Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Изготовление Комплексные Субстраты культуры с помощью робота-микроконтактной печати (R-μCP) и Sequential нуклеофильного замещения

9.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52186

⸱

31 октября 2014 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin, Madison, 2Department of Mechanical Engineering, University of Wisconsin, Madison

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Субстраты клеточных культур, функционализированные микромасштабными структурами биологических лигандов, имеют огромную полезность в области тканевой инженерии. В данной работе мы демонстрируем универсальное и автоматизированное производство субстратов для тканевых культур с помощью нескольких микроструктурированных полиэтиленгликолевых щеток, представляющих собой ортогональные химические составы, которые обеспечивают пространственно точную и сайт-специфичную иммобилизацию биологических лигандов.

Аннотация

В тканевой инженерии желательно демонстрировать пространственный контроль морфологии тканей и судьбы клеток в культуре в микронном масштабе. Для решения этой задачи можно использовать культуральные субстраты, представляющие собой привитые кисти из полиэтиленгликоля (ПЭГ), путем создания микромасштабных, необрастающих и устойчивых к клеточной адгезии областей, а также областей, где клетки участвуют в биоспецифических взаимодействиях с ковалентно привязанными лигандами. Чтобы спроектировать сложные ткани с использованием таких субстратов, потребуется последовательно смоделировать несколько кистей ПЭГ, функционализированных для придания дифференциальной биологической активности и выровненных в микромасштабных ориентациях, которые имитируют ниши in vivo. Микроконтактная печать (μCP) — это универсальный метод создания образцов для таких привитых PEG-кистей, но ручная μCP не может быть выполнена с микромасштабной точностью. Таким образом, мы объединили передовую робототехнику с методами мягкой литографии и новыми реакциями химии поверхности для разработки метода роботизированной микроконтактной печати (R-μCP) для изготовления культуральных подложек со сложными, микромасштабными и высокоупорядоченными узорами PEG-кистей, представляющих ортогональные «кликовые» химические составы. Здесь мы подробно опишем рабочий процесс изготовления таких подложек.

Введение

Способность ПЭГ-привитых поверхностей для отображения ковалентно связанные биохимические лиганды, одновременно поддерживая присущие не-обрастания свойства делают их идеальным выбором для инженерных пользовательских сред микромасштабных на культуральных субстратах 1,2,3. Биоспецифического взаимодействия, опосредованные лигандов конъюгировали PEG щеток позволяет упрощенное анализ последствий биохимических сигналов, обнаруженных в комплексе в естественных условиях микросреды тканей на отдельных фенотипов клеток. Кроме того, био-ортогональное "щелчок" химические соединения могут быть использованы для облегчения направленного иммобилизацию лигандов так, что они представлены в нативных конформаций 4-6. Таким образом, микромасштабная пространственное структурирование ПЭГ щетки является универсальным инструментом для создания дизайнера в нишах пробирке расследовать сигнализацию клеток, вызванную иммобилизованных биохимических сигналов 6,7.

Общий метод генерации пространственных моделей биохимических у.е.эс влечет микроконтактная печати (μCP) позолоченные субстраты с узорами PEG сопряженных алкантиолов. Затем micropatterned самоассоциированные монослоя (Sams) ПЭГ-ylated алкантиолов ограничивает физическую адсорбцию биохимических молекул, например, белков, только для не-рисунком регионах подложки 8,9. Тем не менее, ЗРК, генерируемые этой техники чувствительны к окислению в долгосрочной клеточной культуральной среде. Таким образом, μCP'd алкантиол ЗРК часто дополнительно привиты с ПЭГ полимерных щеток, используя поверхность инициативе переноса атома радикальной полимеризации (SI-ATRP), чтобы увеличить не обрастания стабильность в регионе 10. В частности, μCP из алкантиол инициатора полимеризации, ω-meraptoundecyl бромизобутирата, на золотым покрытием поверхностей с последующим SI-ATRP поли (этиленгликоля) метилового эфира метакриловой (PEGMEMA) мономеров генерирует поверхностей с micropatterned долгосрочной перспективе, стабильное, и не- Загрязнение ПЭГ щетки. Более того, эти способны быть дополнительно модифицированы, чтобы представить разнообразны химические группы 11.

Воспользовавшись этой собственности, Ша и др. др. разработал метод спроектировать культуры субстратов с многокомпонентных PEGMEMA кистей, представляющих ортогональных "щелчок" химии. В этом методе используют серию μCP / SI-ATRP шагов перемежаются с азидом натрия последовательный, этаноламина, и пропаргиламин нуклеофильные замен для создания культуральных субстратах, представляющие микромасштабная образцы нескольких иммобилизованных лигандов 6. В то время как потенциал с помощью таких химических процессов в сочетании с ручным μCP проектировать новые культуральные субстраты огромна, она ограничена точностью и аккуратностью, с которой несколько шагов μCP могут быть выровнены на одной подложке. Высокий уровень точности и аккуратности необходимо будет воспроизводимо производство комплекс в пробирке ниш, использующих эти универсальные методы.

e_content "> Для решения этого ограничения, несколько автоматизированных и полуавтоматических систем μCP были получены. Чакра и др. др. разработали систему μCP, в котором пользовательские марки размещаются на железнодорожной системы и приводят в конформной контакте с золотым покрытием слайдов с использованием Пневматический привод с компьютерным управлением. Тем не менее, этот метод требует точного изготовление нестандартных конструкций марок и сообщает о точности 10 мкм, без доклада достигнутой точности при выполнении нескольких μCP шаги 12. Совсем недавно, метод, использующий комплексный кинематической системы сцепления сообщили точность ниже 1 мкм с использованием одного шаблона, но не смогли точно выравнивать несколько шаблонов из-за отсутствия точного управления марке из пресс-формы для формования 13. Кроме того, оба из предыдущих методов требует, чтобы субстрат остаются фиксированными между шагами паттерна , тем самым значительно ограничивая разнообразие модификации поверхности химических, которые могут бытьиспользован. Здесь мы опишем автоматизированная система R-μCP способны точной и точного выравнивания нескольких шагах μCP, позволяя максимально гибко марки проектирования и изготовления. Кроме того, узорчатые субстраты могут быть многократно удален из системы между штамповок, тем самым позволяя использование различных химических модификаций субстрат, в том числе последовательных нуклеофильными замен. Основания инженерные используя такие химические были использованы для клеточной культуры ранее как нас 6,14 и др 7. Таким образом, мы слились R-μCP и последовательные реакций нуклеофильного замещения в разработке метода для масштабируемого производства культуральных субстратах со сложными и micropatterned биохимических сигналов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Создание эластомерных Марки

  1. Для создания кремниевых мастеров в PDMS штампа, шаблоны проектирования художественных фотошаблона, используя системы автоматизированного проектирования программного обеспечения.
    1. Дизайн первый рисунок в виде 20 х 20 массива колец с 300 мкм внутренний диаметр (ID) и 600 мкм ОД с 1200 мкм от центра до центра расстояния.
    2. Дизайн второй схеме, 20 х 20 массива колец с 600 мкм ID и 900 мкм ОД с 1200 мкм от центра до центра расстояния.
    3. Кроме того, место 1 х 1 мм 2 квадратных контрольные метки на всех четырех углах каждой конструкции массива расстоянии 1200 мкм от центра до центра от углового шаблона под углом 45 °.
    4. Изготовление кремниевых мастеров для использования в этом эксперименте с 1: 1 пропорций, соотносить с глубиной художественного 300 мкм с использованием стандартных методов литографии, описанные в другом месте 15 или в сотрудничестве с микрожидкостных литейного,
      Примечание: Характеристика глубины меньше, чем 100 мкм, может привести к аномальной деформации марок до контакта с поверхности подложек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол начинается с того, уже полученные кремниевые мастеров с описанными моделями фоторезиста, что требует специального оборудования и чистые номера, чтобы создать. Лучше всего проконсультироваться с изготовителем или основной объект, чтобы создать эти узорчатые мастеров.
  2. Silanize кремния мастера O / N в ходе инкубации с (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydroocty) трихлорсилана паров.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Силан пар является высокотоксичным и следует обращаться только в химическом вытяжном шкафу.
  3. Создание обратную реплики из кремниевых мастеров путем отверждения 10: соотношение PDMS предварительного полимера и PDMS отвердителя на верхней части Силанизированные кремния мастеров в чашке Петри O / N при 60 ° C 1.
  4. Удалить марки PDMS от кремния мастеров, и скрепления штампы акрилонитрил-бутадиен-стирол (ABS) подкладок или любой другой жесткий материалс с помощью клея.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Материал выбора не должно быть прозрачным или биологически совместимым. Тем не менее, он должен обеспечить плоскую поверхность для взаимодействия с роботизированной оснастки и более высокой жесткостью, чем PDMS.

2. Подготовка Coverslides

  1. Промыть микроскопа coverslides (24 мм х 50 мм # 1) в толуола, метанола и разрушать ультразвуком в ацетоне в течение 1 мин перед промывкой этанолом и сушки в слабом потоке азота.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обращайтесь толуол и ацетон только в химическом вытяжном шкафу.
  2. Пальто coverslides с ~ 3,5 нм титана (Ti), а затем 18,0 нм золота (Au), используя сфокусированный испаритель электронно-лучевой.
    Примечание: Эта процедура совместима с различными золотым покрытием подложек, включая кремния и полистирола. Хотя можно генерировать их на месте, золота, покрытые субстраты можно также получить через коммерческих поставщиков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ti слои должны быть не менее 3 нм, в то время как слои Au на подложках должны бытьт мере 5 нм, и может быть в диапазоне вплоть до 1 мм по толщине в зависимости от идеальных оптических свойств конечного субстрата 16,17. Подложки не обязаны быть оптически прозрачными для изготовления; Однако, это облегчает микроскопический анализ изготовленных подложках.
  3. Промыть позолоченные coverslides с этанолом и сушат при нежной азота непосредственно перед использованием.

3. R-μCP из внешнее кольцо

  1. Перед R-μCP с избирательно совместимой сформулированы манипулятор (SCARA) системы, калибровки роботов эффекторы инструмента и сопутствующих систем Двойная камера, используя программное обеспечение системы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти орудия изображены на рисунке 1.

figure-protocol-1
Рисунок 1. R- μCP система и Robotic Arm Инструменты. (B) Роботизированная рука оснастки изображением (е) алмазный инструмент травления и (г) пневматический всасывающий инструмент проведения (H) ABS спинкой PDMS штамп.

  1. Вручную разместить PDMS штамп с 600 мкм ID и 900 мкм OD выступающие кольца лицом вниз в печать гнездования приспособление. Вручную разместить свежеочищенной золотым покрытием coverslide в верхней части вакуумной патрона, показанной на фиг.1А, и иммобилизации его с помощью подключенного лабораторный вакуум.
  2. Использование элементов управления робота, выровнять ведущего вниз камеру над центральной точки золотым покрытием coverslide, как на рисунке 2А.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот пункт может быть изначально определены путем визуального осмотра и не требует большой точности, как PDMS штамп гораздо крупэ, чем золотым покрытием слайд.
  3. Поручить роботизированную руку для травления четыре ссылку "X" знаки в вершинах квадрата с размерами 3,8 мм на 3,8 мм с центром на покрытой золотом coverslide используя алмазный инструмент травления, прикрепленный к руке робота. (Изображенные на рисунке 2B; автоматизированный процесс)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это гарантирует, что все четыре контрольные точки находятся в одной визуальной рамках нисходящего фронтальная камера.
  4. Использование роботов пневматический всасывающий инструментов, пикап и удерживайте в PDMS штамп 1 мм выше марка гнездования приспособление как на рисунке 2C. (Автоматизированный процесс)
  5. Использование вверх камеру по ходу движения и светодиодной подсветки кольцо на фото на рисунке 2D и Е, визуализировать справочные квадратный знаки штампа и идентифицировать их с помощью программного обеспечения камеры 10 раз для того, чтобы определить среднюю X штампа, Y, и угловое смещение от центра Ось робот оснастки. (Автоматизированный процесс)
  6. Как и в ПРИМЕЧАНИЕ: Внутренняя вычисление выполняется с помощью программного обеспечения роботизированной системы для точного выравнивания штампа и покровного в X, места центр Y и угловые смещения в будущих шагов R-μCP.
  7. 3.8) Поместите штамп в ванну с алкантиол ATRP инициатора, ω-mercaptoundecyl бромизобутирата (2 мМ в этаноле), как изображено на рисунке 2F. (Автоматизированный процесс)
  8. Снимите отметку с алкантиол решения и поместите его над потоком азота под давлением до 0,48 бар (5 фунтов на квадратный дюйм), чтобы испарить этанола как показано на рисунке 2G. После 1 мин увеличить давление в потоке азота является 1,03 бар (15 фунтов на квадратный дюйм) для обеспечения равномерного сухость. (Автоматизированный процесс)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Неполное сушки приведет к полной или частичной потере образов верности.
  9. После высыхания, переместить штамп над расчетной центральной позицией с золотым покрытием стекло и опустите его с шагом в 100 мкм, контролируя Z-оси мотора силы, как показано на рисунке 2 полугодие.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это передается как крутящий момент, с которыми сталкивается Z-оси двигателя и отображается в программе робота наведения. (Автоматизированный процесс)
  10. Остановка снижения штамп раз заданное давление 79,2 кПа достигнутый, и поддерживать контакт с горкой золотым покрытием в течение 15 сек. (Автоматизированный процесс)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Значения давления здесь оптимизированы для текущего штамп дизайна и художественного высоте. Если дизайн печать изменяется, специально для большого удлинения марок, мелодии них соответственно по проб и ошибок.
  11. Медленно снимите отметку с золотым покрытием слайд и поместите штамп назад в печать гнездования приспособление. (Автоматизированный процесс)
    12. ол>

    4. SI-ATRP из PEGMEMA на Micropatterned Coverslides

    1. Отпустите давление вакуума, удерживающий micropatterned coverslide, и перенести его на 50 мл шленк. Уплотнение и дегазации колбу Шленка с использованием вакуумного насоса.
    2. Добавить 5.5 мл ATRP реакционной смеси, содержащей макромономера PEGMEMA (208,75 ммоль), воду (34,4 мл), метанол (43,8 мл), меди (II), бромид (1 ммоль) и 2 ', 2-бипиридин (3 ммоль), колбу Schlenk.
    3. Добавить 0,5 мл аскорбата L-натрия (454,3 мМ) в воде, чтобы инициировать реакцию, и дать ему возможность продолжаться в течение 16 ч при комнатной температуре в атмосфере инертного газа.
      Примечание: После того аскорбата L-натрия, цвет реакции будет смещаться от светло-зеленого до темно-коричневого, как показано на фигуре 3А-В.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция может продолжаться и после 16 часов, но это не будет существенно увеличить длину щеток PEG.

    figure-protocol-2 Рисунок 3. Инициирование SI-ATRP. (А) Инициирование реакции и (б) последующее изменение цвета следующим добавлением аскорбата L-натрия. (C) Микроскоп образ micropatterned поверхности coverslide следующем порядке SI-ATRP. Масштабная линейка 1 мм.

    1. Снимите micropatterned coverslide из колбы Шенк и промывают этанолом, водой и этанолом и сушат при слабом потоке азота.
      Примечание: После SI-ATRP, модификации поверхности должна быть видна глазу и могут быть отображены и анализировали под микроскопом, как на фиг.3С.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это самый простой способ, чтобы проверить точность суде, как это устраняет необходимость immunostain подложек.

    5. Azide Функционализация Micropatterned PEGMEMA цепи

    1. Поместите micropatterned coverslide в 20 мл реакционной стекло флакона.
    2. Добавить 6 мл N, N-диметилформамид (ДМФ), содержащим 100 мМ азид натрия в реакционную пробирку. Поддержание этой реакции при 37 ° С в течение 24 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обращайтесь DMF только в химическом вытяжном шкафу. Соблюдайте осторожность при взвешивании азид натрия.
    3. По завершении удалить micropatterned coverslide из реакционной ампуле и промывают этанолом, затем водой и сушат в потоке азота.

    6. пассивация Бром Функционализированный PEGMEMA цепи

    1. Поместите micropatterned coverslide в 20 мл реакционных стеклянных флаконах.
    2. Добавить 6 мл диметилсульфоксида (ДМСО), содержащем 100 мМ этаноламина и 300 мМ триэтиламина в реакционный сосуд. Удерживая эту реакцию при 40 ° С в течение 24 ч.
      Примечание: Ручка ДМСО, этаноламин, триэтиламин и лишь в химическом вытяжном шкафу.
    3. После завершения удаления micropatterned coverslIDE из реакционной ампуле, промывают этанолом, затем водой и сушат в потоке азота.

    7. R-μCP внутреннего кольцевого пространства и SI-ATRP из PEGMEMA

    1. Провести R-μCP шаги, как описано ранее в шагах 3,2 и 3,6 - 3,12, заменив PDMS штамп с 300 мкм ID и 600 мкм OD выступающей колец, таким образом, что кольца с меньшими функциями размещены внутри ранее micropatterned колец.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пороговое давление для этой марки является 132,0 кПа. Как упоминалось ранее, эти параметры давления оптимизированы для На марке, используемых в этом эксперименте.
    2. Провести SI-ATRP шаги, как описано выше в пунктах 4.1 - 4.4.

    8. Ацетилен Функционализация Micropatterned PEGMEMA цепи

    1. Поместите micropatterned coverslide в 20 мл реакционной стекло флакона.
    2. Добавить 6 мл ДМСО, содержащего 100 мМпропаргиламин в реакционную пробирку. Поддержание этой реакции при комнатной температуре в течение 24 ч.
      Примечание: Ручка ДМСО и пропаргиламин только в химическом вытяжном шкафу.
    3. По завершении удалить micropatterned coverslide из реакционной ампуле и промывают этанолом, затем водой и сушат в потоке азота.

    9. Медь катализируемой "Нажмите" Биотинилирование ацетилена Прекращено PEGMEMA цепи

    1. Поместите micropatterned coverslide в 20 мл реакционной стекло флакона.
    2. Добавить 6 мл сульфата меди (15 мм) / Трис [(1-бензил-1Н-1,2,3-триазол-4-ил) метил] амина (TBTA, 30 мМ) (1: 1 об / об Вода / DMF), содержащей 562 мкМ азид-PEG 4 биотин, сопряженный с реакционную пробирку. Добавить 1,2 мл L-аскорбиновой кислоты (0,15 мМ) в воде к смеси, чтобы инициализировать реакции.
    3. Пузырь азот через реакционный раствор в течение 10 сек, печать флакон с Parafilm, и реагировать в течение 24 ч при комнатной температуре.
    4. По completioп удалить micropatterned coverslide от реакции флакона, промыть водой и поместить его в полистирольной блюдо 12-а.

    10. Иммунофлуоресцентное Обнаружение Биотинилированные ацетилена групп

    1. Блок micropatterned coverslide в DPBS (3% осел сыворотки) в течение 1 ч при комнатной температуре. Пятно для биотинилированных ацетиленовых групп со стрептавидин-546 конъюгата (2 мкг / мл) в ППД (3% осел сыворотки в PBS) в течение 2 ч при комнатной температуре.
    2. Промыть micropatterned coverslide 5 раз с DPBS в течение 10 мин при осторожном перемешивании.
      Примечание: На рисунке 4B изображает изображение на слайде после этот шаг завершен.

    11. Медь-бесплатно "Нажмите" Биотинилирование азида Прекращено PEGMEMA цепи

    Примечание: Если желательно, эта подложка модификация стадия может быть осуществлена ​​на месте во время культивирования клеток.

    1. Оставьте micropatterned coverslide в 12-а рolystyrene блюдо следующее ППД полоскания.
    2. Добавить 2 мл ППД (или клеточной культуральной среде), содержащей 20 мкМ DBCO-ПЭГ 4 биотин, и эта реакция позволит продолжать в течение 24 ч при комнатной температуре (или при 37 ° С в инкубаторе).
    3. По окончании, промойте micropatterned coverslide 5 раз DPBS (или просто выполнить изменение медиа).

    12. Иммунофлуоресцентное Обнаружение Биотинилированные азида групп

    1. Пятно для биотинилированных групп азида со стрептавидин-488 конъюгата (2 мкг / мл) в 2 мл DPBS (3% осел сыворотки) в течение 2 ч при комнатной температуре.
    2. Промыть micropatterned coverslide 5 раз в DPBS в течение 10 мин при легком помешивании.
    3. Изображение micropatterned coverslide помощью флуоресцентной конфокальной микроскопии. 4А-C изображает образы слайде после этот шаг завершен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании подложек для культивирования тканей анализов, пропустите разделы 10 и 12 настоящего Протокола. После желаемого degreэлектронной функционализации, стерилизовать инженерии coverslide путем промывки обеих сторон 100% -ным этанолом и сушки в токе азота. Трансфер слайд в стерильную бокс биологической безопасности и промойте слайд с PBS пять раз, прежде чем приступить посева клеток и культуры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Использование ручных методов выравнивания μCP спроектировать культуральных субстратах с массивами ПЭГ-привитых щеток функционализированных с ортогональным "щелчок" химические была продемонстрирована в предыдущей работе 6. Тем не менее, это дает минимальный контроль ориентации потоков и часто приводит к перекрытию областей функционализированных. Здесь, новая система R-μCP используется, чтобы преодолеть это ограничение, и его способность точно шаблон массив ПЭГ щетки колец с ID 300 мкм и 600 мкм OD представляя ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Идеальные субстраты для тканевой инженерии будет биоинспирированных и тем самым воспроизводят пространственное распределение критических биологически активных лигандов, найденных в пределах родных тканей. Они также обладают динамические свойства, которые позволяют временные корректировки лигандов и пространственных структур, в котором они представлены, чтобы обеспечить направленный ткани морфогенез и пространственно ограниченных индукцию клеточной судьбы. Изготовление таких субстратов требует иммобилизации многочисленны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Финансирование этой работы, GTK, TK и JDM были предоставлены Висконсинским институтом открытий и Висконсинским исследовательским фондом выпускников.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
SCARA EpsonLS3-401STПо желанию доступны модели более высокого класса с повышенной точностью.
(Тридекафтор-1,1,2,2-тетрагидрооктил)трихлорсиланГелестSIT8174.0ВНИМАНИЕ, Следует обрабатывать только в вытяжном шкафу для химикатов. При силанизации пластин никто не должен входить в колпак до тех пор, пока весь силан не испарится.
Sylgard 184 Набор силиконовых эластомеровEllsworth Adhesive CoNC9020938тщательно дегазирует растворы с помощью вакуумного воздействия перед использованием. Альтернативные наборы, такие как Kit 182, приемлемы.
24 мм x 50 мм #1 Предметные стеклаFisher Scientific48393106Их можно приобрести у ряда поставщиков с различными размерами в соответствии с потребностями.
CHA-600 Электронно-лучевой испарительTelemarkSEC-600-RAPТребуется специализированное обучение.
EPSON LS3 SCARAEPSONLS3-401ST&
omega;-мерткаптундецилброизобутиратProchimiaFT 015-m11-0.2Хранить при -20°С. Другие инициаторы ATRP могут быть использованы в качестве этого R-μ Платформа CP применима ко всем модальностям микроструктурирования.
Schlenk Tube Flask 50 млSynthware60003-078Требуются резиновые пробки с диафрагмой.
Метакрилат метилэфира полиэтиленгликоляSigma Aldrich447943отгружен, содержащий ингибиторы свободного чтения MEHQ и BHT.
Метанол (сертифицированный ACS)Fisher ScientificA412-4ВНИМАНИЕ, работать только в вытяжном шкафу для химикатов.
Бромид меди(II)Sigma Aldrich437867ОСТОРОЖНО, ограничьте воздействие хирургической маской.
2,2'-бипиридинСигма ОлдричD216305ОСТОРОЖНО, ограничить воздействие хирургической маской.
L-аскорбат натрияSigma AldrichA4034
20 мл боросиликатное стекло Сцинтилляционные флаконыFisher Scientific03-340-4E
Азид натрияSigma AldrichS2002ВНИМАНИЕ, ограничьте воздействие хирургической маской.
N,N-диметиформамидSigma Aldrich227056ОСТОРОЖНО, обрабатывать только в вытяжном шкафу для химических веществ.
ЭтаноламинSigma Aldrich398136ОСТОРОЖНО, обрабатывать только в вытяжном шкафу для химических веществ.
ТриэтиламинSigma AldrichT0886ВНИМАНИЕ, ручка только в вытяжном шкафу для химических веществ.
ДиметилсульфоксидSigma Aldrich276855ВНИМАНИЕ, обрабатывать только в вытяжном шкафу для химических веществ.
ПропаргиламинSigma AldrichP50900ВНИМАНИЕ, ручка только в вытяжном шкафу для химических веществ.
200 Proof EthanolUniversity of Wisconsin Material Distribution Services2292ВНИМАНИЕ, ручка только в вытяжном шкафу для химических веществ.
Азид-ПЭГ3-биотинClickChemistryToolsAZ104-100Солюбилизированный в ДМФ
Сульфат меди (II)Sigma AldrichC1297ВНИМАНИЕ, ограничьте воздействие хирургической маской.
Трис[(1-бензил-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил]амин (TBTA)Сигма Олдрич678937
L-аскорбиновая кислотаСигма ОлдричA7506
Фосфатный буфер Физиологический растворИнвитроген14190144
Ослиная сывороткаСигма ОлдричD9663Ослиная сыворотка, загрязненные предметы, считаются биологически опасными материалами и должны быть утилизированы соответствующим образом. Различные другие соединения (например BSA) доступны и служат этой цели.
12-луночные полистирольные пластиныThermo Scientifit - NUNC07-200-81Пластины можно приобрести у ряда поставщиков с различными размерами.
DBCO-PEG4-биотинClickchemistytoolsA105P4-10Солюбилизированный в DMF
Стрептавидин, Alexa Fluor 488 КонъюгированныйLife TechnologiesS-11223Солюбилизированный в PBS
Стрептавидин, Alexa Fluor 546 конъюгированныйLife TechnologiesS-11225Солюбилизированный в PBS
Nikon A1-R Конфокальный микроскопNikonEclipse Ti, A1RЭпифлуоресцентного микроскопа достаточно для визуализации функционализированных микроструктурированных подложек.

Ссылки

  1. Senaratne, W., Andruzzi, L., Ober, C. K. Self-Assembled Monolayers and Polymer Brushes in Biotechnology: Current Applications and Future Perspectives. Biomacromolecules. 6 (5), 2427-2448 (2005).
  2. Hucknall, A., Kim, D. -H., Rangarajan, S., Hill, R. T., Reichert, W. M., Chilkoti, A. Simple Fabrication of Antibody Microarrays on Nonfouling Polymer Brushes with Femtomolar Sensitivity for Protein Analytes in Serum and Blood. Advanced Materials. 21 (19), 1968-1971 (2009).
  3. Hucknall, A., Rangarajan, S., Chilkoti, A. In Pursuit of Zero: Polymer Brushes that Resist the Adsorption of Proteins. Advanced Materials. 21 (23), 2441-2446 (2009).
  4. Rozkiewicz, D. I., Jańczewski, D., Verboom, W., Ravoo, B. J., Reinhoudt, D. N. Click” Chemistry by Microcontact Printing. Angewandte Chemie International Edition. 45 (32), 5292-5296 (2006).
  5. Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology. Chemical Society Reviews. 39 (4), 1272-1279 (2010).
  6. Sha, J., Lippmann, E. S., McNulty, J., Ma, Y., Ashton, R. S. Sequential Nucleophilic Substitutions Permit Orthogonal Click Functionalization of Multicomponent PEG Brushes. Biomacromolecules. 14 (9), 3294-3303 (2013).
  7. Tugulu, S., Silacci, P., Stergiopulos, N., Klok, H. -A. RGD—Functionalized polymer brushes as substrates for the integrin specific adhesion of human umbilical vein endothelial cells. Biomaterials. 28 (16), 2536-2546 (2007).
  8. Ashton, R. S., et al. High-Throughput Screening of Gene Function in Stem Cells Using Clonal Microarrays. Stem Cells. 25 (11), 2928-2935 (2007).
  9. Koepsel, J. T., Murphy, W. L. Patterned Self-Assembled Monolayers: Efficient, Chemically Defined Tools for Cell Biology. ChemBioChem. 13 (12), 1717-1724 (2012).
  10. Mrksich, M., Dike, L. E., Tien, J., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver. Experimental cell research. 235 (2), 305-313 (1997).
  11. Ma, H., Hyun, J., Stiller, P., Chilkoti, A. Non-Fouling” Oligo(ethylene glycol)- Functionalized Polymer Brushes Synthesized by Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization. Advanced Materials. 16 (4), 338-341 (2004).
  12. Bou Chakra, E., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, D. C., Cabrera, M. A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment. Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).
  13. Trinkle, C. A., Lee, L. P. High-precision microcontact printing of interchangeable stamps using an integrated kinematic coupling. Lab on a Chip. 11 (3), 455(2011).
  14. McNulty, J., et al. High-precision robotic microcontact printing (R-μCP) utilizing a vision guided selectively compliant articulated robotic arm. Lab on a Chip. , (2014).
  15. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscalepatterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
  16. Nam, Y., Chang, J. C., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Gold-Coated Microelectrode Array With Thiol Linked Self-Assembled Monolayers for Engineering Neuronal Cultures. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (1), 158-165 (2004).
  17. Ma, H., Wells, M., Beebe, T. P., Chilkoti, A. Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization of Oligo(ethylene glycol) Methyl Methacrylate from a Mixed Self-Assembled Monolayer on Gold. Advanced Functional Materials. 16 (5), 640-648 (2006).
  18. Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), (2006).
  19. Codelli, J. A., Baskin, J. M., Agard, N. J., Bertozzi, C. R. Second-Generation Difluorinated Cyclooctynes for Copper-Free Click Chemistry. Journal of the American Chemical Society. 130 (34), 11486-11493 (2008).
  20. Debets, M. F., van Berkel, S. S., Schoffelen, S., Rutjes, F. P. J. T., van Hest, J. C. M., van Delft, F. L. Aza-dibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3+2) cycloaddition. Chemical Communications. 46 (1), 97(2010).
  21. DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
  22. Roth, E. A., Xu, T., Das, M., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. Inkjet printing for high-throughput cell patterning. Biomaterials. 25 (17), 3707-3715 (2004).
  23. Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. Biomaterials. Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).
  24. Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).
  25. Meitl, M. A., et al. Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp. Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Функционализация ПЭГ-щеткамиподложки с золотым покрытиемортогональные клик-реакцииподложки для культивирования тканеймикромасштабное структурированиеконъюгация флуоресцентных зондовсвязывание стрептавидинаспециализированный анализ изображений
Изготовление Комплексные Субстраты культуры с помощью робота-микроконтактной печати (R-μCP) и Sequential нуклеофильного замещения
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.