Визуализация Номера для литическую экзоцитоза Cryptococcus neoformans От макрофагов с помощью цифровых световой микроскопии

Summary

Мы опишем, как визуализировать macrophage- C. neoformans (Сп) взаимодействия в режиме реального времени, при этом особое внимание на процесс не-литической экзоцитоза с использованием цифровой световой микроскопии. Используя эту технику индивидуально зараженные макрофаги могут быть изучены, чтобы установить различные аспекты этого явления.

Abstract

Многие аспекты инфекции макрофагов по Cryptococcus neoformans были широко изучены и определены. Тем не менее, один частности взаимодействие, что не ясно понимать, не является литическую экзоцитоз. В этом процессе, дрожжевые клетки высвобождаются во внеклеточное пространство с помощью механизма плохо понимаемой, что оставляет как макрофаг и Сп жизнеспособным. Здесь мы опишем, как следовать большое количество индивидуально инфицированных макрофагов для 24 часами инфекции периода по времени истек микроскопии. Зараженные макрофаги расположены в нагревательной камере с CO ₂ атмосферы, прикрепленной к микроскопом, который обеспечивает те же условия, как и культивирования клеток инкубатора. Онлайн цифровая микроскопия может предоставить информацию о динамических взаимодействий между организмом хозяина и возбудителем, недоступной из статических изображений. Будучи в состоянии визуализировать каждый инфицированной клетки могут дать ключи, чтобы, как макрофаги справиться с грибковыми инфекциями, и наоборот. Эта техника яса мощным инструментом в изучении динамики, которые находятся за сложного явления.

Introduction

Этапы грибковой инфекции между криптококковых клеток и макрофагов, хорошо документированы ^1-3. После дрожжевые клетки поглощаются макрофагами, различные взаимодействия может произойти: макрофагов может лизировать выпуская его грибковой нагрузки во внеклеточное пространство, или он может контролировать инфекцию, сохраняя дрожжевых клеток в пределах своей клеточной мембраны ^4. Тем не менее, несколько лет назад новый результат был описан независимо друг от друга две группы: не-литическую экзоцитоза, процесс, в котором макрофагов исключены некоторые или все из криптококковых клеток в окружающую среду или соседней соте, и оба хоста и возбудитель остаются жизнеспособными ^{5 -8.} Несколько исследований пытались понять молекулярные механизмы, лежащие в этом взаимодействии, но мы до сих пор не имеют полное представление о том, что движет этим явлением.

Возможность захвата изображения в режиме реального времени, а затем впоследствии проанализировать несколько инфицироватьред макрофаги позволяет ответить на многие вопросы о физических свойствах окружающих не-литическую экзоцитоз в отношении сроков, пространственного потенциала, изменения в морфологии и даже стресс макрофагов во грибковой инфекции. По позволяя клеткам быть размещены в среде, которая сравнима с инкубатора, мы можем увидеть динамическую природу макрофагов-грибковые взаимодействий клеток. Исследователи использовали эту технику для изучения различных компонентов этого процесса. Роль фагосомы в этом процессе было сделано очевидным использованием флуоресцентного окрашивания и актин блокаторов ^9, в то время как другая группа использовал этот метод, чтобы показать, что не-литический экзоцитоз был заблокирован в клетках, которые имели WASH нуклеирующий белковых доменов удален ^10. Эффект цитокинов сигнализации также было установлено при помощи в режиме реального времени микроскопии ^11. Этот процесс не ограничивается C. neoformans, как это наблюдалось также с Candida Albicans, соседнийг грибкового патогена, который имеет возможность инфицировать макрофаги ^12. Эти данные приведены примеры, как этот метод может обеспечить большой объем информации в области, которую мы так мало знаем о.

Protocol

Все животное работа была сделана в соответствии с правилами и руководящими принципами Института исследования животных на колледже Альберта Эйнштейна медицины.

1. Условия рост C. neoformans H99 (Серотип)

1. Вырастить индивидуальный C. neoformans (Сп) колонии на агаре Сабуро пластин.
2. За день до эксперимента, выберите один колонию и привить 10 мл Сабуро бульоне.
3. Разрешить культуры расти в течение ночи при 37 ° С встряхивании со скоростью 250 оборотов в минуту.

2 Выделение и подготовка первичной Bone макрофагов от C57 / BL6 Мыши

1. Усыпить мышей путем не помещая животное в CO ₂ камеры, пока не более дыхания. В качестве второго меры, цервикально вывихнуть шею перед началом вскрытия. Стерилизовать все тело с 70% этилового спирта.
2. Снимите обе бедренные кости и голени и место кости в стерильной среде DMEM.
3. Удалите излишки ткани и мышцы с помощью десиликатное салфетки, пока кости не полностью чистый.
4. Место только интактные кости в чашку Петри, содержащую 70% этилового спирта и инкубировали в течение 3 мин, чтобы убить микроорганизмы связанные с ними. Удалить кости и место в чашки Петри с стерильной среде DMEM.
5. Аккуратно вырежьте концы костей. Держите кость над пустой 50 мл коническую трубку помещают на лед и осторожно флеш 10 мл холодной DMEM с использованием G иглу 25 через каждую кость.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая мышь даст 4 кости (2 бедра, 2 Большеберцовые кости). Поэтому одна мышь должны давать примерно 40 мл клеточной суспензии.
6. Центрифуга клеточной суспензии при комнатной температуре в течение 10 мин при 650 х г в.
7. В течение этого центрифугированием, подготовки и фильтр стерилизуют макрофагов костного мозга питательной средой, которая состоит из DMEM, дополненной 20% L929, 10% фетальной телячьей сыворотки, 10% НКТЦ-109, 1% Pen-Strep, 1% HEPES, 1% L-глутамина , 1% заменимых аминокислот, 0,1% 2-меркаптоэтанол.
8. Ресуспендируют полученный осадок с 10 мл питательной средой. Проходят клеток suspensион через 70 мкм ячейки фильтра сорвать скопления клеток и удаления крупного мусора.
9. Plate 1 мл клеточной суспензии в 10 мл питательной средой в чашках Петри, которые указаны для использования культуры тканей (в общей сложности 10 пластин).
10. Разрешить клетки придерживаться при 37 ° С с 10% CO _2. Добавить 5 мл свежей питательной средой на 3 день 7 день, полностью заменить подающие СМИ и макрофаги готовы к использованию.
11. День до эксперимента, отсоединить макрофаги из пластины путем удаления питательной средой и добавить 5 мл нежной клетки зачистки реагента к пластине.
12. Инкубировать в течение 5-10 мин при температуре 37 ° С и удалить макрофаги с осторожно пипеткой.
13. Гранул клетки центрифугированием при 650 х г в течение 10 мин.
14. Ресуспендируют осадок в 1 мл питательной средой. Использование разбавление 1:20, рассчитать концентрацию макрофагов с помощью пипетки 10 мкл клеточной суспензии на гемоцитометре.
15. Использование 14 мм со стеклянным дном чашки Петри, плитыконцентрация 1 × 10 ⁵ макрофагов непосредственно на внутренней яме, которая держит максимум 200 мкл, так что будьте осторожны, чтобы не превышать этот объем, как показано на рисунке 4.
16. Разрешить клетки прилипать к стеклянной чашке Петри, поместив посуду в 37 ° C инкубаторе в течение 1 часа.
17. Добавить 1-2 мл подачи среде с LPS при концентрации 1 мг / мл и IFNg при 500 U / мл и позволяют клетки инкубируют в течение ночи.

3 Co-инкубацию с первичными макрофагах мышей и С. neoformans

1. В день эксперимента, удалить 1 мл на ночь, инокулированных культурой и осадок дрожжевых клеток центрифугированием в течение 5 мин при 420 х г в.
2. Вымойте клетки 3 раза стерильной PBS для удаления СМИ и внеклеточных Криптококковый продукты, как полисахарид глюкуроноксиломанну (GXM) на скорости и времени, упомянутого выше.
3. Ресуспендируйте осадок клеток в 1 мл стерильной PBS и сделать 1: 100 разбавления. Внесите 10 мкл тон разбавления на гемоцитометре и рассчитывать клетки. Добавить дрожжевых клеток при МВД 1: 5. Например, если есть 1 х 10 ⁵ макрофаги / хорошо, сделать клеточной суспензии из 5 х 10 ⁶ / мл Сп и добавить 100 мкл этого раствора на общую сумму 5 х 10 ⁵ Сп.
4. Добавить расчетный объем криптококковым суспензии клеток в 1 мл, питающих сред с антителом МКА 18B7 в концентрации 10 мкг / мл. Инкубируйте клеточной суспензии при комнатной температуре в течение 5 мин.
5. Удалить кормления СМИ от стеклянным дном чашки Петри и мыть 1x стерильной PBS. Добавить 100 мкл опсонизированного Сп непосредственно к хорошо.
6. Разрешить клетки инкубировать в течение 2 ч при 37 ° С с 10% CO _2.
7. После совместной инкубации, проверить под микроскопом, что макрофаги усвоили Сп. Чтобы считаться усвоены, криптококкового клетки четко следует рассматривать в пределах макрофагов.
8. Вымойте Петри 3x стерильной PBS, чтобы удалить и все extracellulaг Сп.
9. Добавьте 1-2 мл питательной средой без добавления МКА 18B7, а также создать микроскоп.

4 Визуализация Номера для литического Экзоцитоз в режиме реального времени Использующ Digital световой микроскопии

ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения этих экспериментов, микроскоп, который поставляется с прикрепленным инкубации камеры, которая включает CO ₂ доставку и отопление блок необходим.

1. Перед экспериментом, предварительно нагреть камеру инкубации в течение по крайней мере 30 мин до 37 ° С. Убедитесь, что СО ₂ аппарат считывает 5% в начале эксперимента.
2. Место стеклянным дном чашки Петри на микроскопа платформы, накрыть CO ₂ крышки, и закройте все двери, чтобы не гарантировать тепловые побегов.
3. Используя цели 10X с микроскопом в фазовом контрасте, сосредоточиться на четком области инфицированных макрофагов. На основе эксперимента, определить цели, используемую сколько макрофаги должны быть изучены.
4. Настройка микроскопа программное обеспечение к таке снимок на каждые 4 мин на срок 24 час.
5. Через 24 ч эксперимента будет достигнут к завершению, и в общей сложности 361 изображений будет были собраны. Экспорт эти изображения как .jpegs при сжатии 5%. Использование изображения J программное обеспечение, просмотреть изображения в виде визуальной Stack со скоростью 5 кадров в секунду. Если фильм необходимо рассматривать для публикации или презентации, сохранить его либо как .avi или .mov файла, в зависимости от формата лучше всего работает для зрителя.

Results

Изображения что этот метод производит могут быть проанализированы в различных способов сбора информации, окружающий то, что происходит после того, как клетки фагоцитоза С. neoformans. Как видно на рисунке 1, существует примерно 100 макрофаги, которые либо зараженного или неинфицированных. Каждый из этих макрофагов дает зрителю возможность учиться хозяин-патоген взаимодействия на очень микроскопическом уровне. Как Рисунки 2 и 3 показывают, существуют различные р...

Discussion

Здесь мы описали метод, посредством которого грибковые-макрофагов взаимодействия могут быть записаны и проанализированы в реальном времени в течение 24 час. Наша лаборатория использует этот протокол для изучения многих временных аспектов не-литической экзоцитоза и будет продолжать использовать в режиме реального времени микроскопии для установления морфологических компонентов, которые окружают этот процесс.

Для этого методика для получения идеальных результатов, особое внимание должно быть у...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sabouraud Dextrose Agar	BD	DF0109-17-1
Sabouraud Dextrose Broth	BD	DF0382-17-9
Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning Cellgro	10-013-CV
Фетальная сыворотка теленка (FCS)	Atlanta Biologicals	S12450
NCTC 109	Invitrogen	21340-039
Пенициллин-стрептомицин	Gibco	15140-122
HEPES Буфер	Corning Cellgro	25-060-Cl
Глутамакс	Invitrogen	35050-061
Заменимые аминокислоты	Corning Cellgro	25-025-Cl
2-меркаптоэтанол	Invitrogen	21985-023	Токсичный
3003 Культура тканей Чашки Петри	Fisher Scientific	08772E
CellStripper	Corning Cellgro	25-056-Cl
Mat-tek Чашки для культуры со стеклянным дном	MatTek	P35GC-1.5-14-C
LPS	Sigma	L3137
Мышь IFN-g	Roche	NC 9222016
mAb 18B7	Некоммерческое антитело, произведенное в нашей лаборатории
Axiovert 200M Микроскоп с инкубационной камерой	Zeiss