Здесь мы описываем простой анализ для количественной оценки реакции на питание у гидры, вызванной восстановленной формой глутатиона. Этот анализ основан на измерении расстояния между апикальным концом щупальца и ртом гидры.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Измерение глутатион-индуцированной кормления ответ в Hydra
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Гидра является одним из самых примитивных организмов, обладающих нервной системой и хемочувствительностью для обнаружения восстановленного глутатиона (GSH) для захвата добычи. Движение кормовых организмов вызывает механосенсорный разряд стрекательных клеток, называемых нематоцистами из гидры, которые внедряются в добычу. Пищевая реакция у гидры, которая включает в себя скручивание щупалец, чтобы поднести добычу ко рту, открытие рта и последующее поглощение добычи, вызывается GSH, присутствующим в жидкости, выделяемой из раненой добычи. Чтобы иметь возможность идентифицировать молекулярный механизм реакции на питание у гидры, который на сегодняшний день неизвестен, необходимо провести анализ для измерения реакции на кормление. Здесь мы опишем простой метод количественной оценки реакции на питание, при котором измеряется расстояние между апикальным концом щупальца и ртом гидры и определяется отношение такого расстояния до и после добавления GSH. Было обнаружено, что соотношение, называемое относительным размахом щупалец, дает представление о реакции на питание. Этот анализ был валидирован с использованием модели голодания, в которой голодающие гидры демонстрируют повышенную реакцию на питание по сравнению с ежедневно скармливаемой гидре.
Введение
Гидра - самый примитивный организм, обладающий нервной системой и хемочувствительностью для обнаружения восстановленного глутатиона (GSH) для захвата добычи1. Питается различными животными, такими как нематоды, ракообразные, личинки насекомых, головастики и недавно вылупившиеся рыбы1. Движение этих кормовых организмов вызывает механосенсорный разряд стрекательных капсул, называемых нематоцистами от гидры, которые вставляются в добычу2. GSH, присутствующий в жидкости, выделяемой из раненой добычи, впоследствии активирует пищевую реакцию у гидры, которая включает в себя скручивание щупалец, чтобы подвести добычу ко рту, открытие рта и последующее поглощение добычи. Было показано, что многие молекулы, такие как допамин-3, глутамат-4, ГАМК, глицин-5, NMDA-рецепторы6 и аллатотропин7, участвуют в пищевом ответе у гидры. Также было показано, что хемосенсорная реакция, индуцированная GSH, модулируется статусом питания животного таким образом, что голодающая гидра проявляла усиленную реакцию на кормление. Такое повышение чувствительности к GSH является биологически значимым, так как в условиях голодания гидре необходимо находить свою добычу при более высокой чувствительности.
Хотя реакцию на кормление, вызванную GSH, можно ясно наблюдать под микроскопом, методы, обычно используемые для измерения наблюдений за реакцией на питание, не являются количественными. В большинстве случаев за меру реакции на питание принималось время, в течение которого рот гидры остаетсяоткрытым8,9; В то время как в другом случае количественное определение было основано на количестве гидр из популяции, демонстрирующих реакцию на питание10. Тем не менее, наблюдение за временем открытия рта полипов гидры является трудоемким и подвержено изменениям, вызванным неконтролируемыми параметрами, такими как направление ориентации рта во время наблюдений. Аналогичным образом, поскольку реакция на кормление является количественным параметром, популяционные подходы подвержены вариациям/ошибкам, вызванным мнением или наблюдательной предвзятостью отдельного наблюдателя. Чтобы обойти эти проблемы, мы разработали метод относительной количественной оценки реакции на питание у гидры (Hydra vulgaris Ind-Pune11) на основе расстояния от апикального конца щупальца до рта полипа гидры.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Hydra Культура и Измерение кормления ответ
- Поддержание Hydra полипы в культуре путем подачи их в день с Artemia и держать их в среде (буфер 1 мМ Трис-HCl, рН 7,6, 1 мМ NaCl, 1 мМ CaCl 2, 0,1 мМ KCl, и 0,1 мМ MgSO 4), содержащийся в стеклянный шар на 18 ° C при 12 ч света 12 ч темных циклов, как описано ранее 12.
- Для измерения отклика подачи, передать один зрелые гидры полип, имеющую от 5 до 6 щупальца к одному лунку 24-луночного планшета. Снимите остаточной среды из скважины, наклонив его, а затем сразу же добавить 500 мкл свежей среды.
- Подготовьте 9 мкм глутатиона решение в гидры среды. Так как глутатион раствор склонен к окислению, всегда используют свежеприготовленные глутатиона решение для каждого эксперимента.
- Трансфер тарелку с изображения платформе микроскопом, имеющим положения для записи изображения. Используйте темный фон такой, что поведение ое гидра полип может быть четко отображены против контрастном фоне.
- Комната для наблюдения и отображения поведение гидры свободным от огней колебания интенсивности, воздушных потоков и шума. Такие расстройства могут также вызвать гидра полип, чтобы показать сжатие щупалец - даже в отсутствие глутатиона.
- Разрешить полип расслабиться в течение 5 мин.
- Убедитесь, что полип расположен вдоль центральной области хорошо так, что поведение может быть отображена ясно. Если полип на краю колодца, привести его в центр с помощью промывки среду с помощью пипетки и снова позволить ему отдохнуть.
- Записать образ гидры в расслабленном состоянии. Это будет точка наблюдения нулевой раз.
- Быстрое добавление 9 мкМ раствор глутатиона, чтобы достичь конечной концентрации 3 мкМ в скважине. В зависимости от целей эксперимента и ответ, показанной на гидры, испытать ряд различных концентраций глутатиона и Chooсе соответствующую концентрацию, необходимую.
- Запустите таймер сразу после добавления раствора глутатиона и захват изображений после каждого 15-30 сек для 4-5 мин. Не изменить настройки коэффициента увеличения во время покадровой обработки изображений.
- Добавьте глутатиона раствор осторожно и с равномерным потоком таким образом, что положение животного в скважине будет минимально нарушается в поле зрения микроскопа. Тем не менее, если полип перемещает широко после добавления раствора глутатиона, перемещать плиту очень осторожно, чтобы довести полип в поле зрения захвата изображения.
- В контрольном эксперименте, используют среду, не содержащую глутатион, сохраняя при этом все другие параметры идентичны.
- Обязательно выполните все вышеперечисленные экспериментальных шагов в первой половине дня - до 1 вечера, чтобы избежать возможного влияния циркадного ритма на степень реакции кормления.
- Откройте каждый из захваченных изображений с помощью программы Image Manipulation GNU (GIMP). Используйте «мера» инструмент, доступный из меню> Инструменты> Измерить для определения расстояния между верхушечной конце каждого из щупалец и гипостомы. Если отверстие рта наблюдается в любом из изображений, определяют расстояние между центром в открытый рот и апикальной конце щупальцу. Обратитесь к этой дистанции, как распространение щупальца.
- Рассчитайте среднее распространение щупальце для каждого полипа до и после воздействия глутатиона. Рассчитывают отношение среднего распространения щупальца на нулевой момент времени в том, что на каждом из последующих временных точках. Это отношение будет называться относительный разброс щупальце.
- Повторите измерения для по меньшей мере, 20 полипов.
2. Метод Оценка использованияГолодание Модель
- Для голода, передать несколько Hydra полипы в отдельный стеклянный шар и не кормить их в течение 5 дней. Поток контрольную группу из нескольких полипов ежедневно с артемии в аналогичной по размеру миску. Изменение среды от обоих экспериментальная миски ежедневно, чтобы избежать роста грибов в среде.
- В день эксперимента, кормить контрольной группы гидры с артемии в течение 1 часа и использовать эти гидру для последующих экспериментов после удаления все недоеденные и мертвую артемии из среды.
- Измерить реакцию подача голодали гидры по сравнению с гидры из контрольной группы по способу, описанному ранее в пункте 1. Чтобы избежать смещения из-за времени наблюдения, чередовать измерения каждого из голодали и контролировать Hydra полипы.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Глутатион вызывает гидра выставлять скручивания щупальца ко рту с целью поглощая добычу. Такое закручивание щупальцами приносит верхушечные концы щупалец ближе к гипостомы. Это приводит к уменьшению распространения щупальца, или линейного расстояния между верхушечной конце щупальца и гипостомы (рисунок 1). Относительное распространение щупальце, или отношение средней щупальцу распространяться до и после добавления глутатиона, в среднем на нескольких полипов снижает с течением времени. Относительное расп...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Пищевое поведение в гидры представляет собой один из самых исконных хемосенсорных систем в многоклеточных. Хотя присутствие GSH в ракообразных жидкости, опубликованном после nematocyst при содействии захвата добычи был обнаружен давно 1, ни белок, ни GSHR предполагаемого гена, кодирующего / с были охарактеризованы от гидры до настоящего времени. Мало попытки были сделаны, чтобы охарактеризовать ГШ связывающих белков в гидру 8, 14, 15. Тем не менее, личность этих предполагаемых рецепторных белков ос...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Авторы выражают благодарность К.. Мадху, Ните Белиаппе и сотрудникам Медиа-центра Индийского института научного образования и исследований в Пуне за их помощь в создании видео. Работа была поддержана финансированием в рамках программы Центра передового опыта Департамента биотехнологии Правительства Индии в Сингапуре и стипендией для постдокторантов Департамента науки и технологий Правительства Индии в РК.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Охлаждаемый инкубатор | Panasonic | Микроскоп МИР-254-ПЭ | |
| Leica | S8AP0 | ||
| Фотоаппарат для микроскопа | Leica | EC3 | |
| Восстановленный глутатион | Sigma | G4251 | Хранится при температуре 4 °C. Перед открытием бутылку доведите до комнатной температуры, чтобы избежать окисления |
| Программа редактирования изображений | GIMP | Версия 2.8 |
Ссылки
- Loomis, W. F. Glutathione control of the specific feeding reactions of hydra. Ann. Ny. Acad. Sci. 62, 209-228 (1955).
- Beckmann, A., Ozbek, S. The Nematocyst: a molecular map of the Cnidarian stinging organelle. Int. J. Dev. Biol. 56, 577-582 (2012).
- Venturini, G., Carolei, A. Dopaminergic receptors in Hydra. Pharmacological and biochemical observations. Comp. Biochem. Phys. C. 102, 39-43 (1992).
- Kass-Simon, G., Scappaticci, A. A. Glutamatergic and GABAnergic control in the tentacle effector systems of Hydra vulgaris. Hydrobiologia. 530-531, 67-71 (2004).
- Pierobon, P., Tino, A., Minei, R., Marino, G. Different roles of GABA and glycine in the modulation of chemosensory responses in Hydra vulgaris (Cnidaria, Hydrozoa). Hydrobiology. 178, 59-66 (2004).
- Pierobon, P., Sogliano, C., Minei, R., Tino, A., Porcu, P., Marino, G., Tortiglione, C., Concas, A. Putative NMDA receptors in Hydra: a biochemical and functional study. Eur. J. Neurosci. 20, 2598-2604 (2004).
- Alzugaray, M. E., Adami, M. L., Diambra, L. A., Hernandez-Martinez, S., Damborenea, C., Noriega, F. G., Ronderos, J. R. Allatotropin: An ancestral myotropic neuropeptide involved in feeding. PLoS ONE. 8, (2013).
- Bellis, S. L., Laux, D. C., Rhoads, D. E. Affinity purification of Hydra glutathione binding proteins. FEBS Lett. 354, 320-324 (1994).
- Lenhoff, H. M. The discovery of the GSH receptor in Hydra and its evolutionary significance. Glutathione in the Nervous System. Shaw, C. A. , Taylor&Francis. Bristol. 25-43 (1998).
- Venturini, G. The hydra GSH receptor. Pharmacological and radioligand binding studies. Comp. Biochem. Phys. C. 87, 321-324 (1987).
- Reddy, P. C., Barve, A., Ghaskadbi, S. Description and phylogenetic characterization of common hydra from India. Curr. Sci. 101, 736-738 (2011).
- Horibata, Y., et al. Unique catabolic pathway of glycosphingolipids in a hydrozoan, Hydra magnipapillata. Involving endoglycoceramidase. J. Biol. Chem. 279, 33379-33389 (2004).
- Koizumi, O., Maeda, N. Rise of feeding threshold in satiated Hydra. J. Comp. Physiol. 142, 75-80 (1981).
- Bellis, S. L., Kass-Simon, G., Rhoads, D. E. Partial characterization and detergent solubilization of the putative glutathione chemoreceptor from hydra. Biochemistry. 31, 9838-9843 (1992).
- Morita, H., Hanai, K. Taste receptor proteins in invertebrates - with special reference to glutathione receptor of hydra. Chem. Senses. 12, 245-250 (1987).
- Colasanti, M., Venturini, G., Merante, A., Musci, G., Lauro, G. M. Nitric oxide involvement in Hydra vulgaris very primitive olfactory- like system. Journal of Neurosci. 17, 493-499 (1997).
- Kuhn, A., Tsiairis, C. D., Williamson, M., Kalbacher, H., Grimmelikhuijzen, C. J., Holstein, T. W., Gründer, S. Three homologous subunits form a high affinity peptide-gated ion channel in Hydra. J. Biol. Chem. 285, 11958-11965 (2010).
- Wang, M., Yao, Y., Kuang, D., Hampson, D. R. Activation of family C G-protein-coupled receptors by the tripeptide glutathione. J. Biol. Chem. 281, 8864-8870 (2006).
- Ruggieri, R. D., Pierobon, P., Kass-Simon, G. Pacemaker activity in hydra is modulated by glycine receptor ligands. Comp. Biochem. Phys. C. 138, 193-202 (2004).
- Ramazani, R. B., Krishnan, H. R., Bergeson, S. E., Atkinson, N. S. Computer automated movement detection for the analysis of behavior. J. Neurosci. Meth. 162, 171-179 (2007).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
