Изготовление Комплексные Субстраты культуры с помощью робота-микроконтактной печати (R-μCP) и Sequential нуклеофильного замещения

Краткое содержание

Субстраты клеточных культур, функционализированные микромасштабными структурами биологических лигандов, имеют огромную полезность в области тканевой инженерии. В данной работе мы демонстрируем универсальное и автоматизированное производство субстратов для тканевых культур с помощью нескольких микроструктурированных полиэтиленгликолевых щеток, представляющих собой ортогональные химические составы, которые обеспечивают пространственно точную и сайт-специфичную иммобилизацию биологических лигандов.

Аннотация

В тканевой инженерии желательно демонстрировать пространственный контроль морфологии тканей и судьбы клеток в культуре в микронном масштабе. Для решения этой задачи можно использовать культуральные субстраты, представляющие собой привитые кисти из полиэтиленгликоля (ПЭГ), путем создания микромасштабных, необрастающих и устойчивых к клеточной адгезии областей, а также областей, где клетки участвуют в биоспецифических взаимодействиях с ковалентно привязанными лигандами. Чтобы спроектировать сложные ткани с использованием таких субстратов, потребуется последовательно смоделировать несколько кистей ПЭГ, функционализированных для придания дифференциальной биологической активности и выровненных в микромасштабных ориентациях, которые имитируют ниши in vivo. Микроконтактная печать (μCP) — это универсальный метод создания образцов для таких привитых PEG-кистей, но ручная μCP не может быть выполнена с микромасштабной точностью. Таким образом, мы объединили передовую робототехнику с методами мягкой литографии и новыми реакциями химии поверхности для разработки метода роботизированной микроконтактной печати (R-μCP) для изготовления культуральных подложек со сложными, микромасштабными и высокоупорядоченными узорами PEG-кистей, представляющих ортогональные «кликовые» химические составы. Здесь мы подробно опишем рабочий процесс изготовления таких подложек.

Введение

Способность ПЭГ-привитых поверхностей для отображения ковалентно связанные биохимические лиганды, одновременно поддерживая присущие не-обрастания свойства делают их идеальным выбором для инженерных пользовательских сред микромасштабных на культуральных субстратах ^1,2,3. Биоспецифического взаимодействия, опосредованные лигандов конъюгировали PEG щеток позволяет упрощенное анализ последствий биохимических сигналов, обнаруженных в комплексе в естественных условиях микросреды тканей на отдельных фенотипов клеток. Кроме того, био-ортогональное "щелчок" химические соединения могут быть использованы для облегчения направленного иммобилизацию лигандов так, что они представлены в нативных конформаций ^4-6. Таким образом, микромасштабная пространственное структурирование ПЭГ щетки является универсальным инструментом для создания дизайнера в нишах пробирке расследовать сигнализацию клеток, вызванную иммобилизованных биохимических сигналов ^6,7.

Общий метод генерации пространственных моделей биохимических у.е.эс влечет микроконтактная печати (μCP) позолоченные субстраты с узорами PEG сопряженных алкантиолов. Затем micropatterned самоассоциированные монослоя (Sams) ПЭГ-ylated алкантиолов ограничивает физическую адсорбцию биохимических молекул, например, белков, только для не-рисунком регионах подложки ^8,9. Тем не менее, ЗРК, генерируемые этой техники чувствительны к окислению в долгосрочной клеточной культуральной среде. Таким образом, μCP'd алкантиол ЗРК часто дополнительно привиты с ПЭГ полимерных щеток, используя поверхность инициативе переноса атома радикальной полимеризации (SI-ATRP), чтобы увеличить не обрастания стабильность в регионе ^10. В частности, μCP из алкантиол инициатора полимеризации, ω-meraptoundecyl бромизобутирата, на золотым покрытием поверхностей с последующим SI-ATRP поли (этиленгликоля) метилового эфира метакриловой (PEGMEMA) мономеров генерирует поверхностей с micropatterned долгосрочной перспективе, стабильное, и не- Загрязнение ПЭГ щетки. Более того, эти способны быть дополнительно модифицированы, чтобы представить разнообразны химические группы ^11.

Воспользовавшись этой собственности, Ша и др. др. разработал метод спроектировать культуры субстратов с многокомпонентных PEGMEMA кистей, представляющих ортогональных "щелчок" химии. В этом методе используют серию μCP / SI-ATRP шагов перемежаются с азидом натрия последовательный, этаноламина, и пропаргиламин нуклеофильные замен для создания культуральных субстратах, представляющие микромасштабная образцы нескольких иммобилизованных лигандов ^6. В то время как потенциал с помощью таких химических процессов в сочетании с ручным μCP проектировать новые культуральные субстраты огромна, она ограничена точностью и аккуратностью, с которой несколько шагов μCP могут быть выровнены на одной подложке. Высокий уровень точности и аккуратности необходимо будет воспроизводимо производство комплекс в пробирке ниш, использующих эти универсальные методы.

e_content "> Для решения этого ограничения, несколько автоматизированных и полуавтоматических систем μCP были получены. Чакра и др. др. разработали систему μCP, в котором пользовательские марки размещаются на железнодорожной системы и приводят в конформной контакте с золотым покрытием слайдов с использованием Пневматический привод с компьютерным управлением. Тем не менее, этот метод требует точного изготовление нестандартных конструкций марок и сообщает о точности 10 мкм, без доклада достигнутой точности при выполнении нескольких μCP шаги ^12. Совсем недавно, метод, использующий комплексный кинематической системы сцепления сообщили точность ниже 1 мкм с использованием одного шаблона, но не смогли точно выравнивать несколько шаблонов из-за отсутствия точного управления марке из пресс-формы для формования ^13. Кроме того, оба из предыдущих методов требует, чтобы субстрат остаются фиксированными между шагами паттерна , тем самым значительно ограничивая разнообразие модификации поверхности химических, которые могут бытьиспользован. Здесь мы опишем автоматизированная система R-μCP способны точной и точного выравнивания нескольких шагах μCP, позволяя максимально гибко марки проектирования и изготовления. Кроме того, узорчатые субстраты могут быть многократно удален из системы между штамповок, тем самым позволяя использование различных химических модификаций субстрат, в том числе последовательных нуклеофильными замен. Основания инженерные используя такие химические были использованы для клеточной культуры ранее как нас ^6,14 и др ^7. Таким образом, мы слились R-μCP и последовательные реакций нуклеофильного замещения в разработке метода для масштабируемого производства культуральных субстратах со сложными и micropatterned биохимических сигналов.

Протокол

1. Создание эластомерных Марки

1. Для создания кремниевых мастеров в PDMS штампа, шаблоны проектирования художественных фотошаблона, используя системы автоматизированного проектирования программного обеспечения.
   1. Дизайн первый рисунок в виде 20 х 20 массива колец с 300 мкм внутренний диаметр (ID) и 600 мкм ОД с 1200 мкм от центра до центра расстояния.
   2. Дизайн второй схеме, 20 х 20 массива колец с 600 мкм ID и 900 мкм ОД с 1200 мкм от центра до центра расстояния.
   3. Кроме того, место 1 х 1 мм ² квадратных контрольные метки на всех четырех углах каждой конструкции массива расстоянии 1200 мкм от центра до центра от углового шаблона под углом 45 °.
   4. Изготовление кремниевых мастеров для использования в этом эксперименте с 1: 1 пропорций, соотносить с глубиной художественного 300 мкм с использованием стандартных методов литографии, описанные в другом месте ¹⁵ или в сотрудничестве с микрожидкостных литейного,
      Примечание: Характеристика глубины меньше, чем 100 мкм, может привести к аномальной деформации марок до контакта с поверхности подложек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол начинается с того, уже полученные кремниевые мастеров с описанными моделями фоторезиста, что требует специального оборудования и чистые номера, чтобы создать. Лучше всего проконсультироваться с изготовителем или основной объект, чтобы создать эти узорчатые мастеров.
2. Silanize кремния мастера O / N в ходе инкубации с (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydroocty) трихлорсилана паров.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Силан пар является высокотоксичным и следует обращаться только в химическом вытяжном шкафу.
3. Создание обратную реплики из кремниевых мастеров путем отверждения 10: соотношение PDMS предварительного полимера и PDMS отвердителя на верхней части Силанизированные кремния мастеров в чашке Петри O / N при 60 ° C 1.
4. Удалить марки PDMS от кремния мастеров, и скрепления штампы акрилонитрил-бутадиен-стирол (ABS) подкладок или любой другой жесткий материалс с помощью клея.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Материал выбора не должно быть прозрачным или биологически совместимым. Тем не менее, он должен обеспечить плоскую поверхность для взаимодействия с роботизированной оснастки и более высокой жесткостью, чем PDMS.

2. Подготовка Coverslides

1. Промыть микроскопа coverslides (24 мм х 50 мм # 1) в толуола, метанола и разрушать ультразвуком в ацетоне в течение 1 мин перед промывкой этанолом и сушки в слабом потоке азота.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обращайтесь толуол и ацетон только в химическом вытяжном шкафу.
2. Пальто coverslides с ~ 3,5 нм титана (Ti), а затем 18,0 нм золота (Au), используя сфокусированный испаритель электронно-лучевой.
   Примечание: Эта процедура совместима с различными золотым покрытием подложек, включая кремния и полистирола. Хотя можно генерировать их на месте, золота, покрытые субстраты можно также получить через коммерческих поставщиков.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ti слои должны быть не менее 3 нм, в то время как слои Au на подложках должны бытьт мере 5 нм, и может быть в диапазоне вплоть до 1 мм по толщине в зависимости от идеальных оптических свойств конечного субстрата ^16,17. Подложки не обязаны быть оптически прозрачными для изготовления; Однако, это облегчает микроскопический анализ изготовленных подложках.
3. Промыть позолоченные coverslides с этанолом и сушат при нежной азота непосредственно перед использованием.

3. R-μCP из внешнее кольцо

1. Перед R-μCP с избирательно совместимой сформулированы манипулятор (SCARA) системы, калибровки роботов эффекторы инструмента и сопутствующих систем Двойная камера, используя программное обеспечение системы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти орудия изображены на рисунке 1.

Рисунок 1. R- μCP система и Robotic Arm Инструменты. (B) Роботизированная рука оснастки изображением (е) алмазный инструмент травления и (г) пневматический всасывающий инструмент проведения (H) ABS спинкой PDMS штамп.

2. Вручную разместить PDMS штамп с 600 мкм ID и 900 мкм OD выступающие кольца лицом вниз в печать гнездования приспособление. Вручную разместить свежеочищенной золотым покрытием coverslide в верхней части вакуумной патрона, показанной на фиг.1А, и иммобилизации его с помощью подключенного лабораторный вакуум.
3. Использование элементов управления робота, выровнять ведущего вниз камеру над центральной точки золотым покрытием coverslide, как на рисунке 2А.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот пункт может быть изначально определены путем визуального осмотра и не требует большой точности, как PDMS штамп гораздо крупэ, чем золотым покрытием слайд.
4. Поручить роботизированную руку для травления четыре ссылку "X" знаки в вершинах квадрата с размерами 3,8 мм на 3,8 мм с центром на покрытой золотом coverslide используя алмазный инструмент травления, прикрепленный к руке робота. (Изображенные на рисунке 2B; автоматизированный процесс)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это гарантирует, что все четыре контрольные точки находятся в одной визуальной рамках нисходящего фронтальная камера.
5. Использование роботов пневматический всасывающий инструментов, пикап и удерживайте в PDMS штамп 1 мм выше марка гнездования приспособление как на рисунке 2C. (Автоматизированный процесс)
6. Использование вверх камеру по ходу движения и светодиодной подсветки кольцо на фото на рисунке 2D и Е, визуализировать справочные квадратный знаки штампа и идентифицировать их с помощью программного обеспечения камеры 10 раз для того, чтобы определить среднюю X штампа, Y, и угловое смещение от центра Ось робот оснастки. (Автоматизированный процесс)
7. Как и в ПРИМЕЧАНИЕ: Внутренняя вычисление выполняется с помощью программного обеспечения роботизированной системы для точного выравнивания штампа и покровного в X, места центр Y и угловые смещения в будущих шагов R-μCP.
8. 3.8) Поместите штамп в ванну с алкантиол ATRP инициатора, ω-mercaptoundecyl бромизобутирата (2 мМ в этаноле), как изображено на рисунке 2F. (Автоматизированный процесс)
9. Снимите отметку с алкантиол решения и поместите его над потоком азота под давлением до 0,48 бар (5 фунтов на квадратный дюйм), чтобы испарить этанола как показано на рисунке 2G. После 1 мин увеличить давление в потоке азота является 1,03 бар (15 фунтов на квадратный дюйм) для обеспечения равномерного сухость. (Автоматизированный процесс)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Неполное сушки приведет к полной или частичной потере образов верности.
10. После высыхания, переместить штамп над расчетной центральной позицией с золотым покрытием стекло и опустите его с шагом в 100 мкм, контролируя Z-оси мотора силы, как показано на рисунке 2 полугодие.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это передается как крутящий момент, с которыми сталкивается Z-оси двигателя и отображается в программе робота наведения. (Автоматизированный процесс)
11. Остановка снижения штамп раз заданное давление 79,2 кПа достигнутый, и поддерживать контакт с горкой золотым покрытием в течение 15 сек. (Автоматизированный процесс)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Значения давления здесь оптимизированы для текущего штамп дизайна и художественного высоте. Если дизайн печать изменяется, специально для большого удлинения марок, мелодии них соответственно по проб и ошибок.
12. Медленно снимите отметку с золотым покрытием слайд и поместите штамп назад в печать гнездования приспособление. (Автоматизированный процесс)
ол>

4. SI-ATRP из PEGMEMA на Micropatterned Coverslides

1. Отпустите давление вакуума, удерживающий micropatterned coverslide, и перенести его на 50 мл шленк. Уплотнение и дегазации колбу Шленка с использованием вакуумного насоса.
2. Добавить 5.5 мл ATRP реакционной смеси, содержащей макромономера PEGMEMA (208,75 ммоль), воду (34,4 мл), метанол (43,8 мл), меди (II), бромид (1 ммоль) и 2 ', 2-бипиридин (3 ммоль), колбу Schlenk.
3. Добавить 0,5 мл аскорбата L-натрия (454,3 мМ) в воде, чтобы инициировать реакцию, и дать ему возможность продолжаться в течение 16 ч при комнатной температуре в атмосфере инертного газа.
   Примечание: После того аскорбата L-натрия, цвет реакции будет смещаться от светло-зеленого до темно-коричневого, как показано на фигуре 3А-В.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция может продолжаться и после 16 часов, но это не будет существенно увеличить длину щеток PEG.

Рисунок 3. Инициирование SI-ATRP. (А) Инициирование реакции и (б) последующее изменение цвета следующим добавлением аскорбата L-натрия. (C) Микроскоп образ micropatterned поверхности coverslide следующем порядке SI-ATRP. Масштабная линейка 1 мм.

4. Снимите micropatterned coverslide из колбы Шенк и промывают этанолом, водой и этанолом и сушат при слабом потоке азота.
   Примечание: После SI-ATRP, модификации поверхности должна быть видна глазу и могут быть отображены и анализировали под микроскопом, как на фиг.3С.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это самый простой способ, чтобы проверить точность суде, как это устраняет необходимость immunostain подложек.

5. Azide Функционализация Micropatterned PEGMEMA цепи

1. Поместите micropatterned coverslide в 20 мл реакционной стекло флакона.
2. Добавить 6 мл N, N-диметилформамид (ДМФ), содержащим 100 мМ азид натрия в реакционную пробирку. Поддержание этой реакции при 37 ° С в течение 24 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обращайтесь DMF только в химическом вытяжном шкафу. Соблюдайте осторожность при взвешивании азид натрия.
3. По завершении удалить micropatterned coverslide из реакционной ампуле и промывают этанолом, затем водой и сушат в потоке азота.

6. пассивация Бром Функционализированный PEGMEMA цепи

1. Поместите micropatterned coverslide в 20 мл реакционных стеклянных флаконах.
2. Добавить 6 мл диметилсульфоксида (ДМСО), содержащем 100 мМ этаноламина и 300 мМ триэтиламина в реакционный сосуд. Удерживая эту реакцию при 40 ° С в течение 24 ч.
   Примечание: Ручка ДМСО, этаноламин, триэтиламин и лишь в химическом вытяжном шкафу.
3. После завершения удаления micropatterned coverslIDE из реакционной ампуле, промывают этанолом, затем водой и сушат в потоке азота.

7. R-μCP внутреннего кольцевого пространства и SI-ATRP из PEGMEMA

1. Провести R-μCP шаги, как описано ранее в шагах 3,2 и 3,6 - 3,12, заменив PDMS штамп с 300 мкм ID и 600 мкм OD выступающей колец, таким образом, что кольца с меньшими функциями размещены внутри ранее micropatterned колец.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пороговое давление для этой марки является 132,0 кПа. Как упоминалось ранее, эти параметры давления оптимизированы для На марке, используемых в этом эксперименте.
2. Провести SI-ATRP шаги, как описано выше в пунктах 4.1 - 4.4.

8. Ацетилен Функционализация Micropatterned PEGMEMA цепи

1. Поместите micropatterned coverslide в 20 мл реакционной стекло флакона.
2. Добавить 6 мл ДМСО, содержащего 100 мМпропаргиламин в реакционную пробирку. Поддержание этой реакции при комнатной температуре в течение 24 ч.
   Примечание: Ручка ДМСО и пропаргиламин только в химическом вытяжном шкафу.
3. По завершении удалить micropatterned coverslide из реакционной ампуле и промывают этанолом, затем водой и сушат в потоке азота.

9. Медь катализируемой "Нажмите" Биотинилирование ацетилена Прекращено PEGMEMA цепи

1. Поместите micropatterned coverslide в 20 мл реакционной стекло флакона.
2. Добавить 6 мл сульфата меди (15 мм) / Трис [(1-бензил-1Н-1,2,3-триазол-4-ил) метил] амина (TBTA, 30 мМ) (1: 1 об / об Вода / DMF), содержащей 562 мкМ азид-PEG ₄ биотин, сопряженный с реакционную пробирку. Добавить 1,2 мл L-аскорбиновой кислоты (0,15 мМ) в воде к смеси, чтобы инициализировать реакции.
3. Пузырь азот через реакционный раствор в течение 10 сек, печать флакон с Parafilm, и реагировать в течение 24 ч при комнатной температуре.
4. По completioп удалить micropatterned coverslide от реакции флакона, промыть водой и поместить его в полистирольной блюдо 12-а.

10. Иммунофлуоресцентное Обнаружение Биотинилированные ацетилена групп

1. Блок micropatterned coverslide в DPBS (3% осел сыворотки) в течение 1 ч при комнатной температуре. Пятно для биотинилированных ацетиленовых групп со стрептавидин-546 конъюгата (2 мкг / мл) в ППД (3% осел сыворотки в PBS) в течение 2 ч при комнатной температуре.
2. Промыть micropatterned coverslide 5 раз с DPBS в течение 10 мин при осторожном перемешивании.
   Примечание: На рисунке 4B изображает изображение на слайде после этот шаг завершен.

11. Медь-бесплатно "Нажмите" Биотинилирование азида Прекращено PEGMEMA цепи

Примечание: Если желательно, эта подложка модификация стадия может быть осуществлена ​​на месте во время культивирования клеток.

1. Оставьте micropatterned coverslide в 12-а рolystyrene блюдо следующее ППД полоскания.
2. Добавить 2 мл ППД (или клеточной культуральной среде), содержащей 20 мкМ DBCO-ПЭГ ₄ биотин, и эта реакция позволит продолжать в течение 24 ч при комнатной температуре (или при 37 ° С в инкубаторе).
3. По окончании, промойте micropatterned coverslide 5 раз DPBS (или просто выполнить изменение медиа).

12. Иммунофлуоресцентное Обнаружение Биотинилированные азида групп

1. Пятно для биотинилированных групп азида со стрептавидин-488 конъюгата (2 мкг / мл) в 2 мл DPBS (3% осел сыворотки) в течение 2 ч при комнатной температуре.
2. Промыть micropatterned coverslide 5 раз в DPBS в течение 10 мин при легком помешивании.
3. Изображение micropatterned coverslide помощью флуоресцентной конфокальной микроскопии. 4А-C изображает образы слайде после этот шаг завершен.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании подложек для культивирования тканей анализов, пропустите разделы 10 и 12 настоящего Протокола. После желаемого degreэлектронной функционализации, стерилизовать инженерии coverslide путем промывки обеих сторон 100% -ным этанолом и сушки в токе азота. Трансфер слайд в стерильную бокс биологической безопасности и промойте слайд с PBS пять раз, прежде чем приступить посева клеток и культуры.

Результаты

Использование ручных методов выравнивания μCP спроектировать культуральных субстратах с массивами ПЭГ-привитых щеток функционализированных с ортогональным "щелчок" химические была продемонстрирована в предыдущей работе ^6. Тем не менее, это дает минимальный контроль ориентации потоков и часто приводит к перекрытию областей функционализированных. Здесь, новая система R-μCP используется, чтобы преодолеть это ограничение, и его способность точно шаблон массив ПЭГ щетки колец с ID 300 мкм и 600 мкм OD представляя ...

Обсуждение

Идеальные субстраты для тканевой инженерии будет биоинспирированных и тем самым воспроизводят пространственное распределение критических биологически активных лигандов, найденных в пределах родных тканей. Они также обладают динамические свойства, которые позволяют временные корректировки лигандов и пространственных структур, в котором они представлены, чтобы обеспечить направленный ткани морфогенез и пространственно ограниченных индукцию клеточной судьбы. Изготовление таких субстратов требует иммобилизации многочисленны...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
SCARA	Epson	LS3-401ST	По желанию доступны модели более высокого класса с повышенной точностью.
(Тридекафтор-1,1,2,2-тетрагидрооктил)трихлорсилан	Гелест	SIT8174.0	ВНИМАНИЕ, Следует обрабатывать только в вытяжном шкафу для химикатов. При силанизации пластин никто не должен входить в колпак до тех пор, пока весь силан не испарится.
Sylgard 184 Набор силиконовых эластомеров	Ellsworth Adhesive Co	NC9020938	тщательно дегазирует растворы с помощью вакуумного воздействия перед использованием. Альтернативные наборы, такие как Kit 182, приемлемы.
24 мм x 50 мм #1 Предметные стекла	Fisher Scientific	48393106	Их можно приобрести у ряда поставщиков с различными размерами в соответствии с потребностями.
CHA-600 Электронно-лучевой испаритель	Telemark	SEC-600-RAP	Требуется специализированное обучение.
EPSON LS3 SCARA	EPSON	LS3-401ST&
omega;-мерткаптундецилброизобутират	Prochimia	FT 015-m11-0.2	Хранить при -20°С. Другие инициаторы ATRP могут быть использованы в качестве этого R-μ Платформа CP применима ко всем модальностям микроструктурирования.
Schlenk Tube Flask 50 мл	Synthware	60003-078	Требуются резиновые пробки с диафрагмой.
Метакрилат метилэфира полиэтиленгликоля	Sigma Aldrich	447943	отгружен, содержащий ингибиторы свободного чтения MEHQ и BHT.
Метанол (сертифицированный ACS)	Fisher Scientific	A412-4	ВНИМАНИЕ, работать только в вытяжном шкафу для химикатов.
Бромид меди(II)	Sigma Aldrich	437867	ОСТОРОЖНО, ограничьте воздействие хирургической маской.
2,2'-бипиридин	Сигма Олдрич	D216305	ОСТОРОЖНО, ограничить воздействие хирургической маской.
L-аскорбат натрия	Sigma Aldrich	A4034
20 мл боросиликатное стекло Сцинтилляционные флаконы	Fisher Scientific	03-340-4E
Азид натрия	Sigma Aldrich	S2002	ВНИМАНИЕ, ограничьте воздействие хирургической маской.
N,N-диметиформамид	Sigma Aldrich	227056	ОСТОРОЖНО, обрабатывать только в вытяжном шкафу для химических веществ.
Этаноламин	Sigma Aldrich	398136	ОСТОРОЖНО, обрабатывать только в вытяжном шкафу для химических веществ.
Триэтиламин	Sigma Aldrich	T0886	ВНИМАНИЕ, ручка только в вытяжном шкафу для химических веществ.
Диметилсульфоксид	Sigma Aldrich	276855	ВНИМАНИЕ, обрабатывать только в вытяжном шкафу для химических веществ.
Пропаргиламин	Sigma Aldrich	P50900	ВНИМАНИЕ, ручка только в вытяжном шкафу для химических веществ.
200 Proof Ethanol	University of Wisconsin Material Distribution Services	2292	ВНИМАНИЕ, ручка только в вытяжном шкафу для химических веществ.
Азид-ПЭГ3-биотин	ClickChemistryTools	AZ104-100	Солюбилизированный в ДМФ
Сульфат меди (II)	Sigma Aldrich	C1297	ВНИМАНИЕ, ограничьте воздействие хирургической маской.
Трис[(1-бензил-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил]амин (TBTA)	Сигма Олдрич	678937
L-аскорбиновая кислота	Сигма Олдрич	A7506
Фосфатный буфер Физиологический раствор	Инвитроген	14190144
Ослиная сыворотка	Сигма Олдрич	D9663	Ослиная сыворотка, загрязненные предметы, считаются биологически опасными материалами и должны быть утилизированы соответствующим образом. Различные другие соединения (например BSA) доступны и служат этой цели.
12-луночные полистирольные пластины	Thermo Scientifit - NUNC	07-200-81	Пластины можно приобрести у ряда поставщиков с различными размерами.
DBCO-PEG4-биотин	Clickchemistytools	A105P4-10	Солюбилизированный в DMF
Стрептавидин, Alexa Fluor 488 Конъюгированный	Life Technologies	S-11223	Солюбилизированный в PBS
Стрептавидин, Alexa Fluor 546 конъюгированный	Life Technologies	S-11225	Солюбилизированный в PBS
Nikon A1-R Конфокальный микроскоп	Nikon	Eclipse Ti, A1R	Эпифлуоресцентного микроскопа достаточно для визуализации функционализированных микроструктурированных подложек.