Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

Мы опишем, как визуализировать macrophage- C. neoformans (Сп) взаимодействия в режиме реального времени, при этом особое внимание на процесс не-литической экзоцитоза с использованием цифровой световой микроскопии. Используя эту технику индивидуально зараженные макрофаги могут быть изучены, чтобы установить различные аспекты этого явления.

Abstract

Многие аспекты инфекции макрофагов по Cryptococcus neoformans были широко изучены и определены. Тем не менее, один частности взаимодействие, что не ясно понимать, не является литическую экзоцитоз. В этом процессе, дрожжевые клетки высвобождаются во внеклеточное пространство с помощью механизма плохо понимаемой, что оставляет как макрофаг и Сп жизнеспособным. Здесь мы опишем, как следовать большое количество индивидуально инфицированных макрофагов для 24 часами инфекции периода по времени истек микроскопии. Зараженные макрофаги расположены в нагревательной камере с CO ₂ атмосферы, прикрепленной к микроскопом, который обеспечивает те же условия, как и культивирования клеток инкубатора. Онлайн цифровая микроскопия может предоставить информацию о динамических взаимодействий между организмом хозяина и возбудителем, недоступной из статических изображений. Будучи в состоянии визуализировать каждый инфицированной клетки могут дать ключи, чтобы, как макрофаги справиться с грибковыми инфекциями, и наоборот. Эта техника яса мощным инструментом в изучении динамики, которые находятся за сложного явления.

Introduction

Этапы грибковой инфекции между криптококковых клеток и макрофагов, хорошо документированы ^1-3. После дрожжевые клетки поглощаются макрофагами, различные взаимодействия может произойти: макрофагов может лизировать выпуская его грибковой нагрузки во внеклеточное пространство, или он может контролировать инфекцию, сохраняя дрожжевых клеток в пределах своей клеточной мембраны ^4. Тем не менее, несколько лет назад новый результат был описан независимо друг от друга две группы: не-литическую экзоцитоза, процесс, в котором макрофагов исключены некоторые или все из криптококковых клеток в окружающую среду или соседней соте, и оба хоста и возбудитель остаются жизнеспособными ^{5 -8.} Несколько исследований пытались понять молекулярные механизмы, лежащие в этом взаимодействии, но мы до сих пор не имеют полное представление о том, что движет этим явлением.

Возможность захвата изображения в режиме реального времени, а затем впоследствии проанализировать несколько инфицироватьред макрофаги позволяет ответить на многие вопросы о физических свойствах окружающих не-литическую экзоцитоз в отношении сроков, пространственного потенциала, изменения в морфологии и даже стресс макрофагов во грибковой инфекции. По позволяя клеткам быть размещены в среде, которая сравнима с инкубатора, мы можем увидеть динамическую природу макрофагов-грибковые взаимодействий клеток. Исследователи использовали эту технику для изучения различных компонентов этого процесса. Роль фагосомы в этом процессе было сделано очевидным использованием флуоресцентного окрашивания и актин блокаторов ^9, в то время как другая группа использовал этот метод, чтобы показать, что не-литический экзоцитоз был заблокирован в клетках, которые имели WASH нуклеирующий белковых доменов удален ^10. Эффект цитокинов сигнализации также было установлено при помощи в режиме реального времени микроскопии ^11. Этот процесс не ограничивается C. neoformans, как это наблюдалось также с Candida Albicans, соседнийг грибкового патогена, который имеет возможность инфицировать макрофаги ^12. Эти данные приведены примеры, как этот метод может обеспечить большой объем информации в области, которую мы так мало знаем о.

Protocol

Все животное работа была сделана в соответствии с правилами и руководящими принципами Института исследования животных на колледже Альберта Эйнштейна медицины.

1. Условия рост C. neoformans H99 (Серотип)

1. Вырастить индивидуальный C. neoformans (Сп) колонии на агаре Сабуро пластин.
2. За день до эксперимента, выберите один колонию и привить 10 мл Сабуро бульоне.
3. Разрешить культуры расти в течение ночи при 37 ° С встряхивании со скоростью 250 оборотов в минуту.

2 Выделение и подготовка первичной Bone макрофагов от C57 / BL6 Мыши

1. Усыпить мышей путем не помещая животное в CO ₂ камеры, пока не более дыхания. В качестве второго меры, цервикально вывихнуть шею перед началом вскрытия. Стерилизовать все тело с 70% этилового спирта.
2. Снимите обе бедренные кости и голени и место кости в стерильной среде DMEM.
3. Удалите излишки ткани и мышцы с помощью десиликатное салфетки, пока кости не полностью чистый.
4. Место только интактные кости в чашку Петри, содержащую 70% этилового спирта и инкубировали в течение 3 мин, чтобы убить микроорганизмы связанные с ними. Удалить кости и место в чашки Петри с стерильной среде DMEM.
5. Аккуратно вырежьте концы костей. Держите кость над пустой 50 мл коническую трубку помещают на лед и осторожно флеш 10 мл холодной DMEM с использованием G иглу 25 через каждую кость.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая мышь даст 4 кости (2 бедра, 2 Большеберцовые кости). Поэтому одна мышь должны давать примерно 40 мл клеточной суспензии.
6. Центрифуга клеточной суспензии при комнатной температуре в течение 10 мин при 650 х г в.
7. В течение этого центрифугированием, подготовки и фильтр стерилизуют макрофагов костного мозга питательной средой, которая состоит из DMEM, дополненной 20% L929, 10% фетальной телячьей сыворотки, 10% НКТЦ-109, 1% Pen-Strep, 1% HEPES, 1% L-глутамина , 1% заменимых аминокислот, 0,1% 2-меркаптоэтанол.
8. Ресуспендируют полученный осадок с 10 мл питательной средой. Проходят клеток suspensион через 70 мкм ячейки фильтра сорвать скопления клеток и удаления крупного мусора.
9. Plate 1 мл клеточной суспензии в 10 мл питательной средой в чашках Петри, которые указаны для использования культуры тканей (в общей сложности 10 пластин).
10. Разрешить клетки придерживаться при 37 ° С с 10% CO _2. Добавить 5 мл свежей питательной средой на 3 день 7 день, полностью заменить подающие СМИ и макрофаги готовы к использованию.
11. День до эксперимента, отсоединить макрофаги из пластины путем удаления питательной средой и добавить 5 мл нежной клетки зачистки реагента к пластине.
12. Инкубировать в течение 5-10 мин при температуре 37 ° С и удалить макрофаги с осторожно пипеткой.
13. Гранул клетки центрифугированием при 650 х г в течение 10 мин.
14. Ресуспендируют осадок в 1 мл питательной средой. Использование разбавление 1:20, рассчитать концентрацию макрофагов с помощью пипетки 10 мкл клеточной суспензии на гемоцитометре.
15. Использование 14 мм со стеклянным дном чашки Петри, плитыконцентрация 1 × 10 ⁵ макрофагов непосредственно на внутренней яме, которая держит максимум 200 мкл, так что будьте осторожны, чтобы не превышать этот объем, как показано на рисунке 4.
16. Разрешить клетки прилипать к стеклянной чашке Петри, поместив посуду в 37 ° C инкубаторе в течение 1 часа.
17. Добавить 1-2 мл подачи среде с LPS при концентрации 1 мг / мл и IFNg при 500 U / мл и позволяют клетки инкубируют в течение ночи.

3 Co-инкубацию с первичными макрофагах мышей и С. neoformans

1. В день эксперимента, удалить 1 мл на ночь, инокулированных культурой и осадок дрожжевых клеток центрифугированием в течение 5 мин при 420 х г в.
2. Вымойте клетки 3 раза стерильной PBS для удаления СМИ и внеклеточных Криптококковый продукты, как полисахарид глюкуроноксиломанну (GXM) на скорости и времени, упомянутого выше.
3. Ресуспендируйте осадок клеток в 1 мл стерильной PBS и сделать 1: 100 разбавления. Внесите 10 мкл тон разбавления на гемоцитометре и рассчитывать клетки. Добавить дрожжевых клеток при МВД 1: 5. Например, если есть 1 х 10 ⁵ макрофаги / хорошо, сделать клеточной суспензии из 5 х 10 ⁶ / мл Сп и добавить 100 мкл этого раствора на общую сумму 5 х 10 ⁵ Сп.
4. Добавить расчетный объем криптококковым суспензии клеток в 1 мл, питающих сред с антителом МКА 18B7 в концентрации 10 мкг / мл. Инкубируйте клеточной суспензии при комнатной температуре в течение 5 мин.
5. Удалить кормления СМИ от стеклянным дном чашки Петри и мыть 1x стерильной PBS. Добавить 100 мкл опсонизированного Сп непосредственно к хорошо.
6. Разрешить клетки инкубировать в течение 2 ч при 37 ° С с 10% CO _2.
7. После совместной инкубации, проверить под микроскопом, что макрофаги усвоили Сп. Чтобы считаться усвоены, криптококкового клетки четко следует рассматривать в пределах макрофагов.
8. Вымойте Петри 3x стерильной PBS, чтобы удалить и все extracellulaг Сп.
9. Добавьте 1-2 мл питательной средой без добавления МКА 18B7, а также создать микроскоп.

4 Визуализация Номера для литического Экзоцитоз в режиме реального времени Использующ Digital световой микроскопии

ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения этих экспериментов, микроскоп, который поставляется с прикрепленным инкубации камеры, которая включает CO ₂ доставку и отопление блок необходим.

1. Перед экспериментом, предварительно нагреть камеру инкубации в течение по крайней мере 30 мин до 37 ° С. Убедитесь, что СО ₂ аппарат считывает 5% в начале эксперимента.
2. Место стеклянным дном чашки Петри на микроскопа платформы, накрыть CO ₂ крышки, и закройте все двери, чтобы не гарантировать тепловые побегов.
3. Используя цели 10X с микроскопом в фазовом контрасте, сосредоточиться на четком области инфицированных макрофагов. На основе эксперимента, определить цели, используемую сколько макрофаги должны быть изучены.
4. Настройка микроскопа программное обеспечение к таке снимок на каждые 4 мин на срок 24 час.
5. Через 24 ч эксперимента будет достигнут к завершению, и в общей сложности 361 изображений будет были собраны. Экспорт эти изображения как .jpegs при сжатии 5%. Использование изображения J программное обеспечение, просмотреть изображения в виде визуальной Stack со скоростью 5 кадров в секунду. Если фильм необходимо рассматривать для публикации или презентации, сохранить его либо как .avi или .mov файла, в зависимости от формата лучше всего работает для зрителя.

Representative Results

Discussion

Здесь мы описали метод, посредством которого грибковые-макрофагов взаимодействия могут быть записаны и проанализированы в реальном времени в течение 24 час. Наша лаборатория использует этот протокол для изучения многих временных аспектов не-литической экзоцитоза и будет продолжать использовать в режиме реального времени микроскопии для установления морфологических компонентов, которые окружают этот процесс.

Для этого методика для получения идеальных результатов, особое внимание должно быть уделено определенные шаги в протоколе. Плотность клеток, что является покрыты ночь перед важно, потому что слишком много клетки могут создать фильм, который не может использоваться как просмотр движения и взаимодействия отдельных клеток затруднено, в то время как слишком мало клеток может дать данные, не имеет существенного значения. Цель состоит в том, чтобы добиться равномерно распределены поле макрофагов таких, что отдельные макрофаги могут быть предприняты для продолжительности периода инфекции. В этом же ключе, смывая внеклеточный Сп является важным шагом как эксвнеклеточного Сп разделит со временем, которые могут затенить поле и привести к потере видимости макрофагов. В зависимости от длины фильма, кадр может перейти в фокусе, что делает изображения непригодные для изучения и, следовательно, запись должна быть проверена в различных точках во время инфекции.

Как отмечалось, существуют различные способы эта техника может быть изменен, чтобы соответствовать в пределах параметров других экспериментов. Много различных флуоресцентные красители и маркеры могут быть использованы для выделения динамику мембранных и phagosomal но надо быть осторожным фото отбеливания и повлиять на это может иметь о пригодности клеток. Различные типы клеток также может быть использован, например, J774.1 макрофаг-подобных клеток, моноцитов или амебы в сочетании с другими грибковых штаммов по изучению различий, которые могут возникнуть. Рекомендуем использовать цели 10X, потому что наши эксперименты требуют сбора данных большого количества клеток, однако можно было бы использовать болееЦель изучать только несколько клеток. Выбор времени, что каждое изображение принимается также можно регулировать. Съемка изображения каждые 4 мин в течение 24 часов дает фильм, который работает примерно 1 минуту в длину, когда все кадры были сжаты. Повышение либо аспект (продолжительность инфекции или время между кадрами) увеличивает количество файлов, которые необходимо хранить, которые могут быть проблемой для некоторых лабораториях.

Номера литического экзоцитоза является чрезвычайно динамический процесс, который быстро и через различные интервалы времени происходит во время инфекции. Поэтому, пытаясь захватить макрофаги, перенесших это взаимодействие, используя другие методы, такие как передачи и сканирующей электронной микроскопии удается крайне редко. В связи с характером того, как образцы фиксированы и обработке, не может быть уверен, что то, что в настоящее время рассматривается окончательно не-литические экзоцитоз по сравнению с другими клеточных процессов, таких как лизиса или апоптоза. Кроме того, отличительной чертой не-литической экзоцитоза является то, что хозяин и патоген остаются с помощью BLE впоследствии, который является то, что не может быть выведена из статических изображений, так как эти методы могут производить только снимки процесса в данный момент.

Хотя этот протокол может обеспечить бесчисленные образы клеточных процессов, есть некоторые ограничения в использовании этого метода для изучения хозяев патогенных взаимодействия. Низкая цель мы используем для изучения большого количества макрофагов в свое время не позволяет достаточно высокой разрешение изображения для визуализации взаимодействия между фагосомы и клеточной мембраны, которая не является хорошо понимал аспект не-литической экзоцитоза. После того, как все изображения были записаны, после анализа следующих многих макрофагов может быть очень утомительным и трудоемким. Макрофаги, даже те, привязаны к стеклу, может быть очень подвижны, и будет входить и выходить из рамы очень быстро. Это может сделать это трудно следовать отдельные макрофаги от начала до конца, особенно те, которые находятся вблизи периферии кадра.

jove_content "> Несмотря на эти ограничения, это протокол может быть использован в различных способов изучают различные аспекты хозяин-патоген взаимодействий.

Materials

Sabouraud Dextrose Agar	BD	DF0109-17-1
Sabouraud Dextrose Broth	BD	DF0382-17-9
Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning Cellgro	10-013-CV
Fetal Calf Serum (FCS)	Atlanta Biologicals	S12450
NCTC 109	Invitrogen	21340-039
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
HEPES Buffer	Corning Cellgro	25-060-Cl
Glutamax	Invitrogen	35050-061
Non-essential Amino Acids	Corning Cellgro	25-025-Cl
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985-023	Toxic
3003 Tissue Culture Petri Dishes 	Fisher Scientific 	08772E
CellStripper	Corning Cellgro	25-056-Cl
Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes	MatTek	P35GC-1.5-14-C
LPS	Sigma	L3137
Mouse IFN-g	Roche	NC 9222016
mAb 18B7	Non-commerical antibody produced in our lab
Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber	Zeiss