Высокотоксичен. Изготовлен на этаноле.
ADPSigmaA2754
TMRESigma8717-25mgРазбавить 100  μ М приклад с EB немедленно перед использованием.
DMEMGibco11965-0841x обычный (с высоким содержанием глюкозы).
Pen/StrepInvitrogen15140-155
L-глютаминFisherSH3002101Храните аликвоты при -20  ° C
FBSLonza14-501Fамериканского происхождения, премиальное качество. Нагрейте инактивацию и храните аликвоты при -20  °С.
Trypsin-EDTASigmaT4049
DMSOSIgmaD2650
Protien Assay Dye (5x)Bio-Rad500-0006Любой анализ белка может заменить.
BSAFisherBP1600-100Сделайте бульон 2 мг/мл в воде для анализа белка.
Порошок МТТSigmaM2128Фильтр стерилизованный 5 мг/мл стока изготовлен в PBS. Хранить аликвоты при -20  ° C; Магазин в 4  ° C на срок до 1 недели.
Тергитол раствор (NP-40)SigmaNP40S
Рекомбинантный Human IL-1BGibcoPCH08014После открытия магазина аликвоты на -20  ° C
Рекомбинантный человеческий TNF-альфаGibcoPHC3015L
рекомбинантный человеческий ИФН-гаммаGibcoPHC4031
Dulbeccos PBS (-/-)SigmaD8537Убедитесь, что он не содержит ионов Mg2+ и Ca2+.
Cytochrom c набор ИФА R& D системыDTC0Human для клеток HEK-293T.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Madeira, V. M. Overview of mitochondrial bioenergetics. Methods In Molecular Biology. 810, 1-6 (2012).
  2. Sakamuru, S., et al. Application of a homogenous membrane potential assay to assess mitochondrial function. Physiological Genomics. 44, 495-503 (2012).
  3. Clayton, D. A. Structure and function of the mitochondrial genome. Journal Of Inherited Metabolic Disease. 15, 439-447 (1992).
  4. Schatz, G. The protein import system of mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 271, 31763-31766 (1996).
  5. Mayer, A., Neupert, W., Lill, R. Mitochondrial protein import: reversible binding of the presequence at the trans side of the outer membrane drives partial translocation and unfolding. Cell. 80, 127-137 (1995).
  6. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  7. Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 5, a008714(2013).
  8. Hardwick, J. M., Youle, R. J. SnapShot: BCL-2 proteins. Cell. 138, 404(2009).
  9. Zoratti, M., Szabo, I. The mitochondrial permeability transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1241, 139-176 (1995).
  10. Wu, C. C., Bratton, S. B. Regulation of the intrinsic apoptosis pathway by reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 19, 546-558 (2013).
  11. Kuwana, T., et al. BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly. Molecular Cell. 17, 525-535 (2005).
  12. Joshi, D. C., Bakowska, J. C. Determination of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in live rat cortical neurons. Journal Of Visualized Experiments. , (2011).
  13. Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3, 335-350 (2013).
  14. Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part II, results and discussion. Brain and Behavior. 3, 431-457 (2013).
  15. Rajapakse, N., Shimizu, K., Payne, M., Busija, D. Isolation and characterization of intact mitochondria from neonatal rat brain. Brain research. Brain Research Protocols. 8, 176-183 (2001).
  16. Schmitt, S., et al. A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies. Analytical Biochemistry. 443, 66-74 (2013).
  17. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
  18. Debatin, K. M., Poncet, D., Kroemer, G. Chemotherapy: targeting the mitochondrial cell death pathway. Oncogene. 21, 8786-8803 (2002).
  19. Del Gaizo Moore, V., et al. Chronic lymphocytic leukemia requires BCL2 to sequester prodeath BIM, explaining sensitivity to BCL2 antagonist ABT-737. The Journal of Clinical Investigation. 117, 112-121 (2007).
  20. Del Gaizo Moore, V., Schlis, K. D., Sallan, S. E., Armstrong, S. A., Letai, A. BCL-2 dependence and ABT-737 sensitivity in acute lymphoblastic leukemia. Blood. 111, 2300-2309 (2008).
  21. Li, N., et al. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production. The Journal of Biological Chemistry. 278, 8516-8525 (2003).
  22. Hynes, J., et al. Investigation of drug-induced mitochondrial toxicity using fluorescence-based oxygen-sensitive probes. Toxicological Sciences : An Official Journal Of The Society of Toxicology. 92, 186-200 (2006).
  23. Papkovsky, D. B. Methods in optical oxygen sensing: protocols and critical analyses. Methods in enzymology. 381, 715-735 (2004).
  24. Galluzzi, L., et al. Methods for the assessment of mitochondrial membrane permeabilization in apoptosis. Apoptosis : An International Journal On Programmed Cell Death. 12, 803-813 (2007).
  25. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
  26. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  27. Certo, M., et al. Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic BCL-2 family members. Cancer Cell. 9, 351-365 (2006).
  28. Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. The Journal Of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
  29. Hogeboom, G. H., Claude, A., Hotch-Kiss, R. D. The distribution of cytochrome oxidase and succinoxidase in the cytoplasm of the mammalian liver cell. The Journal of Biological Chemistry. 165, 615-629 (1946).
  30. Marques-Fernandez, F., et al. TNFalpha induces survival through the FLIP-L-dependent activation of the MAPK/ERK pathway. Cell Death & Disease. 4, e493(2013).
  31. Chao, C. C., Hu, S., Ehrlich, L., Peterson, P. K. Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha synergistically mediate neurotoxicity: involvement of nitric oxide and of N-methyl-D-aspartate receptors. Brain, Behavior, And Immunity. 9, 355-365 (1995).
  32. Downen, M., Amaral, T. D., Hua, L. L., Zhao, M. L., Lee, S. C. Neuronal death in cytokine-activated primary human brain cell culture: role of tumor necrosis factor-alpha. Glia. 28, 114-127 (1999).
  33. Schildberger, A., Rossmanith, E., Weber, V., Falkenhagen, D. Monitoring of endothelial cell activation in experimental sepsis with a two-step cell culture model. Innate Immunity. 16, 278-287 (2010).
  34. Brown, M. R., et al. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal Of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
  35. Wong, A., Cortopassi, G. A. High-throughput measurement of mitochondrial membrane potential in a neural cell line using a fluorescence plate reader. Biochemical and Biophysical Research Communications. 298, 750-754 (2002).
  36. Blattner, J. R., He, L., Lemasters, J. J. Screening assays for the mitochondrial permeability transition using a fluorescence multiwell plate reader. Analytical Biochemistry. 295, 220-226 (2001).
  37. Kataoka, M., Fukura, Y., Shinohara, Y., Baba, Y. Analysis of mitochondrial membrane potential in the cells by microchip flow cytometry. Electrophoresis. 26, 3025-3031 (2005).
  38. Del Gaizo Moore, V., Payne, R. M. Transactivator of transcription fusion protein transduction causes membrane inversion. The Journal of Biological Chemistry. 279, 32541-32544 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

TMREHEK

Похожие статьи