Методическая статья

Электронной микроскопии высокого разрешения из Helicobacter Pylori Cag Тип IV секреции Система Пили Выпускается в различных условиях железного Наличие

DOI:

10.3791/52122

⸱

21 ноября 2014 г.

 ,  , 
1Department of Medicine - Division of Infectious Diseases, Vanderbilt University School of Medicine, 2Tennessee Valley Healthcare Systems, U. S. Dept. of Veterans Affairs

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем метод визуализации онкогенной бактериальной органеллы, известный как система секреции Cag типа IV (Cag-T4SS). Мы обнаружили, что Cag-T4SS дифференциально образуется на поверхности H. pylori в ответ на различные условия доступности железа.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Helicobacter pylori - это спиралевидная грамотрицательная бактерия, которая колонизирует человеческую желудочную нишу половины человеческой популяции1,2. H. pylori является основной причиной рака желудка, второй по значимости причиной смертности от рака во всем мире3. Одним из факторов вирулентности, который был связан с повышенным риском желудочных заболеваний, является Cag-островок патогенности, область размером 40 кб в хромосоме H. pylori, которая кодирует систему секреции IV типа и родственную эффекторную молекулу CagA4,5. Cag-T4SS отвечает за транслокацию CagA и пептидогликана в эпителиальные клетки хозяина5,6. Активность Cag-T4SS приводит к многочисленным изменениям в клеточной биологии хозяина, включая повышение экспрессии цитокинов, активацию провоспалительных путей, ремоделирование цитоскелета и индукцию онкогенных клеточных сигнальных сетей5-8. Cag-T4SS представляет собой высокомолекулярную машину, состоящую из компонентов субсборки, охватывающих внутреннюю и внешнюю мембрану и простирающихся наружу от клетки во внеклеточное пространство. Внеклеточная часть Cag-T4SS называется «пилус»5. Многочисленные исследования показали, что Cag-T4SS pili образуются на границе хозяин-патоген9,10. Тем не менее, особенности окружающей среды, которые регулируют биогенез этой важной органеллы, остаются в значительной степени неясными. Недавно мы сообщали, что в условиях низкой доступности железа активность Cag-T4SS и биогенез пилуса увеличиваются. В данной работе мы представляем оптимизированный протокол выращивания H. pylori в различных условиях доступности железа до совместного культивирования с эпителиальными клетками желудка человека. Кроме того, мы представляем комплексный протокол визуализации гиперпилиатированного фенотипа, проявляющегося в условиях ограничения железа, с помощью сканирующей электронной микроскопии с высоким разрешением.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

H. pylori инфекция является значимым фактором риска развития рака желудка1. Тем не менее, исходы заболевания варьируются и зависят от множества факторов, таких как генетика хозяина, генетическое разнообразие штаммов H. pylori и элементы окружающей среды, такие как диетахозяина 11. В предыдущих исследованиях было установлено, что существует корреляция между инфекцией H. pylori, дефицитом железа (измеряемым снижением концентраций ферритина и гемоглобина в крови) и повышенной продукцией провоспалительных цитокинов, включая секрецию IL-8, что в конечном итоге приводит к увеличению прогрессирования заболеванияжелудка. Острая инфекция H. pylori также связана с гипохлоргидрией, которая ухудшает способность хозяина поглощать питательное железо и в конечном итоге приводит к изменениям в гомеостазе железа. Эти клинические данные свидетельствуют о том, что доступность железа в желудочной нише может быть важным фактором в исходе заболевания. Фактически, животные модели инфекции H. pylori продемонстрировали, что низкое потребление железа с пищей усугубляет желудочное заболевание. Пониженный уровень железа у этих животных требует, чтобы H. pylori индуцировала реакцию на приобретение железа для получения железа, необходимого для репликации бактерий. H. pylori обладает способностью нарушать транспортировку железа в клетках хозяина, способствуя репликации бактерий CagA-зависимым образом15. Интересно, что было показано, что остров патогенности cag регулируется железочувствительным транскрипционным фактором Fur16,17. Кроме того, штаммы Cag+ связаны с повышенным воспалением и желудочными заболеваниями, такими как рак1. Эти результаты подтверждают модель, в соответствии с которой H. pylori изменяет экспрессию Cag-T4SS с целью получения железа из клеток-хозяев, которые находятся в среде, обедненной железом, что приводит к усугублению исходов заболевания.

Два фактора, которые усиливают воспаление и заболеваемость, - это экспрессия Cag и низкое потребление железа с пищей. Эти факты подтверждают гипотезу о том, что снижение доступности железа увеличивает выработку Cag-T4SS pili на границе патогена хозяина, что приводит к ухудшению желудочного заболевания11-14. Целью метода, представленного в данной рукописи, является установление роли микроэлемента железа в регуляции биогенеза пилуса Cag-T4SS. В предыдущей работе мы использовали два подхода для наблюдения за железозависимым увеличением экспрессии Cag-T4SS. Во-первых, были проанализированы выходные штаммы от животных, содержащихся на диетах с высоким и низким содержанием железа, и было выявлено, что выходные штаммы с низким содержанием железа продуцировали больше Cag-T4SS pili, чем диетические штаммы с высоким содержанием железа14. Во-вторых, выращивание штамма H. pylori 7.13 in vitro в условиях, богатых железом, привело к снижению образования пили, в то время как клетки, выращенные в присутствии хелатора железа, производили значительно больше пили.

Мы продолжили исследование железозависимой регуляции фенотипа Cag-T4SS pili и предлагаем следующий оптимизированный протокол и репрезентативные результаты, выполненные с дополнительным штаммом Helicobacter pylori, PMSS1. Обоснование разработки этой методики заключалось в том, чтобы коррелировать повышенную активность Cag-T4SS в условиях ограничения железа с повышенным образованием пилуса Cag-T4SS. Более широкое применение и использование этого метода обеспечит оптимизированные условия культивирования, что приведет к повышенному производству пили Cag-T4SS. Этот анализ будет полезен исследователям, стремящимся определить состав и архитектуру Cag-T4SS путем обогащения этой важной особенностью бактериальной поверхности. Подготовка образцов и визуализация с помощью полевой эмиссионной электронной микроскопии имеет множество преимуществ по сравнению с альтернативными методами, такими как методы световой микроскопии для визуализации Cag-T4SS, и будет подходить для исследователей, заинтересованных в изучении регуляции этой органеллы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Х. пилори роста в различных условиях железного Наличие и сотрудничеству культуры с человека эпителиальных клеток желудка

  1. Выберите H. пилори штамм PMSS1 для этих исследований, поскольку она имеет неповрежденный CAG патогенности остров и выражает тип функционирования секреции IV систему. Также используют изогенного клетке мутант (PMSSI Δ клетку) в качестве отрицательного контроля. Выращивают бактерии на TSA пластин с добавлением 5% овечьей крови (чашках с кровяным агаром) в течение 24 ч при 37 ° С в присутствии 5% СО 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка реагентов и собрать материалы, как указано в материалы и оборудование таблице. Конечные концентрации для каждого реагента указан в скобках.
  2. Очистите бактерии из пластины, используя стерильный ватный-аппликатор и привить в модифицированной бруцелл бульона, приготовленного из компонентов (см Материалы и оборудование таблицу) и дополнена холестерина. Выдержите культур в течение ночи при 37° C в воздухе помещения, дополненной 5% CO 2 при встряхивании на 200 оборотов в минуту (RPM).
    Примечание: Холестерин используется вместо эмбриональной телячьей сыворотки из-за того, что сыворотка комплекс; содержащий многочисленные источники питательных веществ железа, таких как гема, который вызывает изменчивость в результатах.
  3. В день культивирования бактерий, семян AGS человека эпителиальных клеток желудка (АТСС CRL-1739) на поли-D-лизина, получавших покровные в 12-луночных планшетах (около 1 × 10 5 клеток на лунку).
  4. На следующий день, разбавленных бактериальные культуры к OD600 0,3 в модифицированной бруцелл отдельно или с добавлением 100 мкМ FeCl 3, 200 мкМ дипиридила (синтетический железо хелатообразующего агента), или 200 мкМ дипиридилом плюс 250 мкМ FeCl 3 бульоне. Эти культуры инкубируют в течение 4 часов при 37 ° С в комнатном воздухе, дополненной 5% CO 2 при встряхивании при 200 оборотах в минуту.
  5. Центрифуга бактерии в 1000 мкг для сбора клеток и удаления супернатантами до ресуспендированием Iп равный объем свежего модифицированный бруцелл бульона с добавлением холестерина. Мера OD 600 культуры (OD600 = 1,0 = 5,5 х 10 8 клеток / мл) и добавляют бактерии в эпителиальных клетках в множественности инфекции (MOI) 20: 1. Выполните серийные разведения и пластинчатые бактериальных клеток на чашках с кровяным агаром для оценки бактериальной жизнеспособности клеток.
  6. Выдержите H. пилори и AGS человека эпителиальных клеток желудка со-культуры в течение 4 ч при 37 ° С в присутствии 5% СО 2 в статических условиях перед выполнением сканирующей электронной микроскопии (SEM) подготовки образца.

2. SEM Подготовка образцов для визуализации H. пилори Cag-T4SS Пили

  1. Удалить H. пилори и AGS совместных культурах из инкубатора и переливать супернатанта культуры (за исключением IL-8 ELISA). Мыть осторожно три раза 0,05 М буфера какодилатном натрия (рН 7,4). Закрепить образцы в течение 2-4 часов при комнатной температуре в растворе 2,0% параформальдегида, 2,5% Глютаральдегида оболочки, и буфер какодилат 0,05 М натрия. После первичной фиксации, мыть образцы трижды буфером какодилатном 0,05 М натрия.
  2. Выполните вторичную фиксацию с помощью 0,1% тетроксид осмия в 0,05 буфера какодилатном М натрия в двух последовательных 10 шагов мин фиксации. После вторичного фиксации, мыть образцы трижды буфером какодилатном 0,05 М натрия.
  3. После первичной и вторичной фиксации, обезвоживают образцы путем последовательной промывки с возрастающими концентрациями этанола согласно Таблице 1.
  4. После этанола обезвоживания, выполнить три последовательных промыли жидкой двуокиси углерода. Тогда сухие образцы в критической точке, используя критическую точку сушилка машины при температуре 31,1 ° С и давлении 1073 фунтов на кв.
  5. Гора покровные на выборочных окурков алюминия SEM и рисовать тонкую линию коллоидного серебра на края образца для достижения соответствующего заземления и избежать зарядки во время съемки SEM.
  6. Образцы пальто с 5 нмзолото-палладий, используя распылением пальто машину, чтобы увеличить образец вторичный сигнал электронного и краевой эффект.

3. визуализации параметров для высокого разрешения SEM анализов

  1. Посмотреть образцы с автоэмиссионного Gun Сканирующий электронный микроскоп (FEG-SEM).
  2. Изображение в высоком вакууме режиме при рабочем расстоянии 5-10 мм.
  3. Установите ускоряющего напряжения до 5 кВ.
  4. Установить размер пятна до 2-2,5.
  5. Наклоните образец между 15-25 градусов для достижения лучшего обзора интерфейса хост-патогенных.
  6. Приоритетность визуализации бактерии прилипшие к краям эпителиальных клеток для просмотра большого увеличения, так как эти участки хост-патогена взаимодействия обогащены для Пили-образующих бактерий.

4. Статистический анализ для оценки Пили количественными

  1. Анализ H. пилори Cag-T4SS пили с помощью программного обеспечения ImageJ количественно число пилей / клетка, а также процентов клетки, обладающие piliated Phenotype согласно инструкциям ниже.
  2. Открытые файлы микрофотография в программном обеспечении ImageJ. Определить пили как структуры, образованные между бактериальной клетки и клетки-хозяина, с одинаковой ширины (10-13 нм) и длины (60-150 нм).
    Примечание: Структура пилуса присутствует на бактериальных штаммов дикого типа, но отсутствуют на изогенных штаммов, таких как Δ клетке мутантных штаммов, которые укрывают инактивацию в гене, кодирующем большую АТФазы, что силы типа секреции IV пилуса сборки.
  3. Калибровка инструмента измерения, рисуя линию с прямой инструмент линии, а затем, перейдя на вкладку "Анализ". Выберите "Set Scale" из выпадающего меню и введите значение бар увеличения в поле с надписью "известное расстояние" и установите единицу длины на соответствующую настройку (нм). Нажмите "OK".
  4. Измерьте Cag-T4SS пили использованием прямой инструмент линии рисовать по длине или ширине пили, а затем нажмите "Ctrl-M" для измерения каждого пилуса, Соблюдайте диалоговое окно с измеренным значениям. Запишите эти значения или скопировать и вставить в программу электронных таблиц.
  5. Используйте длину и ширину параметры ранее установленных 24, пренебрежение особенности, которые не вписываются профиля Cag-T4SS. Тогда определить число пили на основе ценностей, которые в 10-13 нм ширина и 60-150 нм длиной отключений.
  6. Анализ количественной оценки пили статистически т испытания двух Стьюдента с использованием программного обеспечения GraphPad Prism.

5. Дополнительно: Оценка IL-8 секреции соотнести с пилуса производства

  1. Использование супернатантами с шага 2.1, выполнить IL-8 ELISA соответствии с инструкциями изготовителя с комплектом (см Материалы и оборудование таблицу).
  2. Анализ IL-8, вырабатываемый клетками-хозяевами и рассчитать процентную IL-8 индукцию по WT PMSS1 выращенных в среде одиночку. Выполнить статистический анализ, используя двухстороннюю критерий Стьюдента, используя GraphPad Prism такftware.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом докладе, мы показали, что условия различной доступность железа имеют способность модулировать H. пилори Cag-T4SS пилуса биогенеза на границе хозяин возбудителя. При культивировании в среде без добавок, H. пилори образует в среднем 3 пили / клетку. Когда Х. пилори выращивается в железе истощить условия (с использованием синтетического хелатором дипиридила), которые к югу от подавляют рост бактерий (рисунок 1), бактерии производят многочисленные Cag-T4SS пили (~ 7 пили / ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Железо является важнейшим микроэлементом для большинства форм жизни, в том числе бактериальных патогенов. В целях ограничения жизнеспособности вторжения микроорганизмов, позвоночные хозяева секвестр питательных железо в процессе, известном как "питательной иммунитета" 18. В ответ на это, бактериальные патогены эволюционировали, чтобы использовать железо в качестве глобального сигнальной молекулы ощущать свое окружение и регулировать выработку особенностей вирулентности, таких как системы сбора желез...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано премией Департамента по делам ветеранов за развитие карьеры 1IK2BX001701 и премией CTSA UL1TR000445 от Национального центра развития трансляционных наук. Его содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального центра развития трансляционных наук или Национальных институтов здравоохранения. Эксперименты с сканирующей электронной микроскопией были частично проведены с использованием общего ресурса VUMC Cell Imaging Shared Resource при поддержке грантов NIH CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 и EY08126.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Модифицированный бульон
Пептон из казеина (10 г/л)Sigma70172
Пептический перевар тканей животных (10 г/л)Sigma70174
Дрожжевой экстракт (2 г/л)Sigma92144
Декстроза (1 г/л)SigmaD9434
Хлорид натрия (5 г/л)Thermo FisherS271-10
Холестерин (250X) (4 мл/л)Life Technologies12531018
Хлорид железа (100 или 250 мкМ)Sigma157740-100G
Дипиридил (200 мкМ)SigmaD216305-100G
Модифицированный RPMI
RPMI+HEPES (1X)Life Technologies22400-121
Фетальная бычья сыворотка ( 100 мл/л)Life Technologies10438-026
Препарат
Параформальдегид (2,0% воды)Электронная микроскопия15713
Глутеральдегид (2,5% воды)Электронная микроскопия16220
Какодилат натрия (0,05 M)Электронная микроскопия12300
Тетраоксид осмия (0,1% воды)Электронная микроскопия Науки19150
Этанол (абсолют)SigmaE7023
Краска коллоидного серебраЭлектронная микроскопияНауки 12630
Корешки образцов СЭМЭлектронная микроскопияНауки 75220
Покровные стеклаThermo Fisher08-774-383
IL-8 Оценка
Quantikine IL-8 ELISA kit R& D SystemsD8000C
бруцеллыдля электронной микроскопиисекреции

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cover, T. L., Blaser, M. J. Helicobacter pylori in health and disease. Gastroenterology. (6), 1863-1873 (2009).
  2. Sycuro, L. K., et al. Peptidoglycan crosslinking relaxation promotes Helicobacter pylori's helical shape and stomach colonization. Cell. 141 (5), 822-833 (2010).
  3. Kodaman, N., et al. Human and Helicobacter pylori coevolution shapes the risk of gastric disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (4), 1455-1460 (2014).
  4. Tegtmeyer, N., Wessler, S., Backert, S. Role of the cag-pathogenicity island encoded type IV secretion system in Helicobacter pylori pathogenesis. FEBS J. 278 (8), 1190-1202 (2011).
  5. Fischer, W. Assembly and molecular mode of action of the Helicobacter pylori Cag type IV secretion apparatus. FEBS J. 278 (8), 1203-1212 (2011).
  6. Odenbreit, S., Puls, J., Sedlmaier, B., Gerland, E., Fischer, W., Haas, R. Translocation of Helicobacter pylori CagA into gastric epithelial cells by type IV secretion. Science. 287 (5457), 1497-1500 (2000).
  7. Bourzac, K., Guillemin, K. Helicobacter pylori-host cell interactions mediated by type IV secretion. Cell Microbiol. 7 (7), 911-919 (2005).
  8. Bronte-Tinkew, D. M., et al. Helicobacter pylori cytoxin-associated gene A activates the signal transducer and activator of transcription 3 pathway in vitro and in vivo. Cancer Res. 69 (2), 632-639 (2009).
  9. Johnson, E. M., Gaddy, J. A., Cover, T. L. Alterations in Helicobacter pylori triggered by contact with gastric epithelial cells. Front. Cell. Infect. Microbiol. (2), 17(2012).
  10. Rohde, M., Puls, J., Buhrdorf, R., Fischer, W., Haas, R. A novel sheathed surface organelle of the Helicobacter pylori cag type IV secretion system. Mol. Microbiol. 49 (1), 219-234 (2003).
  11. Cover, T. L., Peek, R. M. Jr Diet, microbial virulence and Helicobacter pylori induced gastric cancer. Gut Microbes. 4 (6), 482-493 (2013).
  12. Queiroz, D. M., et al. Increased gastric IL-1β concentration and iron deficiency parameters in Helicobacter pylori infected children. PLoS One. 8 (2), 57420(2013).
  13. Harris, P. R., et al. Helicobacter pylori-associated hypochlorhydria and development of iron deficiency. J. Clin. Pathol. 66 (4), 343-347 (2013).
  14. Noto, J. M., et al. Iron deficiency accelerates Helicobacter pylori-induced carcinogenesis in rodents and humans. J. Clin. Invest. 123 (1), 479-492 (2013).
  15. Tan, S., Noto, J. M., Romero-Gallo, J., Peek, R. M. Jr, Amieva, M. R. Helicobacter pylori perturbs iron trafficking in the epithelium to grow on the cell surface. PLoS Pathog. 7 (5), (2011).
  16. Danielli, A., Roncarati, D., Delany, I., Chiarini, V., Rappouli, R., Scarlato, V. In vivo dissection of the Helicobacter pylori Fur regulatory circuit by genome-wide location analysis. J. Bacteriol. 188 (13), 4654-4662 (2006).
  17. Pich, O. Q., Carpenter, B. M., Gilbreath, J. J., Merrell, D. S. Detailed analysis of Helicobacter pylori Fur-regulated promoters reveals a Fur box core sequence and novel Fur-regulated genes. Mol. Microbiol. 84 (5), 921-941 (2012).
  18. Cassat, J. E., Skaar, E. P. Iron in infection and immunity. Cell Host Microbe. 13 (5), 509-519 (2013).
  19. Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. Host-pathogen interactions in urinary tract infection. Nat. Rev. Urol. 7 (8), 430-441 (2010).
  20. Brickman, T. J., Cummings, C. A., Liew, S. Y., Relman, D. A., Armstrong, S. K. Transcriptional profiling of the iron starvation response in Bordatella pertussis provides new insights into siderophore utilization and virulence gene expression. J. Bacteriol. 193 (18), 4798-4812 (2011).
  21. Mobley, H. L. Helicobacter pylori factors associated with disease development. Gastroenterology. 113 (6), 21-28 (1997).
  22. Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. L. Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined. J. Clin. Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).
  23. Senkovich, O., Ceaser, S., McGee, D. J., Testerman, T. L. Unique host iron utilization mechanisms of Helicobacter pylori revealed with iron-deficient chemically defined media. Infect. Immun. 78 (5), 1841-1849 (2010).
  24. Shaffer, C. L., et al. Helicobacter pylori exploits a unique repertoire of type IV secretion system components for pilus assembly at the bacteria-host cell interface. PLoS Pathog. 7 (9), (2011).
  25. Barrozo, R. M., et al. Functional plasticity in the type IV secretion system of Helicobacter pylori. PLoS Pathog. 9 (2), (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи