Высокая техника Пропускная Флуорометрический по оценке фагоцитоз макрофагов и полимеризации актина

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол количественной оценки фагоцитоза флуоресцентных частиц адгезивной линией макрофагов с использованием флуориметрического метода. Этот метод способствует высокопроизводительной количественной оценке интернализации частиц, а также результирующей полимеризации актина.

Аннотация

Цель флуорометрического анализа, чтобы служить в качестве эффективного, экономически эффективным, высокой метода пропускной анализа фагоцитоз и другие клеточные процессы. Этот метод может быть использован на различных типах клеток, как адгезивные и не адгезивные, чтобы изучить различные клеточные свойства. При изучении фагоцитоза, флюорометрический техника использует фагоцитарных типов клеток, таких как макрофаги и флуоресцентно меченых частиц, опсонизированных флуоресценции может быть погашен в присутствии трипанового синего. После обшивки адгезивных макрофагов в 96-луночных планшетах, флуоресцентных частиц (зеленый или красный) и вводят клетки позволили фагоцитируют для различных количеств времени. После интернализации люминесцентных частиц, клетки промывают трипановым синим, что облегчает исчезновение флуоресцентного сигнала от бактерий, которые не интернализированных, или просто прилипших к поверхности клетки. После промывки трипанового, клетки промывают PBS с фиксированной,й окрашивали DAPI (ядерная Blue Label люминесцентные), который служит для обозначения ядра клеток. Простым флуорометрического количественного через пластины чтения ядерной (синий) или частицы (красный / зеленый) флуоресценции можно рассмотреть соотношение количества относительных флуоресценции единиц зеленый: синий и определить фагоцитарную индекс, указывающий на количество люминесцентных бактерий интернализованных на ячейку. Продолжительность анализа с использованием 96-луночного метод и многоканальные пипетки для стирки, от конца до конца фагоцитоза сбора данных, меньше, чем 45 мин. Проточная цитометрия может быть использован таким же образом, но преимущество флуорометрии является его высокая пропускная способность, быстрый метод оценки с минимальным манипуляции образцов и быстрого количественного определения интенсивности флуоресценции на клетку. Аналогичные стратегии могут быть применены к не прилипшие клетки, живые меченых бактерий, полимеризации актина и, по существу любой процесс с использованием флуоресценции. Таким образом, флюометрия является перспективным методом его низкой стоимости, высокой throughpут возможности в изучении клеточных процессов.

Введение

Количественное определение флуоресцентного сигнала широко используются во множестве научных методов, начиная от ПЦР, проточной цитометрии, конфокальной микроскопии и FRET анализ ELISA для мультиплексирования. Флуоресценции изображений и количественное имеет широкое применение и могут быть отличным инструментом для количественного анализа различных клеточных процессов. Использование флуоресцентных маркеров и их сигнал был революцию в последнее десятилетие, и появление люминесцентных читателей плит способствовало высокой пропускной количественного флуоресценции, испускаемого при клеточных процессов.

Флуорометрический анализ может служить отличным инструментом в количественной фагоцитоза. Фагоцитоз был изучен с момента открытия фагоцитов по Мечников в 1800 ^1. На протяжении многих лет, различные методы были использованы для изучения этого важного процесса важное значение для иммунной защиты против вторжения бактериальных, вирусных, грибковых и паразитарных патогенов ^2-5, Предыдущие методы количественного используется микроскопии и стереологических методов для того, чтобы визуализировать клетки, которые phagocytosing, которые затем были количественно путем подсчета интернализованных частиц (вручную или с использованием программного обеспечения) ^6-8. Некоторые недостатки использования микроскопа сами по себе для количественного анализа является то, что ручного подсчета бактерий является трудоемким и более склонны к предвзятости наблюдателя. Другой метод, используемый в количественного фагоцитоза является микробиологическое методика обшивки бактерий из клеточных лизатов (следующих фагоцитоза) на бактериальной культуры пластин, но этот метод может не учитывать бактерицидных механизмов и наличием частично интернализированных бактерий. Этот метод еще более трудоемким по сравнению с микроскопией и занимает несколько дней, чтобы анализировать. Проточной цитометрии, кажется, самый быстрый, самый эффективный способ количественного фагоцитоза и была использована многими группами ^9-11, но высокая стоимость обычно ассоциируется с инструмент, необходимые для их анализа делает наиболее дорогой метод по сравнению с ранее упомянутых анализов.

Флуорометрический метод хорошей альтернативой проточной цитометрии для анализа интернализации частиц, так как он предлагает объективную количественную оценку флуоресценции с использованием оборудования, которое не так препятствующая стоимость. Другие дополнительные преимущества флуорометрии являются высокая эффективность и высокие возможности пропускную способность для количественной оценки флуоресценции мечеными интернализованных частиц.

Преимущества флуорометрии могут быть экстраполированы на количественной оценки других, чем фагоцитоза процессов. Например, флуорометрического анализа могут быть применены для изучения любой процесс, приводящий к изменениям в экспрессии внутриклеточной или мембраносвязанных рецепторов, изменений в клеточной проницаемости / жизнеспособности, трансфекции эффективности и модуляции в полимеризации актина. Один недостаток флуорометрического техники является то, что, в зависимости от меток, используемых, может быть высокойэксперимента к эксперименту изменчивость, которая, как правило, могут быть решены путем демонстрации данных через относительные количественного, таких как изменение раза или увеличения от контроля процентов.

Протокол

Примечание: Этот протокол может быть использован для различных приложений, таких как количественного фагоцитоза и полимеризации актина, используемый в нашей ранее опубликованной работе ^12. Протокол поддается различных модификаций и типов В таблице 1 приведены клеточные частицы и успешно использованы в предыдущих исследованиях. Стандартный использование этого протокола для количественной оценки фагоцитоза или полимеризации актина показано на рисунке 1.

Схема 1:. Схема флуорометрического анализа для количественной оценки фагоцитоза и полимеризации актина После того как клетки высевают, обрабатывают и дают возможность прилипать частицы, меченные зеленой флуоресценции (FITC) добавляют к клеткам для фагоцитоза. Реакцию останавливают трипановый или antibiушные промывки (для устранения не-усвоены частицы) и фиксация осуществляется с помощью 4% параформальдегида. Клетки затем окрашивают красного флуоресцентного актина метки (родамин фаллоидином) и голубой флуоресцентной метки (DAPI). Индексы фагоцитоза и полимеризации актина количественно как отношение относительных флуоресценции единиц зеленый / синий (FITC / DAPI), или красный / синий (родамин / DAPI) флуоресценции.

1. Покрытие и обработки клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом Рекомендуется использовать процедуры, по крайней мере, 4 технических повторов, и включают в себя следующие элементы в макете пластины: только клетки (неокрашенные, с только DAPI или родамин только) и частицы только.

1. Провести все добавление реагентов в стадии 1-4, в стерильной капот культуре клеток с целью защиты образцов от загрязнения.
2. Пластинчатые макрофаги (мышиный линии клеток J774) в 96-луночный планшет при 1-5 х 10 ⁴ клеток в 50 мкл (на лунку) из дополнить подогретого СМИ. Идеальное пластины для этого метода являются черные 96-луночные планшеты с прозрачным или черным дном, в зависимости от возможностей читателя.
   1. Для дополненных массовой информации, использовать 10% инактивированной нагреванием FBS, чтобы избежать вмешательства каскада комплемента, и 1% пенициллина / стрептомицина (если не используется живые бактерии для фагоцитоза). Если с помощью адгезивные клетки позволяют 1-2 ч для адгезии, и для не-адгезивных клеток, спин вниз пластины с клетками в течение 10 мин при 500 х г.
3. Добавить желаемых агонисты / антагонисты или управления транспортным средством при концентрации 2 × (ресуспендировали в PBS или, более предпочтительно, в средствах массовой информации, дополненной) в 50 мкл до конечного объема 100 мкл (1x) и инкубируют в течение желаемого периода времени. Многоканальные пипетки и реагентов водохранилища будет способствовать быструю обработку.

2. Опсонизация флуоресцентных частиц

ftp_upload / 52195 / 52195table1.jpg "ширина =" 500 "/>
Таблица 1: Проверено типы клеток и флуоресцентных частиц в флуорометрического анализе того, что наша группа использовала через флуорометрического методом фагоцитоза и полимеризации актина Таблица 1 иллюстрирует комбинации типов клеток (клеточных линий и первичных клеток).. Кроме глядя на фагоцитоз и полимеризации актина по клеток дикого типа, мы также использовали некоторые из этих частиц для исследования фагоцитоза трансфицированных клеток, экспрессирующих GFP (зеленого флуоресцентного белка). Флуоресценции клеток, трансфицированных плазмидами, содержащими флуоресцентные репортеров также может быть использован как сотовый маркера в дополнение к таблице DAPI легенды.: A - актина полимеризации; P - фагоцитоз; PT - фагоцитоз GFP помечены трансфекции клеток; OPDex - опсонизированным декстран шарик; HKOP - тепло убитых опсонизированным.

1. Убедитесь, что флуоресцентные частицы и этикетки защищенном от света месте в любое время, дурьчисле обработку, промывку, а также во время инкубации, чтобы предотвратить фотообесцвечивания
   1. Для сухих частиц, взвесить люминесцентных тепла убитых опсонированных (HKOP) бактерии (E2861: Е.coli К-12 штамма), используя спецификации производителя. Позаботьтесь, чтобы убедиться, что массовые счета для 10: 1 - 20: 1 бактерий: соотношение клеток (или, по крайней мере, соотношение 10: 1 - широко используется в количественного фагоцитоза) ^13,14. Число частиц может быть обеспечено производителем или определено с помощью couting серийных разведений 1 мг / мл маточного раствора.
   2. Ресуспендируют в 50 мкл PBS и вихревые течение 1 минуты при высокой установке. Обеспечить надлежащее вихревание (здесь и далее Протокол), поскольку частицы, как правило, агрегат, который может повлиять на эффективность опсонизации.
   3. Для частиц в суспензии, такие как декстран флуоресцентно меченных бусы (DEX) бисер, вихревое раствор в течение 1 мин, принимают по 50 мкл суспензии или в зависимости от концентрации борта в том Determine крепление из бисера для облегчения 10: 1 шарик: соотношение клеток.
2. Добавить равный объем реагента на opsonizing к частицам и энергично вихрь еще минуту.
3. Инкубируйте частицы opsonizing реагента при 37 ° С в течение 1 часа.
4. После инкубации центрифуги частицы в течение 5 мин при 500 мкг, и удалить супернатант, содержащий избыток opsonizing реагента. Промыть частицы путем добавления 100 мкл PBS, вихря, чтобы ресуспендируют осадок и центрифугат в течение 5 мин при 500 х г.
   1. Повторите указанные действия два раза, чтобы обеспечить правильное опсонизации и удаление несвязанного антитела.
5. Подготовьте рабочий раствор опсонированных частиц путем ресуспендирования их в 5 мл среды (достаточно для одного 96-луночного планшета) и не хранить в защищенном от света, пока дополнение к клеткам.

3. Фагоцитоз

1. Поместите рабочего раствора частиц в стерильном резервуаре реагента. Отсюда, добавить 5056; л опсонированных частиц к клеткам, полученного на стадии 1 (по конечной концентрации 50 нг / мл), и позволяют фагоцитоза происходит при стандартных условиях культивирования клеток. Ниже показаны два способа фагоцитоза, которые могут быть оценены с помощью этого метода (Диаграмма 2).

Схема 2:. Сравнение непрерывного сравнению синхронизации фагоцитоза непрерывной фагоцитоза показывает непрерывное интернализации частиц с течением времени, как они медленно достигают клеток на дне колодца. Контрастные шаг синхронизации (центрифугирования) заставляет частицы оседают на дно, повышение контакта частиц с клетки и приводит к немедленному интернализации клетками. Синхронное фагоцитоз быстрее процесс, который быстрее усваивает частьicles в связи с увеличением клеток: контакт частиц.

1. 1. Для непрерывного метода фагоцитоза (Диаграмма 2), которые позволяют клетки постоянно фагоцитировать опсонированных бактерии, как они медленно опускаются на дно и входят в контакт с клетками, использовать более длинные временные рамки, чтобы для бактерий, чтобы достичь дна скважины и получить в связь с клетками. Если проведение эксперимента timecourse, добавить бактерии в различные интервалы времени и остановить всю тарелку реакций, в то же время, чтобы повысить скорость обработки.
   2. Для синхронизированного метода фагоцитоза (Диаграмма 2), что повышает частиц: клеток контакте через центрифугирования, спин вниз весь пластину, содержащую клетки и частицы (5 мин при 500 мкг), как только частицы добавляют для облегчения синхронизации всех временных точках и чтобы ускорить частицы: взаимодействие клеток.
      1. Измерение временной ход, начиная сразу после завершения Centrifugation шаг. Если проведение эксперимента курс времени, остановить каждый момент времени независимо друг от друга в разные промежутки времени, как описано ниже.

ПРИМЕЧАНИЕ: синхронизированные методы фагоцитоз является несколько более трудоемкий от предыдущего, но обеспечивает более высокую фагоцитарную индекс в более короткие сроки.

4. Остановка Фагоцитоз

1. Для адгезивных клеток, удалить супернатант и добавить 50 мкл разбавленного трипанового синего с PBS (1: 2) разбавления, для того, чтобы погасить флуоресценции не-усвоены бактерий.
2. Для не прилипшие клетки, спина вниз пластины и удалить супернатант. Добавить 50 мкл разведенной трипанового синего. Убедитесь, центрифугировать планшет при (5-10 мин при 500 мкг) между каждой стирки для того, чтобы свести к минимуму потерю клеток и обеспечить надлежащее мытье.
3. После трипановый инкубации, мыть клетки в два раза с PBS, чтобы удалить остатки Трипановый (до PBS не будет удален из хорошо получается прозрачный). Трypan было показано, чтобы утолить флуоресценции ^15,16 не-интернализованных флуоресцентную метку, тепла убит, бактериальных частиц, но не для живых бактерий или шарики OPDex. Для живых бактерий, включают в себя мытье с антибиотиками, такими как пенициллин, стрептомицин, или гентамицин вместо трипана мытья, чтобы избежать смешанное воздействие флуоресценции от не-усвоены частиц.
4. Исправить клеток 100 мкл 4% параформальдегида и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре, затем промыть ЗФР (в 100 мкл на лунку для каждой промывки). На этом этапе, сохраните клетки при 4 ° С в течение одной недели, или перейти непосредственно к окрашиванию и количественного определения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие шаги образуют эта точка предисловие может быть сделано за пределами капот культуре клеток.
5. Удалить все жидкости и добавить 50 мкл DAPI в 5 нг / мл восстанавливали в PBS. Разрешить 5 мин для окрашивания, а затем дважды промывали PBS. После стадии промывки, добавить 50 мкл PBS в каждую лунку и рекордно фагоцитоза.

   5. актина Окрашивание

   Примечание: В дополнение к фагоцитозу, флюорометрический Способ позволит количественное полимеризации актина путем измерения интенсивности актин, который снижается во время торможения, ламеллиподий pseudopodiae и мембраны растрепав в результате обработки с ингибитором (фиг.1А). Это необязательный шаг Если Вы заинтересованы в количественной полимеризации актина в дополнение к фагоцитозу. Если полимеризации актина является конечной целью, с использованием флуоресцентных частиц для фагоцитоза является обязательным.

   1. После фиксацией параформальдегидом (шаг 4,3), промыть пластины дважды PBS в 100 мкл на лунку для каждой промывки. Добавить 50 мкл 0,1% Тритона Х-100 в ЗФР ​​в течение проницаемости и инкубировать в течение -5 мин при комнатной температуре.
   2. Промыть 0,1% Тритон Х-100 2 раза PBS (как описано выше), и блокируют 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в течение 20 мин, чтобы избежать неспецифического связывания из Лабел.
   3. После блокирования удаления раствора BSA и сразу же добавить родамин фаллоидина. Для приготовления рабочего раствора родамина пятна, используйте 100 мкл метановый раствора (представленной изготовителем) в 5 мл PBS (достаточной для одной пластины). Из рабочего раствора добавить 50 мкл на лунку и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги стиральные и окрашивание DAPI, как в шаге 4,4 клетки будут готовы к количественной оценке.

   6. Количественное

   1. Для количественной оценки фагоцитоза с использованием флуоресцентного планшет-ридер, запись зеленой флуоресценции с помощью фильтра возбуждения на λ = 488 нм и фильтр эмиссии на λ = 518 нм, и синей флуоресценции с помощью фильтра возбуждения на λ = 355 нм и фильтр эмиссии на λ = 460 нм.
   2. Для количественной оценки полимеризацию актина с помощью флуоресцентного планшет-ридер, запись голубой флуоресценции с помощью λ = 355 нм и λ = 460 нм (как указано выше), и красный гриппаценции с помощью фильтра возбуждения на λ = 584 нм и фильтра излучения λ = 620 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Орбитальная или центральная обнаружения является приемлемым для записи. Некоторые типы клеток собрать больше к краю колодца, чем в центре, и в этом случае орбитальной записи может быть предпочтительным. В частности, среднее значение трех точках по всему орбите также могут быть использованы, чтобы получить более точные результаты.
   3. Разделите общее РФС зеленого или красного флуоресценции синей флуоресценции для вывода (от DAPI), в зависимости от метки частиц или фагоцитарной против актина количественного (Диаграмма 1). Из-за высокой дисперсии пластины к планшету, использовать относительные показатели (например, по отношению к Т = 0 контроль), лучше всего иллюстрируют тенденции, наблюдаемые и содействовать более надежной статистического анализа.

Результаты

Два основных способа количественного фагоцитоз и последующее полимеризацию актина посредством использования этого протокола состоит в наблюдении непрерывного или синхронизированный фагоцитоз.

Микроскопический анализ (рис 1B) иллюстрирует флуоресцентные изображения, сравнимые с тем, что записи флуорометр (также см Диаграмму 1). На рисунке 1В красной флуоресценции актина, зеленый 268 флуоресценция FITC этикетки HKOP Е. палочка, ядерна...

Обсуждение

Основные ограничения флуорометрического техники являются экспериментальными дисперсия, а также потеря клеток, связанная с тщательной промывки и использования не прилипшие клетки.

Разница наблюдается в основном за счет изменения флуоресцентных частиц, как взвешивание и пипетки во время подготовки исходного раствора не точный способ поддержания одинаковых числа частиц от эксперимента к эксперименту. Для решения этой проблемы расхождений в экспериментах, данные могут быть выражены в относительн...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1 μ m желто-зеленые флуоресцентные флуоресцентные флуоресцентные сферы;	Молекулярные зонды	F8852	объединяют 50μ l с 50μ l опсонизирующий реагент в течение 30 мин при 37oC перед применением
Тепло убивает E. coli BioParticles конъюгат флуоресцеина	Молекулярные зонды	E2861	восстанавливают (5 мг) в 50 мкм; л PBS и соединить с 50 μ l опсонизирующий реагент в течение 30 мин при 37°; C перед использованием
Опсонизирующий реактив	Молекулярные зонды	E2870
Родамин фаллоидин	Молекулярные зонды	R415
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Трипан синий	Gibco	15250-061
Представленные ниже товары доступны во многих брендах, но товары, которые мы использовали в этом исследовании, от следующих производителей:
RPMI Клеточная питательная среда	Gibco		с добавлением 10% FBS и 1% пеннициллина/стрептомицина; тепло при 37 °°; C перед использованием
Считыватель флуоресцентных пластин - Fluostar Omega	BMG Labtech
Параформальдегид (16%)	Научный AA433689M Fischer		разбавить до 4% перед использованием
96-луночные планшеты	Greiner	655097	прозрачным или черным или прозрачным дном - черные пластины
Многоканальная пипетка (8 - 12 каналов)
Резервуары с реагентами
1x PBS
Microfuge tubes (0.6 мл)
Conicles (10 мл)