Целью данной презентации является демонстрация в естественных условиях и в пробирке методов выращивания энтомопатогенные нематод. IN VIVO методы рассмотреть выращивание этих нематод с войском насекомых, в то время как методы в пробирке использовать богатый агар СМИ.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В естественных условиях и в пробирке разведение энтомопатогенных нематод (Steinernematidae и Heterorhabditidae)
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Энтомопатогенные нематоды (EPN) (Steinernematidae и Heterorhabditidae) имеют мутуалистических партнерство с грамотрицательных Гамма-Proteobacteria в семье энтеробактерий. Xenorhabdus бактерии, связанные с steinernematids нематод в то время как Photorhabdus являются симбионтами heterorhabditids. Вместе нематоды и бактерии образуют мощный инсектицидный комплекс, который убивает широкий спектр видов насекомых в интимной и конкретного партнерства. Здесь мы демонстрируем в естественных условиях и в пробирке методов, обычно используемых в воспитании этих нематод в лабораторных условиях. Кроме того, эти методы представляют собой ключевые шаги для успешного создания EPN культур, а также стать основой для других биопроб, которые используют эти организмы для исследований. Производство aposymbiotic (симбионтов бесплатный) нематод часто решающее значение для углубленного и комплексного подхода к изучению симбиоза. ЭтоПротокол не требует добавление антибиотиков и может быть выполнена в течение короткого периода времени со стандартным лабораторным оборудованием. Нематоды, полученные таким образом, являются относительно надежными, хотя их выживаемость при хранении может изменяться в зависимости от вида используемых. Методы, описанные в этой презентации соответствуют описанным различными авторами и уточнена лаборатории П. складе в, Университет Аризоны (Тусон, Аризона, США). Эти методы отличаются от тела методов, которые используются в массовом производстве этих организмов в целях борьбы с вредителями.
Введение
Энтомопатогенные нематоды (EPN) Steinernema и Heterorhabditis SPP. (Steinernematidae, Heterorhabditidae) и их бактериальных симбионтов, Xenorhabdus и Photorhabdus SPP (Enterobacteriaceae) считаются возникающим модель наземное животное-микроб симбиотических отношений 2-4,6,10,19. Xenorhabdus и Photorhabdus SPP. которые питал как симбионтов в кишечнике только свободно живущих стадии нематод, также известный как инфекционного несовершеннолетнего (IJ) или 3-м этапе инфекционного несовершеннолетних 8,10,13. Пара бактерия-нематода является патогенным для широкого круга насекомых и успешно реализуется в биологический контроль и программ по всему миру 6,8 комплексной борьбы с вредителями.
Здесь мы показываем выбор в естественных условиях и в пробирке методов, которые часто осуществляемой для выращивания EPN в лабораторных условиях. Iн методы естественных условиях созерцать множество насекомых для выращивания нематод. Обычно, незрелые этапы различных отрядов насекомых (т.е. Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, и т.д..) Считаются подходящими хозяевами. В естественных условиях методы обычно рассматриваются для поддержания нематод культур в лаборатории. Этот метод не может быть пригодным при рассмотрении массовое производство нематод. Большие количества насекомых хозяев может потребоваться для этой цели, требующей больше времени и дополнительных расходов, связанных с насекомыми воспитания.
Энтомопатогенные нематоды также можно культивировать в пробирке на нескольких носителях. В зависимости от цели исследования, в методах пробирке может или рассмотреть включение симбиотических бактерий в средствах массовой информации. В этой презентации мы опишем два наиболее часто используемых методов для распространения EPN. Ингредиенты СМИ являются источником питательных веществ для симбиотической бактерии аметоды й источник стериновый для нематод. В пробирке дают преимущество в основе воспитания EPN без хозяина насекомых.
Первоначально, многие СМИ в пробирке развитого были использованы для размножения EPN, когда подходящие насекомых хозяева отсутствуют. Тем не менее, в течение последних лет, в пробирке методы выращивания стали широко использоваться в научных исследований, направленных понять мутуалистических отношения между EPN и их симбиотических бактерий 17,19.
Методы, описанные в этой презентации соответствуют описанным различными авторами и уточнена фондовой лаборатории университета Аризоны (Тусон, Аризона, США). Эти методы отличаются от тела методов, которые используются в массовом производстве этих организмов в целях борьбы с вредителями.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1 В естественных условиях Разведение энтомопатогенных нематод с их Symboitic бактерий
- Обратить 100 х 15 мм пластиковый чашку Петри и поставить два диска фильтровальной бумаги (90 мм) в крышке блюдо.
- Равномерно распределить 1 мл на IJ (инвазионных личинок) водной суспензии (в концентрации 1000-2000 IJ / мл) на фильтровальной бумаге.
Примечание: ИЮ не должны быть поверхность стерилизуют. - Добавить 10 последнего возраста личинок большей waxmoth Galleria MELLONELLA к блюду. Цель состоит в том, чтобы обеспечить примерно 100-200 IJS / личинку.
- Накройте крышкой с нижней части чашки Петри (рисунок 1) и напишите на чашку Петри. Упоминание следующую информацию: название вида нематод (если известно); изолировать код / обозначение; Дата инфекция ловушка была установлена.
- Поместите блюдо внутри свободно запечатанный пластиковый пакет (чтобы сохранить влажность) и держать его в темноте при любом комнатной температуре или в термостате между 20-25 ° C. Проверьте блюда ежедневно
ПРИМЕЧАНИЕ: Тьма облегчает нематод инфекции, как он имитирует природные условия инфекции в почве. - Через 3-5 дней, удалить трупы с признаками нематоды инфекции в модифицированной Белого ловушку 7.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если трупы запах гнилостный, это может быть признаком того, что культивирование не была успешной и / или было загрязнение. Установка нового инфекции камеру с новой порцией нематод и насекомых.
2 В пробирке Разведение энтомопатогенных нематод с их симбиотические бактерии
- Печень-почки Агар Метод 9,19
- Чоп печень и почки на мелкие кусочки (2 см 3 или меньше) и поместите в блендер с NaCl, агар и 300 мл воды и смешать, пока мясо не станет жидкой пульпы, густой пасты или пюре. Затем смесь передачи в колбу Эрленмейера 1 л.
- Добавить окончательные 200 мл воды в блендере судна и сцеживать все оставшиеся средства массовой информации вКолба Эрленмейера. Автоклав в течение 15 мин при 121 ° С. После обработки в автоклаве позволяют агар для охлаждения прикоснуться перед заливкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пипетирование среде не рекомендуется, поскольку эта среда, как правило, имеют куски мяса. - Налейте ~ 20 мл агара на 5 (или 6) см чашки Петри при перемешивании рука или вращая колбу между наливает для более однородной СМИ. Разрешить агар затвердевать и сохранять блюда при 4 ° С, пока не понадобится
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пламени стерилизовать металлический шпатель, чтобы разрушить любые большие куски мяса выливают в чашку Петри.
- Липидов Агар Метод 9,19
- Подготовьте липидов агаровой среды путем смешивания питательный бульон, агар и дрожжевой экстракт и залить смесь в колбе 2 л Эрленмейера. Добавить дистиллированной H 2 O и MgCl 2 • 6H 2 O и автоклав в течение 15 мин при 121 ° C.
- Добавить стерильную смесь кукурузного масла и кукурузный сироп смеси и перемешивают энергично или вихревой и часто, чтобы разогнать капель масла равномерно.
Примечание: стерилизацию кукурузное масло и сироп, поместив необходимый объем в УФ поперечно-сшивающего агента. Масло не растворяется в жидкости, но убедитесь, что он находится в мельчайших капелек. - Налейте ~ 20 мл агара на 5 (или 6) см чашки Петри и позволяют агар затвердевать и сохранять блюда при 4 ° С до использования.
- Подряд желаемый симбиотических бактерий на липидный агаром и инкубировали планшеты при 28 ° С в течение 24-48 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Распространение 100-200 мкл в течение ночи (12-16 ч) LB субкультуры. - На следующий день после, добавить примерно 0,4 мл поверхности стерилизовать нематод суспензии (яйца или инвазионных личинок) и инкубировать пластин при комнатной температуре в темноте или в инкубаторе при 22 ± 3 ° С.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте больше 0,4 мл нематод подвески, как это может создать слишком влажную среду, которая неблагоприятна для роста нематоды. - Daily Monitor культур. Культуры должны производить новое поколение IJS в около 12 дней (рисунок 2).
- Передача нижнюю тарелку с агаром, когда нематоды видно искателем стороны посудомоечной (фиг.3А) к модифицированному Белый ловушку (см Orozco и соавт. 12) для сбора IJS (фиг.3В). Выполните этот шаг под ламинаре по снижению загрязнения СМИ.
- Соберите IJS из модифицированного Белого ловушку при выходе и промыть IJ подвеску для удаления среднего мусора. Магазин И.Я. в стерилизованной дистиллированной воды при 10 ° С (в холодной температуры инкубатора или холодной комнате), или, если это необходимо использовать немедленно.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от цели исследования, семян тарелки с либо симбионтов-колонизировали или aposymbiotic нематод.
3 В пробирке Разведение Aposymbiotic (Symbiont-бесплатно) Энтомопатогенные Нематоды
- Инфекция 10-20 G. MELLONELLA личинки с IJS желаемых видов нематод (смотри раздел 1). После 3 или 4 дня (в это время IJs должны созреливзрослым первого поколения) собирать трупы.
ПРИМЕЧАНИЕ: время зрелости и число женщин, необходимых для получения достаточного количества яиц будет варьироваться в зависимости от вида. Заражать больше G. MELLONELLA личинок при необходимости и начать вскрытия еще в 48 ч после заражения, чтобы оценить, являются ли они в правильном стадии развития. - Место каждого трупа по отдельности в чашке Петри с физиологическим раствором (M9 буфера 18). Проанализируйте трупа, потянув голову с тонким наконечником пинцетом.
- Соберите по крайней мере, 20 беременных (с яйцами внутри) женщин с тонкой иглой (L-формы предпочтительно) и поместите их в часовое стекло, содержащую 10 мл M9 буфера (4А).
- Подготовка раствора axenizing с учетом следующих ингредиентов: 6,75 мл дистиллированной воды, 1,25 мл 5 N NaOH и 2,25 мл коммерчески доступного раствора хлорной извести, разбавленный до 3% раствором гипохлорита.
ПРИМЕЧАНИЕ: NaOH является основным решение перчатки, защитные очки и другую соответствующую защитнуюодежда должна носиться.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовить свежие решения axenizing каждый раз, как отбеливатель деградирует в свете. Подготовьте несколько партий axenizing решения и выполнять стерилизацию поверхности и сбор яиц в нескольких часовых стекол. - Промыть самок по крайней мере, три раза буфером M9 заполнения часового стекла с буферным раствором и всасывающей буфер с помощью пипетки. Убедитесь, что самки остаются в часовое стекло. Повторите этот шаг еще два раза.
- Сразу добавить axenizing решение и позволить самки оставаться в этом растворе в течение не более 10-15 мин. Соблюдайте нематод ткани начинают распадаться в то время как яйца (которые устойчивы к axenizing решения) остаются нетронутыми.
- Вручную нарушить женские тела, чтобы ускорить процесс, сокращая их с помощью иглы или скальпеля (Рисунок 4B, C). Удалить яйца с помощью пипетки их в 1,5 мл микропробирок, избегая добавления нерастворенный ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование в качестве млюбые микроцентрифужных трубки по мере необходимости, чтобы собирать яйца, и работать быстрее, так как жизнеспособность иц будет уменьшаться в течение длительного периода воздействия axenizing раствора. - Вихревые трубки для 15 сек с помощью "высокоскоростной установку" для дальнейшего удаления нематод ткани, прикрепленные к яйцам. Или же, если вихрь недоступен, пипетки вверх и вниз Решение несколько раз.
- Гранул яйца центрифугированием при приблизительно 18000 г в течение 2 мин. Увеличить скорость, если яйца не достаточно осадок. Удалить axenizing решение и промыть два раза, заполнив микроцентрифужную пробирку стерильной дистиллированной водой и центрифуги еще раз на 900 мкг в течение 1 мин.
- После последней промывки ресуспендируйте яйца в 300-500 мкл стерильной дистиллированной воды и поместите их в стерильной 3 см чашки Петри или стерилизованного часовым стеклом. Следует помнить, что яйца теперь поверхность стерилизуют, таким образом, использовать стерильные пипетки и / или советы pippetter и воду, чтобы поддерживать чистоту яиц.
- Изучите яйца под микроскопом рассекает (30-50X увеличения), чтобы подтвердить, что они целы (Рисунок 4D) и передавать их на 5 см пластины с агар печени почек (см раздел 2.1)
ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте более 400 мкл яичной суспензии на пластинах, как это сделает агар чрезмерно влажным. - Лейбл пластины с соответствующей информацией и хранить их в вертикальном положении в темноте при 28 ° C. Отрождение яиц должно быть очевидно ночь.
Примечание: Вода может конденсироваться на крышке чашки, но это будет испаряться после 1 или 2 дней. В это время, поместите блюдо в полиэтиленовый пакет, чтобы сохранить влагу агара и избежать ее высыхания. - Периодически Соблюдайте блюда и отбросить любые блюда, которые показывают признаки грибковой или бактериальной контаминации. После того, как ИЮ видны миграции вверх по стенке чашки Петри, снять крышку и передавать нижнюю тарелку с агаром с модифицированным Белый ловушку 12. Рассмотрим стерильных условий при передаче блюдо в modifieд Белый ловушка, чтобы избежать загрязнения открытой информации.
- Продолжить мониторинг Уайт-ловушек и урожая IJ мере необходимости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Aposymbiotic нематоды будет продолжать мигрировать в воду Белого ловушку в течение многих дней и даже недель.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Метод разведение в естественных условиях использует живых насекомых в качестве хозяев для роста нематоды и воспроизводства. Инфекция камеры представляют собой эффективный метод для раскрытия насекомых IJS. Это единственный этап в нематоды жизненного цикла, что векторы бактериальных симбионтов из одного насекомого хозяина к другому. Рисунок 1 показывает настроить для инфекции камеры, а также материалов, необходимых для создания этой камеры. В пробирке методы рогатый позволяют EPN расти ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Использование подходящего хозяина является ключевым фактором для успеха в естественных условиях выращивания EPN. Как правило, оба steinernematids и heterorhabditids может воспроизводить и успешно завершить свой жизненный цикл в личинок большей восковой моли, Galleria MELLONELLA (Lepidoptera: Pyralidae). Тем не менее, другие видов насекомых из разных семейств и / или заказов можно считать. Некоторые из описанных в настоящее время видов нематод, как известно, имеют специфичность в отношении конкретного...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить бывших членов складе лаборатории: Мин-Мин Ли, Кэтрин Plichta, Виктория Miranda-Томпсон и Сэм-Кю Ким за их вклад в улучшение многие из этих протоколов. Эта работа финансировалась в рамках гранта Национального научного фонда IOS-0840932 и IOS-0724978 С.П. складе
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Для In vivo Инфекции | |||
| 100 x 15 чашек Петри | VWR | 25384-088 | |
| Фильтровальная бумага, 9 см целлюлоза 1 сорта Ватман | /VWR | 28450-081 | Рекомендуется фильтровальная бумага 1 |
| класса Насекомые-хозяева | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | Galleria mellonella являются recommended |
| Для печени и почек Агар (для 500 мл) | |||
| 60 x 15 мм Чашки Петри | VWR | 25384-092 | |
| Говяжья печень, 50 г | Местное производство; мясник или супермаркет | Оставшееся можно хранить замороженным и размораживать впрок | |
| Говяжья почка, 50 г | Местное производство; мясник или супермаркет | Оставшееся можно хранить замороженным и размораживать для будущего использования | |
| Хлорид натрия 2,5 г (конечная концентрация 0,5%) | Acros/VWR | 200002-434 | любой исследовательский сорт NaCl может быть использован |
| агар, 7,5 г (1,5% агар, конечная концентрация) | HiMedia/VWR | 95026-642 | любой средний агар может быть использован |
| 500 мл дистиллированный H2O | |||
| Для липидного агара (на 1 л) | |||
| 100 x 15 чашек Петри | VWR | 25384-088 | |
| Питательный бульон, 8 г | BD/VWR | 90002-660 | |
| Экстракт дрожжей, 5 г | EMD/VWR | EM1.03753.0500 | |
| Гексагидрат хлорида магния 10 мл (0,2 г/мл) | EMD/VWR | EM-MX0045-1 | |
| Кукурузное масло, 4 мл | Любая марка | Местное происхождение; супермаркет | Можно использовать |
| любую марку кукурузного маслаКукурузный сироп, 96 мл соединить 7 мл кукурузного сиропа в 89 мл подогретого H2O и закрутить для однородности | Karo Locally sourced; супермаркет | ||
| Агар, 15 г | HiMedia/VWR | 95026-642 | любой среды можно использовать агар |
| дистиллированного H2O, 890 мл | |||
Ссылки
- Akhurst, R. J. Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes, Neoaplectana and Heterorhabditis. J. Gen. Microbiol. 121, 303-309 (1980).
- Dunphy, G. B., Webster, J. M. The monoxenic culture of Neoaplectana carpocapsae DD 136 and Heterorhabditis heliothidis. Revue Nematol. 12, 113-123 (1989).
- Boemare, N. Biology, taxonomy and systematics of Photorhabdus and Xenorhabdus. Entomopathogenic Nematology. Gaugler, R. , CABI Publishing. Wallingford. (2002).
- Boemare, N. E., Akhurst, R. A. The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. The Prokaryotes. Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -H., Stackebrandt, E. , Springer. New York, NY. 473-488 (2002).
- Ehlers, R. U., Wulff, A., Peters, A. Pathogenicity of axenic Steinernema feltiae. Xenorhabdus bovienii. and the bacto-helminthic complex to larvae of Tipula oleracea (Diptera) and Galleria mellonella (Lepidoptera). Journal Invertebrate Pathology. 69, 212-217 (1997).
- Gaugler, R., Kaya, H. K. Entomopathogenic Nematodes in Biological Control. Boca. , CRC Press. Raton, FL. (1990).
- Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes. Molecular Microbiology. 45, 1337-1353 (2002).
- Kaya, H. K., Gaugler, R. Entomopathogenic nematodes. Annual Review of Entomology. 38, 181-206 (1993).
- Kaya, H. K., Stock, S. P. Techniques in insect nematology. Manual of techniques in insect pathology. Lackey, L. A. , Academic Press. London. 281-324 (1997).
- Koppenhöfer, H. Bacterial Symbionts of Steinernema and Heterorhabditis. Entomopathogenic Nematodes: Systematics, Phylogeny and Bacterial Symbionts. Nguyen, K. B., Hunt, D. J. , Brill. Leiden-Boston. 735-759 (2007).
- Lunau, S., Stoessel, S., Schmidt Peisker, A. J., Ehlers, R. U. Establishment of monoxenic inocula for scaling up in vitro cultures of the entomopathogenic nematodes Steinernema spp and Heterorhabditis spp. Nematologica. 39, 385-399 (1993).
- Orozco, R. A., Lee, M., Stock, S. P. Soil sampling and isolation of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae). J. Vis. Exp. (89), (2014).
- Poinar, G. O. The presence of Achromobacter nematophilus in the infective stage of a Neoaplectana sp (Steinernematidae: Nematoda). Nematologica. 12, 105-108 (1966).
- Poinar, G. O. Jr, Thomas, G. M. Significance of Achromobacter nematophilus sp. nov. (Achromobacteriaceae: Eubacteriales) associated with a nematode. Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon. 15, 249-252 (1966).
- Sicard, M., Brugirard-Ricaud, K., Pagès, S., Lanois, A., Boemare, N. E., Brehéli, M., Givaudan, A. Stages of infection during the tripartite interaction between Xenorhabdus nematophila, its nematode vector, and insect hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70, 6473-6480 (2004).
- Sicard, M., Hinsinger, J., LeBrun, N., Pagès, S., Boemare, N., Moulia, C. Interspecific competition between entomopathogenic nematodes (Steinernema) is modified by their bacterial symbionts (Xenorhabdus). BMC Evolutionary Biology. 6, 68-78 (2006).
- Snyder, H., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. New insights into the colonization and release processes of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae. Applied and environmental microbiology. 73, 5338-5346 (2007).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. ed, C. .elegans.W. ormB. ook. , Available from: http://www.wormbook.org (2006).
- Stock, S. P., Goodrich-Blair, H. Nematode parasites, pathogens and associated of insects and invertebrates of economic importance. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. Lacey, L. A. , Elsevier. Yakima, WA. 373-426 (2012).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
