Просмотр и доступ к куриному эмбриону во время развития может быть сложной задачей. Мы разработали метод ex ovo, который является простым, экономичным и может быть легко использован в классе или в исследовательской среде. Этот метод обеспечивает доступ к эмбриону на поздних стадиях эмбрионального развития (HH 40).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Оптимизированный Экс-ово Культивирование куриных эмбрионов в продвинутых стадиях разработки
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Исследования в области анатомии, эмбриологии и биологии развития в значительной степени опирались на использование модельных организмов. Для изучения развития живых эмбрионов часто используются модельные организмы, такие как курица. Курица является отличным модельным организмом из-за своей низкой стоимости и минимального обслуживания, однако она представляет трудности для наблюдения, поскольку заключена в непрозрачную яичную скорлупу. Для того, чтобы правильно рассмотреть эмбрион по мере его развития, скорлупу необходимо закрыть окном или снять. Методы работы с окнами и ex ovo были разработаны, чтобы помочь исследователям в изучении эмбрионального развития. Однако каждый из методов имеет свои ограничения и проблемы. В этой статье мы представляем простую, оптимизированную технику ex ovo культивирования куриных эмбрионов, которая позволяет наблюдать за эмбриональным развитием от стадии HH 19 до поздних стадий развития (HH 40), когда развилось множество органов. Этот метод легко применять как на занятиях бакалавриата, так и в более продвинутых исследовательских лабораториях, где проводятся манипуляции с эмбрионами.
Введение
Ex ovo культивирование сыграло важную роль в изучении развития курицы1, 2. Этот метод культивирования использовался для изучения неврологических заболеваний, развития конечностей, черепно-лицевого развития, а также в качестве модели для исследования пороков развития, связанных с диабетом 3, 4, 5.
Существует множество вариаций техники ex ovo. Наиболее распространенным подходом является использование чашки из пенополистирола6,7,8 или стеклянной чаши5. При этих методах чашку или миску настилают полиэтиленовой пленкой, чтобы удержать эмбрион, на чашку надевают крышку, а затем эмбрион помещают в инкубатор с соответствующей влажностью6. Однако такая конфигурация может быть технически сложной. Первая проблема – это полиэтиленовая пленка, которая используется для колыбели эмбриона. С такой пленкой сложно работать и часто она не очень хорошо прилегает к чашке. Чтобы решить эту проблему, вокруг чашки надевается резинка, которая удерживает обертку на месте. Несмотря на это, обертывание все равно может соскользнуть, что смертельно опасно для эмбриона. Полиэтиленовая пленка может порваться или быть проколота щипцами или иглами, которые могут быть использованы во время манипуляций с эмбрионами и наблюдений. Наконец, такая установка не очень устойчива, и студенты могут легко опрокинуть чашки. Высота чашечек также очень затрудняет помещение эмбриона под стереомикроскоп, объектив которого ограничен высотой стадии. Эти проблемы затрудняют работу студентов бакалавриата с живыми куриными эмбрионами в учебных лабораториях, таких как продвинутые курсы биологии развития.
Вышеупомянутые проблемы в методе ex ovo привели к тому, что исследователи обратились к методу окон 9,10 для наблюдения за эмбриональным развитием цыплят. В этой технике в скорлупе яиц делается отверстие или «окно», расположенное над эмбрионом. Отверстие может быть повторно запечатано лентой или воском9 для обеспечения дальнейшего эмбрионального развития. Несмотря на то, что метод оконного дизайна имеет некоторые преимущества, такие как возможность просмотра эмбрионального развития и простота обслуживания, этот метод также имеет ряд ограничений. Первый заключается в том, что окно должно быть достаточно большим, чтобы можно было рассмотреть весь эмбрион (особенно на поздних стадиях). Во-вторых, большие окна сложно запечатать; Неправильная герметизация приведет к проблемам со стерильностью и живучестью. Использование расплавленного воска в качестве герметика добавляет еще один неудобный и грязный шаг в протокол. Таким образом, несмотря на то, что метод «окна» может быть идеальным для эмбрионов цыплят на молодых стадиях (HH 11 – HH 27), просмотр всего эмбриона на поздних стадиях не является легким делом.
Здесь мы описываем улучшенную и простую технику экстра-ово-культивирования 11, которая позволяет избежать необходимости в высокотехнологичном оборудовании, легко управляется под стереомикроскопом, обеспечивает эмбриону достаточную поддержку для выполнения микроскопических манипуляций и позволяет исследователям наблюдать за ростом эмбриона во всей его полноте вплоть до более поздних стадий развития (до HH 40-41). Благодаря этим достижениям в технике ex ovo люди получают доступ к более полному пониманию эмбрионального развития. Например, рост на более поздних стадиях позволяет людям наблюдать за процессами развития, которые не происходят до этого момента, такими как окостенение, развитие перьев и продвинутое развитие конечностей и глаз. Хорошо виден весь эмбрион и внеэмбриональные оболочки и сосудистая сеть. Также могут быть проведены более продвинутые исследования, такие как манипуляции с эмбрионами (т.е. имплантация бусин, пропитанных ингибиторами, или введение барьеров между слоями ткани), и исследователи могут наблюдать эффект манипуляций на более поздних стадиях эмбрионов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Примечание: Все материалы приведены в таблице 1.
1. Хранение куриных эмбрионах
- Выдержите куриные яйца штамма Gallus Gallus горизонтально на 37 ° С с примерно 40% влажности и превратить яйца один или два раза в день. Обращаясь яйца важно для предотвращения эмбрион от присоединения к яичной скорлупы.
- Не превратить яйцо в 24 ч до создания культуры как в противном случае эмбрион будет расположен брюшной массы желтка и будут повреждены при открытии яйцо в шаге 3. Кроме того, держать яйца в 4 ° С градусов не более чем за одну неделю до инкубации «пресекать» развития, но это не является идеальным.
2. Постановка куриных эмбрионах
- Этап куриные эмбрионы, используя гамбургер и Гамильтон 12 промежуточной таблицы. Идеальная сцена для создания экс-ово культивирование HH этап 19-20 (около 3 дней инкубации) BECAUSE это вскоре после того, голова поворачивается на 53 часов после оплодотворения.
Примечание: HH этап 19-20 характеризуется следующими морфологическими признаками: сомиты распространяются в большинстве хвоста, однако самый конец хвоста остается сегментированный, хвостовой почки скручена, Аллантоис мала и ограничена сосудистой, для ног почки крупнее, чем крыло бутонов и глаза непигментированным или иметь сероватый оттенок.
3. Удаление эмбриона из оболочки
- Перед снятием эмбриона из оболочки, спрей оболочку с 70% этанола и дайте ему высохнуть. Не включайте яйцо быстро, как это может повредить зародыш.
- Соблюдая осторожность, чтобы не изменить ориентацию яйца, тщательно взломать яйцо на нижней стороне (т.е. сторона, которая была вентральной во время инкубации) и отпустите эмбриона в стерильной весят лодке (88 х 88 х 23 мм). Протрите весят лодки с 70% этанола. Проверьте эмбриона для того, чтобы желток мешок не повреждается. Если желтка чкак осколки, отказаться от эмбриона, так как он не выживет.
- Соблюдайте эмбриона для того, чтобы он жизнеспособен; Сердце бьется, сосудистая кажется нормальным, и никаких очевидных аномалий нет. Убедитесь, что края взвешивания лодке сухие.
- С помощью пипетки, падение 40 мкл пенициллина / стрептомицина (5000 единиц пенициллина, стрептомицина 5 мг на мл) на верхней части альбумина, чтобы помочь предотвратить инфекцию.
4. Подготовка влажность палату
- Поместите небольшую стопку КИМ-салфеток и / или абсорбирующей прокладки, изготовленной из хлопка в нижней части стерильной пластиковой емкости (12 х 12 х 6 см) протирают 70% -ным этанолом.
- Добавить стерильную дистиллированную воду, чтобы увлажнить КИМ-салфетки и / или хлопка (приблизительно 150 мл воды).
5. Сборка Ex ово Культура
- Поместите весить лодку, содержащий эмбриона в верхней части влажной прокладки. Затем место половина квадратного стерильную чашку Петри (9,5 х 9,5 см) в верхней части Тон весит лодку, чтобы сформировать свободную крышку.
- Накройте пластиковый контейнер с крышкой. Надавите на два угла крышкой, обеспечивая частичное уплотнение, которое до сих пор позволяет для хорошего воздушного потока внутри камеры.
- Осторожно положите установки в 37 ° С инкубатор до нужной стадии.
- Поместите контейнеры воды в инкубаторе, чтобы контролировать влажность, если контролируемое инкубатор влажности недоступен. Стерилизацию всю воду в камерах влажности и в инкубаторе и при необходимости пополнить в течение инкубационного периода. 40% влажности является идеальным.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Это экс ово метода позволяет для наблюдения эмбрионов от ранних стадиях развития (чч 19/20) и поздних стадиях развития (чч 40-41) (рис 1А и 1В). Настройка культуру HH 19-20 увеличивает выживаемость эмбрионов в культуре. До головки поворота (до 53 HPF) живучесть очень низка в культуре и после стадии 21, эмбрион, как правило, придерживаться более к корпусу на удалении, так получают меньше интактные зародыши. В общем, живучесть эмбриона в экс ово культуры высотой до HH 35...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Экс ово культивирование и оконной оба имеют свои преимущества и вызовы. Здесь мы сравнить преимущества и вызовы чашки экс пенополистирола ово метода и метода оконной к наш оптимизированный для экс ово способом, показанным здесь. Наш метод позволяет манипуляции и удобства наблюдения куриного эмбриона на поздних стадиях развития, и наши уточнений к традиционной экс ово метода 1, 2, 3 сделать это дополнительно очень проста в использовании в Вузовский лабораторных заня...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют конкурирующие финансовые интересы в отношении информации, представленной в этой рукописи.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Поль Пуарье, средства массовой информации производителей, на горе Сент-Винсент университета за его работу в съемках и редактирования видео часть этой рукописи. Мы признаем естествознания и техники Научно-исследовательского совета Канады для финансирования.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Пенициллин/стрептомицин | Sigma | P4458 | Делать небольшие аликвоты во избежание замерзания/оттаивания |
| Квадратная чашка | 9,5 см x 9,5 см | ||
| Весить лодку | Fischer Scientific | 8732113 | 88 x 88 x 23 мм |
| Контейнер с застежкой-молнией | Н | /Д 12 | см x 12 см x 6 см |
Ссылки
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).
- Gennaro, L. D., Packard, D. S., Stach, R. W., Wagner, B. J. Growth and differentiation of chicken embryos in simplified shell-less cultures under ordinary conditions of incubation. Growth. 44, 343-354 (1980).
- Tufan, C. A., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology. Neuroanat. 3, 8-11 (2004).
- Duench, K., Franz-Odendaal, T. A. BMP and Hedgehog signaling during the development of scleral ossicles. Dev. Biol. 365 (1), 251-258 (2012).
- Datar, S., Bhonde, R. R. Shell-less Chick Embryo Culture as an Alternative in vitro Model to Investigate Glucose-Induced Malformation in Mammalian Embryos. Rev Diabet Stud. 2 (4), 221-227 (2005).
- Chick embryos in shell-less culture. Tested studies for laboratory teaching. Fisher, C. J. 5th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE), , (1983).
- Dunn, B. E. Technique for shell-less culture of the 72-hour avian embryo). Poultry Science. 53, 409-412 (1974).
- Yalcin, H., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Silver, P. H. S. Special problems of experimenting in ovo on the early chick embryo, and a solution. J Embryol Exp Morph. 8 (4), 369-375 (1960).
- Spurlin, J., Lwigale, P. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Dev. Dyn. 242 (2), 148-154 (2012).
- Dorrell, M. I., et al. Ex ovo model for directly visualizing chicken embryo development. American Biology Teacher. 74 (9), (2012).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morph. 88, 49-92 (1951).
- Drossopoulou, G., et al. A model for anteroposterior patterning of the vertebrate limb based on sequential long-and short-range Shh signaling and Bmp signaling. Development. , 127-1337 (2000).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522(2013).
- Franz-Odendaal, T. Towards understanding the development of scleral ossicles in chicken, Gallus gallus. Dev. Dyn. 237, 3240-3251 (2008).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
