Тимэктомия грызунов является ценным методом в иммунологических исследованиях. В данной работе описан протокол полной тимэктомии у взрослых крыс с использованием мини-стернотомии в сочетании с неинвазивной интубацией и вентиляцией с положительным давлением для минимизации периоперационной заболеваемости и смертности.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Полный Тимэктомия у крыс взрослых с неинвазивной интубации трахеи
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Тимэктомия у новорожденных грызунов солидной и надежной порядок иммунологических исследований. Тем не менее, у взрослых крыс, осложнения кровоизлияния и пневмоторакса из плевральной нарушения могут привести к значительной смертности. Этот протокол является простым способом крыс тимэктомии, который использует мини-Стернотомия и эндотрахеальной интубации. Интубация осуществляется с неинвазивным и легко воспроизводимый метод и позволяет для вентиляции с положительным давлением, чтобы предотвратить пневмоторакс и контролируемого дыхательных путей, что позволяет достаточно времени для тщательного вилочковой вскрытия, чтобы минимизировать плевральной нарушения. 1,5 см грудины разрез уменьшается контакт с средостения сосудов и плевры, в то же время обеспечивая полную визуализацию тимуса. После облучения средостения, тимус удаляется тупым под увеличением. Плевральной полости затем герметизируют путем закрытия шва из предварительно трахеи мышц с последующим применением хирургического клея.грудной клетки затем закрывается закрытия шва грудины, с последующим закрытием шва кожи. Все thymectomies были полными, о чем свидетельствует иммуногистохимического (IHC) окрашиванием медиастинальной ткани, и отсутствие наивных Т-клеток с помощью проточной цитометрии, и процедура была выживаемость 96%. Этот метод подходит, если полная тимэктомия с минимальными осложнениями требуется для дальнейших иммунологических исследований в безтимусных взрослых крыс.
Введение
С начала 1960-х годов, тимус был признан за его важной роли в развитии центральной иммунологической толерантности. Грызунов тимэктомия оказался процедурой, необходимой для определения роли тимуса в лимфоцитов дифференциации, аутотолерантности и immunotolerance в условиях трансплантации аллотрансплантата и метастазирования опухоли. Удаление крысы тимуса позволяет исследований, связанных с истощением Т-клеток или приемного передачу определенных групп населения Т-клеток без повторного появления родных наивных Т-клеток.
Thymectomies неонатальной грызунов может быть достигнуто методом всасывания с надежными результатами 1. У взрослых крыс, этот метод связан с приблизительной смертности на 20% и часто приводит к неполному тимэктомии 2. Последовательно достичь полного тимэктомия у взрослых крыс, открытая экспозиция средостения через срединную стернотомию требуется. Тем не менее, этотпроцедура, связанная с осложнениями, которые включают в себя повреждение трахеи, кровоизлияния и пневмоторакс, ведущие к общей смертности в пределах от 1,5 - 6% 2- 4.
За последние два десятилетия совершенствования методов Тимэктомия снизились послеоперационные осложнения и улучшению показателей выживаемости. Интубация трахеи позволяет вентиляции с положительным давлением уменьшилось пневмоторакс ставки 5. Методы интубации описано ранее диапазон от открытого воздействия трахеи менее инвазивных методов, использующих прямой визуализации голосовых связок. Осложнения, связанные с процедурой интубации включают трахеи травмы, вокальный разрыв мозга, непреднамеренное интубация пищевода и кровотечение в результате пункции сердца или рваная рана верхней полой вены. Кроме того, близкое расположение нижних долей тимуса в плевральной подкладке может привести к пневмоторакс.
Здесь мы опишем техникутимэктомия через минимально инвазивной 2 см разрез кожи после простой метод интубации трахеи с использованием притупляются класса ангиокатетера и чрескожной освещение трахеи. Тимэктомия включает в себя 1,5 см стернотомию и закрытие трехслойную с хирургической нанесением клея для герметизации средостения и свести к минимуму случаи кровоизлияния и респираторных осложнений. Этот метод надежно приводит к полному тимэктомии о чем свидетельствует исчезновение CD4 + и CD8 + наивных Т-клеток следующим тимэктомии и отсутствие тимуса ткани на окрашивание IHC. Оперативные раз и пригородных процессуальное смертность сведена к минимуму.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Все экспериментальные процедуры, связанные с использованием крыс было сделано в соответствии с процедурами, утвержденными уходу и использованию комитета животных Университета Дьюка в.
1. Подготовка интубации трахеи канюли
- Отрежьте конец иглы для 2 дюйма 14 G angiocathether иглы с кусачками.
- Pinch просвет иглы закрыты игл носом плоскогубцами.
- Отрежьте ущипнул раздел вниз к краю открытой просвета части с кусачками, а затем вырезать края с обеих сторон оставшийся конец в 30 - под углом 45 ° к иглы края.
- Поместите нижнюю 3 - 4 мм канюли в открытом пространстве прямых раструбную плоскогубцами и вытяните вверх, пока небольшой восходящей кривой не была сформирована в конце.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет способствовать направляя катетер в трахею (рисунок 1). - Использование тонкой наждачной бумагой, чтобы сгладить кромки на конце канюли.
- Вернуться ослабленный инструмент в трубку ангиокатетера. Убедитесь, что трубка немного короче, чем закругленным иглы.
2. Предварительное хирургических процедур
- Настройте сайт для процедуры путем размещения операционного микроскопа установлен на 10-кратным увеличением над рабочей зоны.
- Поставьте потепления накладка на рабочей зоны и накройте чистой поглощающей панели.
- Настройка частоты сердечных сокращений и насыщения крови кислородом монитора вблизи операционного поля.
- Взвесьте крысы по весу, на основе лекарственных доз (например, послеоперационного обезболивания, антибиотиков, или лимфоцитов истощения антитела).
ПРИМЕЧАНИЕ: Типичная взрослых крыс весом от 350 - 450 г. - Седативный крыс с испаренной 3% изофлуран-O 2 (3 л / мин) с использованием индукционной камеру выпускают в системе газа поглощать отходы анестетика, содержащего активированный уголь. Разрешить 5 мин для индукции анестезии, чтобы обеспечить глубокого наркоза, необходимое для интубации трахеи.
- Администрирование Carprofen или Meloxicane (4,4 мг / кг) подкожно крысе до перехода с интубации и хирургии.
- Используйте электрические ножницы брить шею и грудную клетку под наркозом крысы до интубации.
3. Интубация
- Подготовка установки интубации путем трения небольшое количество смазки (например, KY гель) на конце канюли интубации. Включите вентилятора начать подачу изофлуран газа через трубопровод разъема.
- Трансфер крысы интубации аппарата и приостановить крысу на металлическом стержне своим верхним резцов (рис 2А).
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые интубации устройства могут быть приобретены в Интернете. Модель, показанная здесь домашний помощью акрилового листа формируются вокруг разделов 2 х 4 дюйма поясничной части с помощью бутан факел, и подкрепления крепятся хлороформом. Бар (или металлической проволоки) крепится путем сверления отверстий более липкой лентой, размещенных на SIDE акрилового чтобы предотвратить раскол и трещин. - Транс-освещения шею крысы, поместив гибче высокоинтенсивного источника света 1 - 2 см от вентральной поверхности шеи (рис 2б).
- Используйте пару студенческих стандартная схема щипцов, чтобы вытащить язык нежно вверх и в сторону нижних зубов. Власть язык между большим и указательным пальцами одной руки при размещении плоской внутренней поверхности одной стороны пинцетом против нижней части языка. Пресс-вентрально, чтобы разоблачить надгортанник и диафрагмы гортани (рис 2С).
- Представьте голосовые связки и направлять вздернутый, тупого конца интубации канюли впереди через открытую голосовую щель в трахею, пока ступица ангиокатетер не коснется резцы.
- Снимите металлическую стилет, и приложить трубку для анестезии открытия ангиокатетера начать вентиляцию изофлураном.
ПРИМЕЧАНИЕ: типичный Flo кислородаВт Скорость на ИВЛ 3 л / мин с 3% изофлуран.- Установка вентилятора со скоростью 60 дыханий / мин в объеме контролируемых режиме вентилятора, который достигает давление ~ 12 - 14 мм рт. Используйте положительное давление в конце выдоха (ПДКВ) 3 см Н 2 О.
- Соблюдайте двустороннего груди расширение стенки в синхронизации с вентилятором для обеспечения правильного размещения эндотрахеальной трубки.
- Применить ветеринар-рекомендуется глазная мазь для глаз крысы, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом.
- Применить ветеринар мазь на глазах крысы, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом.
- Закрепите эндотрахеальной трубки в голову крысы с полосой ткани ленты. Обеспечить прочное соединение между эндотрахеальной трубкой и обезболивающий труб притока.
- Прикрепите крови кислородом, монитор сердечного ритма до ног крысы и начать мониторинг. Подтвердите надлежащего обезболивания, подтвердив нет никакой реакции на ке-пинч.
4. Thoracotomy и Тимэктомия
- Следуйте стандартной асептической техники для полноты процедуры.
- Очистите рабочую зону и операционный стол рабочий и дезинфицировать с 70% -ным раствором этанола.
- Используйте стерильные хирургические перчатки во время процедуры, и автоклав все инструменты и материалы, используемые во время процедуры.
- Применить провидон-йод для всей области груди и дайте ему высохнуть. Затем очистите поверхность кожи с 70% этанола на марлю. Обложка крысу с прозрачной пластиковой пленкой, резки отверстие, чтобы выставить стерильную операционную поле.
- Определить suprasternal выемку в верхней грудной области. Сделайте 2 см срединный разрез через кожу, начиная 2 - 3 мм выше suprasternal выемку и проходящей дистальнее средней линии вдоль грудины тупыми наконечниками ножницы Ши.
- Выполните 1,5 см средний стернотомию от suprasternal паз снова тупыми наконечниками ножницы Ши. КEep нижний край ножницами только под грудиной и заранее медленно.
- Вставьте небольшую Альм втягивающим прямо под отделенной грудины и открывая предварительно трахеи ремень мышцы (sternohyoid и sternothyroid мышцы). Отделите до трахеи мышц ремень тупыми щипцами Грефе. Примечание: В этот момент трахеи можно видеть, а интубации трубка должна быть визуализированы внутри трахеи.
- Поместите штыри небольшой Альм втягивающего под отделенных мышц ремень и грудины. Откройте втягивающего подвергайте превосходную аспект тимуса.
- Используйте тонкий пинцет, Дюмон, чтобы освободить боковых краев ткани вилочковой железы и подвергать нижние тимуса долей.
- Потяните тимус мягко сверху в открытом месте разреза, заботясь, чтобы избежать контакта с верхней полой вены, подключичной и сонной сосудов, и свести к минимуму нарушения хрупкого плевральной прокладки между тимуса и легких.
- Так как Tон тимуса сосуды рассечены и показал, используйте микро-ножницы, чтобы разделить их. Используйте ватный тампон, если это необходимо удерживать давление на сосуды для остановки кровотечения.
- Доставка нижние тимуса долей в разрез, а затем резко лизировать задние вложения. Удалить нетронутыми тимус и внимательно осмотрите удален тимус для любого пропавшего разделах.
Примечание: Небольшие грудные лимфатические узлы могут быть визуализированы, окружающий тимус и часто трудно отличить от тимуса ткани. Они будут дискретные круглые узлы с аналогичным внешнему виду тимуса ткани, но не будет в непрерывности с тимусе. - Снимите ретрактор Альм и закрыть sternohyoid и sternothyoid мышцы с двумя прерывается 5-0 Maxon швов.
- Применить 2 капли клея цианоакрилат ткани хирургическое класса по швов для герметизации средостения при хорошей вентиляции с положительным давлением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит уменьшить частоту развития пневмоторакса и гематомы. - Закройте улernum с двумя прерывается 4-0 шелковые швы на разделочной иглы. Вставьте иглу через зазоры между ребрами, заботясь, чтобы направлять иглу прямо под грудиной, чтобы избежать основной слой мышц.
- Закройте слой кожи с запущенным 4-0 нейлон шва. Прекратить изофлурана на данном этапе сократить послеоперационный период выхода из наркоза.
- Очистите сайт разрез и окружающую кожу с физиологическим раствором смачивают марлю.
- Нанесите несколько капель бупивакаина (0,25%) для местной анестезии, а затем по 1 - 2 капли цианакрилатного клея на разрез, чтобы запечатать разрез.
- Продолжить, чтобы проветрить до крыса показывает признаки независимого дыхательных усилий и начинает двигаться свои конечности. Экстубации крысу и дать ему восстановиться под пристальным наблюдением в клетке, размещенной на потепление площадку.
- Администрирование бупренорфин (0,01 - 0,05 мг / кг) подкожно крысе сразу же после операции и повторить каждые 8-12 ч в течение 48 ч пероральноСанкт-оперативно (обычно 5 суммарные дозы). В 24 и 48 часов после операции, управлять Carprofen или Meloxicane (4,4 мг / кг) подкожно (3 Суммарные дозы в том числе предоперационной дозы).
- Продолжайте следить за пока крысы не движется вокруг клетки. В каких-либо признаков респираторного дистресса, выполните повторное зондирование и повторное исследование органов грудной клетки.
- Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в достаточной сознание поддерживать грудины лежачее положение.
- Не возвращать животное, которое перенес операцию на компании других животных, пока полностью выздоровел.
- Удалить слой кожи швы 1 неделю после операции.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Эта процедура была выполнена на взрослых крыс Льюиса (п = 26). Среднее время операции составило 15 ± 3 мин. Там не было интраоперационной смертности. Среднее время интубации - от размещения крысы на интубации аппарата к созданию вентиляции - составила 45 ± 5 сек. 24 крыс были полное восстановление от операции без каких-либо доказательств затрудненного дыхания или кровотечение через день после операции (POD) 14. Один крыс развитой дыхательной трудности на POD 4 и прошли повторной операции, чтобы исследовать средостение. ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Настоящий Протокол для полного тимэктомии обеспечивает минимально инвазивный подход с трехслойной закрытия разреза с хирургическим нанесением клея предназначена для сведения к минимуму осложнения. Полное удаление тимуса была продемонстрирована потери наивных Т-клеток и IHC окрашивания медиастинальной лимфоидной ткани для цитокератином.
Процедура взрослых крыс тимэктомии осложняется смертности от 1,5 - 20% в связи с Периоперационные осложнений, большинство из которых являются связано с интимн...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана AI101263 из Национальных институтов здравоохранения (T.V.B) и грантом от Фонда Хартвелла (M.L.M.). M.L.M. является членом Комплексного онкологического центра Дьюка.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 2-дюймовый ангиокатетер | |||
| Операционный микроскоп | Zeiss | ||
| Грелка | |||
| Монитор сердечного ритма и оксигенации крови для грызунов с датчиками для ног | Harvard Apparatus | ST1 72-8010, ST1 72-8098 (Датчик крысиной лапки) | |
| Аппарат для интубации (пластиковый с металлической планкой вверху) | Смотрите Рисунок 2 | ||
| Система анестезии для мелких животных с индукционной коробкой, изофлурановым резервуаром и O2 | Гарвардский аппарат | ST1 72-6420 | |
| Аппарат искусственной вентиляции легких для мелких животных с трубками | CWE | 12-02000 (вентилятор) и 12-04000 (внешний клапан в сборе для мышей/крыс) | |
| Высокоинтенсивный оптоволоконный осветитель | Dolan Jenner | EEG 2823M | |
| Студенческие щипцы стандартного образца | Fine Science Tools | 91100-16 | |
| Тонкие прямые ножницы | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Ножницы ши с тупым наконечником | Fine Science Tools | 14105-12 | |
| Small Alm retractor (для грудины) | Fine Science Tools | 17008-07 | |
| Тупые щипцы Graefe | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Тонкие щипцы Dumont | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| 5-0 Maxon шовные материалы | Ethicon | ||
| 4-0 Шелковые шовные материалы (с режущей иглой) | Ethicon | ||
| 6-0 Нейлоновый шовный материал | Ethicon | ||
| Цианоакрилатный клей (Endermil) | |||
| Смазочный гель | Akorn Animal НДЦ по охране здоровья | 17478-162-35 |
Ссылки
- Hard, G. C. Thymectomy in the neonatal rat. Lab. Anim. 9 (2), 105-110 (1975).
- Kobayashi, E., et al. A technique for complete thymectomy in adult rats. J. Immunol. Methods. 1759 (94), 0-3 (1994).
- Delrivière, L., Gibbs, P., Kobayashi, E., Kamada, N., Gianello, P. New technique of complete thymectomy in adult rats without tracheal intubation. Microsurgery. 18 (1), 6-8 (1998).
- Walker, K. G., Jacques, B. C., Tweedle, J. R., Bradley, J. A. A simpler technique for open thymectomy in adult rats. J. Immunol. Methods. 175 (1), 141(1994).
- Na, N., Zhao, D., Huang, Z., Hong, L. An improved method for rat intubation and thymectomy. Chin. Med. J. (Engl). 124 (17), 2723-2727 (2011).
- Kastl, S., et al. Simplification of rat intubation on inclined metal plate). Adv. Physiol. Educ. 28 (1-4), 29-34 (2004).
- Weksler, B., Ng, B., Lenert, J., Burt, M. A simplified method for endotracheal intubation in the rat. J. Appl. Physiol. 76 (4), 1823-1825 (1994).
- Jou, I. M., et al. Simplified rat intubation using a new oropharyngeal intubation wedge. J. Appl. Physiol. 89 (5), 1766-1770 (2000).
- Rivard, A. L., et al. Rat intubation and ventilation for surgical research. J. Invest. Surg. 19 (4), 267-274 (2006).
- Zhao, D., et al. A model of isolated, vascular whole thymus transplantation in nude rats. Transplant Proc. 44 (5), 1394-1398 (2012).
- AbuAttieh, M., et al. Affinity maturation of antibodies requires integrity of the adult thymus. Eur. J. Immunol. 42 (2), 500-510 (2012).
- Reeves, J. P., Reeves, P. A., Chin, L. T. Survival surgery: removal of the spleen or thymus. Curr. Protoc. Immunol. 1 (Unit 1.10), (2001).
- Siemionow, M., Izycki, D., Ozer, K., Ozmen, S., Klimczak, A. Role of thymus in operational tolerance induction in limb allograft transplant model. Transplantation. 81 (11), 1568-1576 (2006).
- Satoh, E., et al. Immunosuppressive effect of long-term drainage of thoracic duct on immunological memory in adult thymectomized rats. Transplant. Proc. 37 (4), 1947-1948 (2005).
- Groen, H., Klatter, F., Pater, J., Nieuwenhuis, P., Rozing, J. Temporary, but Essential Requirement of CD8+ T Cells Early in the Pathogenesis of Diabetes in BB Rats as Revealed by Thymectomy and CD8 Depletion. Clin. Dev. Immunol. 10 (2-4), 141-151 (2003).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
