Методическая статья

Физиологические Записи и РНК Секвенирование Вкусовые придатков Желто-лихорадки комаров Комар желтолихорадочный

DOI:

10.3791/52088

⸱

30 декабря 2014 г.

 , 
1Agricultural Research Service, Henry A. Wallace Beltsville Agricultural Research Center, Plant Sciences Institute, Invasive Insect Biocontrol and Behavior Laboratory, United States Department of Agriculture

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование двух методов оценки экспрессии генов в крупных вкусовых придатков Комар желтолихорадочный, мы определили набор генов, предположительно, лежащих в основе нейронных ответов на горьких и отталкивания соединений, а определяется электрофизиологического исследования.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Электрофизиологическая запись потенциалов действия сенсорных нейронов комаров дает исследователям возможность заглянуть в химическое восприятие этих переносчиков болезней. Недавно мы идентифицировали горький чувствительный нейрон в лабеллуме самок Aedes aegypti, который реагирует на ДЭТА и другие репелленты, а также горький хинин с помощью прямого электрофизиологического исследования. Эти реакции вкусовых рецепторных нейронов побудили нас к секвенированию общей мРНК из образцов лабеллы и лапок как мужского, так и женского пола, чтобы выяснить предполагаемые гены химиорецепции, экспрессируемые в этих контактных тканях химиорецепции. Образцы лапок были разделены на про-, мезо- и метаторакальные подтипы для обоих полов. Затем мы проверили наш набор данных, проведя qRT-PCR на тех же образцах тканей, и использовали статистические методы для сравнения результатов между двумя методами. Исследования, посвященные молекулярной функции, теперь могут быть нацелены на конкретные гены, чтобы определить те, которые участвуют в восприятии репеллента комарами. Эти рецепторные пути могут быть использованы для скрининга новых репеллентов, направленных на нарушение поведения, направленного на поиск хозяина, чтобы обуздать распространение вредных вирусов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Соединения, как DEET, Picaridin, цитронеллаль и IR3535 было показано, что эффективно отпугивания комаров, в том числе важных переносчиков болезней Комар желтолихорадочный 1,2. Мы записываем потенциалы действия от сенсорных нейронов, связанных с конкретной вкусовой сенсилл для определения клеток, участвующих с москитной отталкивающей. В сочетании с выходным последовательности экспрессируются гены в этих тканях, мы можем выявить гены, скорее всего, посреднические ответов этих клеток, направленных на выявление новых соединений для улучшения возможностей для отпугивания.

Секвенирование РНК является мощным инструментом, быстро становится стандартом для отслеживания временных и пространственных изменений экспрессии генов. Секвенирование РНК анализы насекомых хемосенсорных придатков и органов были использованы для выявления молекулярные рецепторы в нескольких видов насекомых 3-5, значительно улучшая на обычной ПЦР на основе поисков гена геном 6. Насекомые представляют собой наиболее разнообразную класс животных, предварительноляющих много возможностей изучать связь между генами и уникальных фенотипов. Секвенирование РНК технология может быть использована на любой живой насекомых ткани. Кроме того, электрофизиологические записи от сенсорных клеток в вкусовой uniporous сенсилл может быть достигнуто во многих различных видов насекомых. Спаривание этих двух методов позволяет исследователям сузить набор генов, участвующих в наблюдаемой хемосенсорной фенотипа. Различные виды представит конкретные проблемы, но может сообщить связь между хемосенсорных рецепторных генов и адаптации хемосенсорной. Размер и морфология хемосенсорной сенсилл является переменной и может потребовать ремонта ошибок при записи потенциалов действия, чтобы снизить уровень шума и определить повторяющиеся сигналы. Вскрытия хемосенсорного органов может быть тривиальным или деликатный и требует много времени, в зависимости от морфологии и размера насекомого. Восстановление из высококачественной РНК может потребовать их устранению, а также, например, избегая определенных пигментов воКоллекция тканей.

В то время как демонстрации влияния отталкивающих соединений через поведенческих испытаний является прямым и информативным, этот подход затрат времени и широкое по отношению к механизму действия. Электрофизиологии в сочетании с Секвенирование РНК позволяет более конкретных анализов, что движет уклонения от поведения насекомых. После того, как "инструментарий" химической дискриминации были выявлены в видов насекомых, более конкретные попытки улучшить известные репелленты возможно. Рецепторы и связанные с ними белков в чувствительных клетках, ответственных за эти поведения могут быть выражены гетерологично для непосредственного химического скрининга. Кроме того, молекулярное моделирование может предсказать, какие химические вещества будут вызывать сильные реакции от этих рецепторов 7.

Снимок всех активных генов в узком наборе хемосенсорных тканей также могут быть полезны в идентификации подобных генов у других видов. Использование гомологию последовательности и выражения сиmilarities, исследователи могут сформировать наборы молекулярных рецепторов, скорее всего, посреднических ответов на репеллентов, которые в целом эффективным против насекомых. Мы приведем следующий протокол, чтобы помочь исследователям в деконструкции насекомых хемосенсорных пути и убедить более углубиться в Нейроэтология не-модели и экономически важных насекомых.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Разведение Ae. Aegypti взрослых

  1. Высиживают яйца в приблизительно ¾ дюйма воды в мелководных лоток. Перенаселение приведет к сокращению размера взрослых.
  2. Задняя личинки при 25 ° C (12-HL: 12-HD), а накормить землю корма для рыб.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перекармливание может снизить уровень выживаемости.
  3. Удалить куколки индивидуально пипетки Пастера в день и передать пластиковой посуды (9 см х 5,5 см) внутри небольших ведрах по сдерживанию с мелкими крышками сетки, создав таким образом 24 ч возрастным группам.
  4. Кормовые взрослых комаров 10% раствор сахарозы с ватным тампоном размещенных как на экране стенах корпуса сепаратора комары в климатическую камеру при 27 ° С и 70% относительной влажности, при одной и той же фотопериода как личинок.
  5. Для электрофизиологии, используйте 5-10 день старых животных. В общем, крупные животные будут лучшие результаты. Для выделения РНК, используют животных, которые находятся в одном 24 ч возрастной группировки в 5-10-дневного возраста диапазона.

2. Подготовка химических веществ

  1. Определить подходящую концентрацию электролита (например, 1-10 мм), которое вызывает минимальную активность в отдельных сенсорных нейронов. 10 мМ NaCl или 1mm KCl разумные электролиты контрольного испытания активности, когда начинают эксперимент.
  2. Растворите каждой экспериментальной химического вещества в подходящем растворителе (если не вода, употреблять этанол или ДМСО), который имеет мало или вообще не влияет на импульсной активности по сравнению с электролит в одиночку. Конечные концентрации 10% этанола или 1% ДМСО разумные исходные концентрации.
  3. Выберите соответствующий (например, хинин горьким или сахарозы в течение Sweet) химических средств, которые хорошо описанных кормления сдерживающие факторы или стимуляторы насекомых.

3. электрофизиологии (совет записи 8, рисунок 1)

  1. Форма стеклянные электроды механически вытягивать стеклянные капилляры. Оптимизация тепло и тянуть настройки, чтобы вытащить стекло, чтобы сформировать соответствующую форму recordiнг электроды. Осторожно разорвать конец стеклянного электрода с помощью щипцов при вскрытии микроскопом, чтобы создать кончик электрода отверстие, которое является достаточно широким, чтобы конверт целевой сенсиллу, но достаточно малы, чтобы избежать контакта с соседними структурами.
  2. Под микроскопом, визуально определить по морфологии и положение цели сенсилл / сенсиллу, чтобы обеспечить повторяемость записи наконечника. Подготовительные животные для обеспечения свободного доступа к сенсилл от угла влета электрода.
  3. Холодные анестезии взрослых насекомых в морозильной камере при -20 ° С. Избегайте повреждения периферических нейронах Нахождение в холодных температурах. Вырезать узкие полоски скотча с лезвием бритвы на стекле. Остановите все насекомое на стекле с использованием узких полос.
  4. Вставка химически заостренный вольфрамовой проволоки в спинной грудной клетки или глаза в качестве индифферентного (земля) электрода.
  5. Заполните стеклянный электрод, выполненный в шаге 3,1 с стимулирующие решения интересов. Использование вставлен шприц, крышку заливной горловиныIllary от вытащил конца, чтобы тупой конец. Флик все пузырьки воздуха, держа вытащил конец вниз. Вставьте серебряную проволоку (хлорирующим дополнительный) в стеклянный электрод сделали в шаге 3.1 в качестве записи и стимулирующего электрода.
  6. Подключите электроды к предусилителя, который предназначен для записи от контакта chemoreceptive сенсилл в насекомых. Это предусилитель (300 Гц-3 кГц полосовой фильтр) позволит сократить время установления для захвата активность нейронов как можно ближе к стимул введение насколько это возможно. Сбор, хранение и анализ электрических сигналов с использованием микрокомпьютера, оснащенный программным обеспечением для записи шип.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Заземление установки записи должным образом, может существенно улучшить отношение сигнал-шум.
  7. Стимулировать сенсиллы с контрольным раствором (только электролита), чтобы обеспечить функциональность. Граф шипы, начиная 200 мс следующие стимула артефакт для всех препаратов.
  8. Случайный порядок испытаний химических веществ для всех экспериментов, за исключением исследований доза-реакция,устранить перекос. Для исследований доза-ответ, чтобы подвергнуть сенсиллы возрастающих концентраций химических экспериментальной. Разрешить минимум 3 минуты между раздражениями, чтобы обеспечить адекватное восстановление.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это требование может варьироваться в зависимости от насекомых и сенсилл. Порог определяется как концентрации, для которых стандартная ошибка не перекрывается с стандартной ошибки для самой низкой испытанной концентрации.

4. Выделение РНК и секвенирование (рис 2)

  1. Подготовьте подогнанных РНКазы пестики охлаждением их на сухом льду до ткани disruption.Prepare сопровождающих РНКазы пестики, которые соответствуют оснастки крышки пробирки плотно. Держите сбора трубки закрыт, если активно рассечения, чтобы избежать образования конденсата.
  2. Использование отфильтрованного аспиратор, место 30 до 40 холодного наркозом комаров (15 сек в -20 ° C морозильнике) на холодной сцене и сортировать по полу. Место животные спинной стороной вниз, захватывая крылья, чтобы не повредить вкусовые придатки.
  3. Использование двух пар тонких щипцов, анализировать парных Labella или лапки из мужчин и женщин при вскрытии микроскопом и ограничить включение соседних тканей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 500 в паре Labella дает примерно 800-1000 нг тотальной мРНК. 400 индивидуальных лапки (5 сегментов, каждый) дают 1,200-1,800 нг тотальной мРНК.
  4. С одной паре задыхаясь-щипцы, слегка понять комаров хоботок просто проксимальнее LaBella подвергая внутренние стилеты. Использование другую пару коллекторно-щипцы, удалить Labella и добавить ткань в сторону холодной пробирку.
  5. С одной парой щипцов, слегка понять комаров ногу на стыке большой берцовой кости и первого членика лапки. Использование другую пару щипцов, удалить лапки и добавить ткань в сторону холодной пробирку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Примите во внимание типы клеток на границе желательные и нежелательные ткани. Хотя важно, чтобы ограничить включение соседних тканей, в равной степени важно, чтобы не пропустить части требуемой ткани. Фантастическиенал образец должен точно представлять всю орган интересов. Создать точную границу с щипцы, так что коллекция щипцы могут точно освобождению соскоблить или захват только нужную ткань.
  6. Периодически, спин вниз коллекцию пробирки на 0 ° C центрифуге при 9000 мкг в держать ткань в нижней части трубы. Если влага накапливается в коллекции трубок во время вскрытия, добавить 50 мкл холодного Trizol реагента, чтобы покрыть накопившийся ткани.
  7. Использование анти-смазыванию лаборатории маркера, четко обозначить один РНКазы 1,5 мл оснастки колпачок трубки для каждого типа ткани для коллекции. Использование 1,5 мл стойку трубки и жидкий азот, замораживание затем измельчить ткань в мелкий порошок (мелкие куски, если в TRIZOL). Повторить один раз. Довести общий объем триазол до 1 мл и ресуспендируют в грунтовые ткани на вортексе.
  8. Добавить 200 мкл хлороформа и тщательно перемешать. После 5 мин при комнатной температуре, спин вниз в центрифуге при 4 ° С и 11000 мкг в течение 15 мин. Внимательнодобавить водный слой непосредственно к геномной ДНК колонке фильтра. Спин вниз на 11000 х г в течение 5 мин. Добавить равный объем РНКазы 70% этанола, проточные и перемешать с помощью пипетки. Трансфер жидкости в колонну сбора РНК и продолжают экстракции РНК согласно инструкциям.
  9. Количественная и оценки чистоты общей РНК на точность спектрофотометра и заполните любым стандартным способом РНК последовательности.

5. Количественный RT-PCR Проверка РНК Секвенирование (Рисунок 3)

  1. Выбор, как много генов, как можно сравнивать относительные уровни экспрессии генов в динамическом диапазоне, как в предсказанной последовательности и обилие предполагаемой функции хемосенсорных гена.
  2. Дизайн пары праймеров для каждого гена-мишени для амплификации конкретной 100-180 пар оснований ПЦР-продукта. Исключить неспецифической амплификации GDNA путем обеспечения, по меньшей мере один праймер за множества охватывает интрона границу. Кроме того, использование лечение ДНКазы, чтобы уменьшить геномной загрязнения.
  3. Собиратьткани насекомых, как описано в предыдущем разделе. Посчитайте, сколько ткани необходимо для обеспечения достаточного РНК завершить все реакции Qrt-ПЦР.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Биологическая трех экземплярах и реакции технические тройные обеспечит максимальную уверенность в результатах.
  4. Рассчитать относительную гена количественное определение X цели - (Ct [цель] -ct [ссылка]) для каждого гена-мишени и в среднем для каждого повторить, как биологических, так и технических. Используйте ген (ы) Уборка нормализовать значения Ct между биологических повторяет и укоренить масштаб Y-ось в сравнении относительном выражении.
  5. Оценка сходство Секвенирование РНК и Qrt-ПЦР наборов данных с использованием регрессии, на основе начальной загрузки процедуру эквивалентности 9, итерационно применяться, чтобы данные из каждой ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура определяет наименьший «Регион сходства", которые могут быть построены вокруг наблюдаемого Секвенирование РНК и Qrt-PCR данных и позволяют выражение относительной гена, измеряется qRT-ПЦР следует рассматривать статистически эквивалентно измерению экспрессии гена относительной РНК-SEQ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В след записи потенциалов действия из Ae. Aegypti вкусовые сенсиллы (Рисунок 1) продемонстрировать эффективность прямой стимуляции с диапазоном химических веществ. Этот метод может быть использован для количественной оценки ответов на любой стимулирующий химических путем подсчета шипы заданной амплитуде и длительности в течение разумного интервала времени (как правило, менее 500 мс). Трассировка записи должны быть легко воспроизводимы при данном наборе условий эксперимента. В противном случае, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наиболее сложным аспектом потенциалов действия записи из вкусовой сенсилл решает, какие ответы "нормально". При использовании одного наконечника вкусовые сенсиллу записи в первый раз для данного вида насекомых, общее количество и чувствительности вкусовых нейронов рецепторов (GRNs) являются вероятно, неизвестно. Многие предварительные записи необходимо сначала решить ряд и концентраций химических веществ, чтобы проверить. В этом случае, мы начали с наблюдения, что единственный GRN ответил на низких концентраци...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Брайана Т. Виньярда из Министерства сельского хозяйства США, Службу сельскохозяйственных исследований Генри А. Уоллеса в Белтсвилле, Биометрическую консультационную службу, Белтсвилл, штат Мэриленд, за статистический анализ. Эта работа была частично поддержана грантом для J.C.D. в рамках Исследовательской программы по защите развернутых боевых истребителей (DWFP), финансируемой Министерством обороны через Совет по борьбе с вредителями вооруженных сил (AFPMB).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Стеклянный капиллярA-M Systems628000Standard, 1,5 мм X 0,86 мм, 4"
Серебряная проволокаA-M Systems7875.015" неизолированная
вольфрамовая проволокаAlfa Products369диаметр 0,127 мм
Тонкие щипцыFine Science Tools11252#5SF Нержавеющая
рефрижераторная сценаBioQuip Products1429Chill Настольный
предусилитель Предварительный усилительSyntechTaste Probe
Программное обеспечение для электрофизиологииПрограммное обеспечение SyntechAutospikeдля электрофизиологии
TetraMin Корм для рыб TetraMinГранулыкорма для тропических рыбкорм для рыб измельченный до мелкого порошка
TRIzolLife Technologies15596-026Реагент для выделения РНК
RNeasy Plus Мини-наборQiagen74136включает в себя элиминатор гДНК и спиновые колонки RNeasy
спектрофотометр Nano Dropпродукты Nano Dropнастольный спектрометрND-1000
, бесплатное программное обеспечение для статистики R(создано Робертом Джентльменом и Россом Ихакой)www.r-project.orgИспользуйте функцию lm пакета stats и функцию equiv.boot пакета эквивалентности в вычислительной среде R.
Штатив для пробирок 1,5 млEvergreen240-6388-030Налейте жидкий азот в несколько пустых лунок для замораживания и измельчения тканей.
Пробирки для сбора 1,5 мл с пестикомGrainger6HAX6РНКаза не содержит РНКазы
ЦентрифугаThermo Scientific11178160Отжим замороженную ткань для хранения на дне пробирки объемом 1,5 мл.
Primer-BLAST Грунтовка Инструмент для проектирования NCBIн/д
, , ,

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klun, J. A., Khrimian, A., Debboun, M. Repellent and deterrent effects of SS220, picaridin, and DEET suppress human blood feeding by Aedes aegypti, Anopheles stephensi, and Phlebotomus papatasi. J. Med. Entomol. 43 (1), 34-39 (2006).
  2. Dickens, J. C., Bohbot, J. D. Mini review: Mode of action of mosquito repellents.Pestic. Biochem. Physiol. 106 (3), 149-155 (2013).
  3. Pitts, R. J., Rinker, D. C., Jones, P. L., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Transcriptome profiling of chemosensory appendages in the malaria vector Anopheles gambiae reveals tissue- and sex-specific signatures of odor coding. BMC Genomics. 12 (271), (2011).
  4. Zhou, X., Slone, J. D., Rokas, A., Berger, S. L., Liebig,, et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLOS Genet. 8 (8), e1002930(2012).
  5. Shiao, M., Fan, W., Fang, S., Lu, M. J., Kondo, R., Li, W. Transcriptional profiling of adult Drosophila antenna by high-throughput sequencing. Zoological Studies. 52 (42), (2013).
  6. Bohbot, J., Pitts, R. J., Kwon, H. W., Rützler, M., Robertson, H. M., Zwiebel, L. J. Molecular characterization of the Aedes aegypti odorant receptor gene family. Insect Mol. Biol. 16 (5), 525-537 (2007).
  7. Kain, P., Boyle, S. M., Tharadra, S. K., Guda, T., Pham, C., et al. Odour receptors and neurons for DEET and new insect repellents. Nature. 502 (7472), 507-512 (2013).
  8. Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. The physiology of a primary chemoreceptor unit. Science. 122 (3166), 417-418 (1955).
  9. Robinson, A. P., Duursma, R. A., Marshall, J. D. A regression-based equivalence test for model validation: shifting the burden of proof. Tree Physiol. 25 (7), 903-913 (2005).
  10. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-seq. Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
  11. Trapnell, C., Williams, B. A., Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).
  12. Sanford, J. L., Shields, V. D. C., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Naturwiss. 100 (3), 269-273 (2013).
  13. Sparks, J. T., Vinyard, B. T., Dickens, J. C. Gustatory receptor expression in the labella and tarsi of Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 43 (12), 1161-1171 (2013).
  14. Kent, L. B., Walden, K. K. O., Robertson, H. M. The Gr family of candidate gustatory and olfactory receptors in the yellow-fever mosquito Aedes aegypti. Chem. Senses. 33 (1), 79-93 (2008).
  15. Ramsköld, D., Wang, E. T., Burge, C. B., Sandberg, R. An abundance of ubiquitously expressed genes revealed by tissue transcriptome sequence data. PLoS Comput. Biol. 5 (12), e1000598(2009).
  16. Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. A model based criterion for gene expression calls using RNA-seq data. Theory Biosci. 132 (3), 159-164 (2013).
  17. Hart, T., Komori, H. K., LaMere, S., Podshivalova, K., Salomon, D. D. Finding active genes in deep RNA-seq gene expression studies. BMC Genomics. 14 (778), (2013).
  18. Isono, K., Morita, H. Molecular and cellular designs of insect taste receptor system. Front. Cellu. Neurosci. 4 (20), 1-16 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи