Хирургический метод Виралли опосредованной доставки генов к мыши внутреннего уха через круглое окно мембраны

Summary

Описанный постаурикулярный хирургический подход позволяет быстро и напрямую доставлять тимпани в улитку улитки мыши, сводя к минимуму кровопотерю и смертность животных. Этот метод может быть использован для кохлеарной терапии с использованием молекулярной, фармакологической и вирусной доставки постнатальным мышам через мембрану круглого окна.

Abstract

Генная терапия, используются для достижения функционального восстановления от нейросенсорной глухотой, обещает предоставить лучшее понимание основных молекулярных и генетических механизмов, которые способствуют потере слуха. Введение векторов во внутреннее ухо должно быть сделано таким образом, что широко распределяет агента в улитке при сведении к минимуму повреждение к существующим структурам. Эта рукопись описывает пост-предсердного хирургического подхода, который может быть использован для мыши кохлеарного терапии с использованием молекулярного, фармакологические, и вирусную доставку в постнатальный день мышей 10 лет и старше через мембрану круглого окна (РВМ). Это хирургический подход позволяет быстро и прямую доставку в барабанную лестницу, минимизируя потерю крови и избежать гибели животных. Этот метод включает незначительное или никакое повреждение к основным структур внутреннего и среднего уха, а также мышц шеи, а полностью сохраняя слух. Чтобы продемонстрировать эффективность этой хирургической техники, везикулярного glutamели транспортер 3 нокаутом (VGLUT3 КО) мышей будет использоваться в качестве примера модели мыши врожденной глухотой, что восстанавливает слуха после доставки VGLUT3 во внутреннее ухо с помощью аденоассоциированный вирус (AAV-1).

Introduction

Генная терапия уже давно было предложено в качестве потенциального лечения для генетического потери слуха, но успех в этой области остается неуловимым ^1. На сегодняшний день, вирусно опосредованные методики преобладали из-за теоретической возможности ориентироваться на конкретные типы клеток в относительно недоступном улитки. Оба аденовируса (AV) и аденоассоциированный вирус (AAV) были использованы для доставки генов кохлеарного. AAVs имеют то преимущество, улитки для целого ряда причин. Они репликации с дефицитом вирусы и могут эффективно передавать трансгенных молекулы различных типов клеток, включая нейроны, важной мишенью для ряда причин потери слуха. ....

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры и животные обращение соблюдены NIH этических принципов и утвержденных требований Протокола к уходу и использованию комитета Институциональная животных из Университета Калифорнии, Сан-Франциско.

1. Подготовка животных для хирургии

1. Проводить хирургические процедуры в чистом, посвященной пространстве. Автоклав все хирургические инструменты, стерилизовать со стеклянной бисера стерилизатор до операции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе, используйте день после рождения 10-12 (P10-12) FvB мышей. Разных возрастов и штаммы мышей могут быть использованы для удовлетворения потребностей конкретного проекта. Мыши....

Results

Для проверки технических характеристик и полезность пост-ушной подхода к кохлеарной молекулярной терапии, AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP и AAV2-GFP были доставлены в P10-12 мышей внутреннего уха через РВМ. Такой подход демонстрирует успешную экспрессию трансгена во внутренних волосковых клеток (IHC) (VGLUT3 Рисунок 1 и GFP Рисунок 2 и GFP 3А), наружные волосковые клетки (OHC) (GFP Рисунок 2) и поддерживающие клетки (GFP Рисунок 2 и Рисун.......

Discussion

В этой работе, мы подробно описать метод, который может быть использован для генной терапии кохлеарный, с целью восстановления нормального или спасение слуховой функции, которая снижена в результате генетического дефекта. Как правило атравматической, этот подход является безопасным для кохлеарного переноса генов или других потенциальных молекулярных терапии ^30. Другие подходы к кохлеарного терапии были описаны, в том числе в брюшной подход ^24, cochleostomy ^31,32 и эндолимфатическая мешка.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Кетамин	Батлер Шейн
Ксилазин	АнаСед
Ацепромазин	Предоставлено UCSF LARC
Карпрофен анальгезия	Предоставлено UCSF LARC
Betadine	Betadine Puredue Pharma
дексаметазон офтальмологическая мазь (TobraDex)	Alcon
Грелка	Braintree scientific, inc.
Игла 25G BD		305127
боросиликатная капиллярная пипетка	World precision instruments, inc.	1B100F-4
Шовный материал PDS*plus Антибактериальный	Ethicon	PDP149
Клей для тканей (Vetcode)	Butler Schein	31477
Rabbit Anti-GFP антитело	Invitrogen	A11122
Препарирующий микроскоп	Leica		MZ95
Пылающая/ Коричневая микропипетка	Съемник Sutter Instrument Co
Модель P-97
Система TDT BioSig III	Такер Дэвис Текнолоджис