Методическая статья

Процедура имплантации спинного палату для продольных В Vivo Визуализация мозга мыши спинного

14.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52196

⸱

3 декабря 2014 г.

 , 
1Department of Neurobiology and Behavior, Cornell University, 2Department of Biomedical Engineering, Cornell University

В этой статье

Краткое содержание

В этом видео мы опишем процедуру имплантации хронический оптического изображения камеры на спинной спинного мозга живую мышь. Камера, хирургическая процедура, и хронический изображений пересматриваются и продемонстрировал.

Аннотация

Исследования в неокортексе млекопитающих позволили беспрецедентно разрешить структуру коры головного мозга, активность и реакцию на нейродегенеративные повреждения с помощью повторной покадровой визуализации in vivo у живых грызунов. Эти исследования стали возможными благодаря простым хирургическим процедурам, которые обеспечили оптический доступ в течение длительного периода времени без повторных хирургических процедур. В отличие от этого, аналогичные исследования спинного мозга ранее были ограничены всего несколькими сеансами визуализации, каждый из которых требовал инвазивной операции. Как описано ранее, мы разработали спинномозговую камеру, которая обеспечивает непрерывный оптический доступ в течение более 8 недель, сохраняет механическую стабильность позвоночного столба, легко стабилизируется внешне во время визуализации и требует всего одной операции. Здесь рассматривается конструкция камеры позвоночника с соответствующими хирургическими инструментами, а также подробно демонстрируется хирургическая процедура. Вкратце, в этом видео будет продемонстрирована подготовка операционной области и мыши к операции, обнажение спинного позвонка и соответствующая обработка тканей, доставка имплантата и зажим позвонка, завершение камеры, удаление системы доставки, герметизация кожи и, наконец, послеоперационный уход. Также будет продемонстрирована процедура хронической визуализации in vivo с использованием нелинейной микроскопии. Наконец, обсуждаются результаты, ограничения, типичная вариативность и руководство по устранению неполадок.

Введение

Покадровый в естественных условиях микроскопии в интактных организмов позволяет прямую визуализацию сложных биологических процессов, которые недоступны для традиционного анализа точки одноразовые, таких как иммуногистохимии. В частности, многофотонной микроскопии (MPM) 1 позволяет изображений в ткани рассеяния, например, в коре головного мозга грызунов, где изображения до 2,3 и свыше 4 1 мм была достигнута. В сочетании с хирургическими препаратов 5-7, в котором одна процедура позволяет оптический доступ к мозгу в течение нескольких недель до нескольких месяцев, эти микроскопические подходы были использованы для изучения динамических процессов в мозге здоровых и больных государств 8-11. Кроме того, протоколы были разработаны 12,13, которые обеспечивают для работы с изображениями в естественных условиях у бодрствующих (то есть, не под наркозом) животных, что позволяет функциональной визуализации сотовой резолюции, в ходе поведенческих тестах. Эти протоколы были использованы для comparisДополнения коррелированных нейронной активности 14, астроцитов кальция сигнализации 15 под наркозом и активных животных, определение конкретных задач нейронных кластеров 16, а способность нейронов к дискриминации Расположение объекта на усов стимуляции 17.

Учитывая потенциал этого подхода для выяснения здоровых и патологических механизмов замедленной в естественных изображений была применена к мыши спинного мозга (SC), что позволяет для идентификации острой дегенерации аксонов (AAD) в качестве механизма болезни 18. Последующие исследования исследовали эффекты периферийных поражений на спинальных ганглиях (DRG) регенерации аксонов 19, роль кровеносных сосудов в аксонов регенерации 20, глиальных хемотаксис в ответ на повреждения 21, миграция Т-клеток в экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) 22, деятельности микроглии 23,24 и астроциты 25 в ответ на amyotrophIC латеральный склероз (ALS), роль STAT-3, в аксонов после травмы SC (SCI) 26, и механизм потери аксонов и восстановления в EAE 27. Несмотря на успех этих подходов, все эти исследования были ограничены либо одной сессии изображений, тем самым ограничивая исследования для краткосрочных динамики, либо требуется повторное хирургическое отверстия животного в каждый момент времени визуализации точки, ограничивая количество точек время доступных и увеличивая вероятность смешанных экспериментальных артефактов. Протоколы для этих операций были опубликованы ранее 28,29.

Недавно мы опубликовали методику 30 для имплантации хронической спинного камеры, что позволило покадровой MPM изображений в мыши СУ в течение нескольких недель без необходимости повторных операций. Короче говоря, это хирургическая подготовка входило проведение ламинектомию в нижней грудного отдела позвоночника и имплантацию четырех частей камеры. Палата, втри специально обработанные детали из нержавеющей стали, что зажатые позвонков вокруг ламинектомию, и покровного стекла, расположенную над СК и крепится с помощью силиконового эластомера. Этот метод позволил рутинной изображений для более чем 5 недель после операции у здоровых и раненых государств без необходимости повторных операций. Число изображений моменты времени было ограничено только частоты, на которой животное может переносить обезболивающий индукции. Срок службы изображений был ограничен ростом плотной волокнистой ткани на поверхности КА. Кроме того, мы убедились, что хирургическое имплантата не было долгосрочный эффект на моторные функции.

С нашей первой публикации, альтернативные подходы также дают возможность долгосрочного изображений в СК были описаны в других 31-33. Этот протокол демонстрирует нашу процедуру имплантации в спинной камеру мы разработали.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: уход и экспериментальные манипуляции всех мышей в этой статье был одобрен Комитетом по Уходу за животными и использованию Корнельского университета по.

1. Настройка для хирургии

  1. Стерилизовать все необходимые инструменты с использованием автоклава или утвержденные процедуры стерилизации. Как минимум, включать скальпель, ножницы, Ванна ножницы, пинцеты, отвертки ювелира, ватные тампоны, набор преднатяжителями, имплантат (рис 1а) и свою систему доставки (рис 1D, E).
  2. Протрите все поверхности, включая любые стереоскоп ручек, с 70% этанола и / или соответствующими дезинфицирующими средствами.
  3. Создать стерильное поле путем наложения пользовательского stereotax (рис 1D) и окружающих настольный с стерильными пеленками. Грелку (предпочтительно обратной управлением) должны быть размещены на верхней части и под stereotax стерильных шторы.

2. Подготовкамышь для хирургии

  1. Обезболить мышь под 5% ИФ / кислорода в индукции камеры до частоту дыхания замедляется примерно 1 дыхания / сек.
  2. Перевести курсор в область установки от стерильной зоне, используя носовой конус, чтобы продолжить ИФ экспозиции. Сокращение изофлурана до 2%. Применить глазную мазь, чтобы предотвратить роговицы сушки.
  3. Администрирование гликопирролат (антихолинергического препарата) на 0,05 мг / 100 г мыши внутримышечно в задних конечностей с использованием 29 - 30 г иглы и 3/10 куб.см шприц, обеспечивая примерно 50% от объема инъекции в конечность.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Glycopyrrolate служит для предотвращения накопления жидкости в легких, а мышь находится под наркозом.
  4. Использование электрическими машинками для стрижки, бритья часть спинной части мыши, длиной около 3 см и 2 см в ширину и по центру грудной дуги. Очистите обрезанную волосы подальше от бритой области.
  5. Администрирование следующие инъекции подкожно и дистальнее побрилсяпатч с использованием 29 - 30 г иглы и шприцы 3/10 куб.см: 1 мл / 100 г мыши 5% глюкозы в солевом растворе (для гидратации), 5 мг / кг кетопрофена мыши (НПВС для обезболивания), 0,2 мг / кг дексаметазона мыши ( противовоспалительным стероидом для уменьшения воспаления).
  6. Используя ватные тампоны, выполнить три чередующихся промывок йода и 70% этанола, в ожидании 1 мин между промывками.
  7. Администрирование 100 мкл 0,125% бупивакаина (периферической нервной блокады) подкожно с использованием 29 - 30 г иглы и шприца 3/10 куб.см до центра бритой пластыря для уменьшения боли в месте разреза.
  8. Передача мыши на таможенную stereotax (рис 1D), вставьте ректального термометра, и подождите примерно 10 минут для бупивакаина вступили в силу.

3. Expose и очистить Спинной пластинок 3 смежных грудных позвонков

  1. Использование лезвие скальпеля, создать небольшой (5 мм или меньше) разрез над позвонков интереса (рис 2а).
  2. Использование либо пинцетом или вставив кончик хирургическими ножницами и распространения ручки, увеличить размер отверстия в коже под тупым.
  3. Использование скальпеля или хирургические ножницы, аккуратно отделить соединительную панель между кожей и подлежащей мышцы.
  4. Используйте преднатяжителями, чтобы сдержать кожу, позволяя как большой рабочей зоной, насколько возможно (рис 2b). Позаботьтесь, чтобы не увеличивать нагрузку на грудь и, таким образом, препятствуют дыханию.
  5. Используя пару щипцов, ручки ростральная-самых позвонка, которые будут доступны через вышележащие мышцы. Используя скальпель, сократить расстояние ткани по обе стороны от процесса спинного от всех 3 позвонков (фиг.2с).
  6. Использование любую комбинацию лезвие скальпеля, ватные тампоны и / или костного скребок, удалите все, покрывающий ткань от спинного пластинки (рис 2D).
  7. Использование хирургические ножницы, тщательно вырезать сухожилия, прикрепленные к позвоночнику по обе Lateraл края позвоночного столба (рис 2Е).
  8. Используя скальпель, аккуратно удалить как можно больше ткани из боковых краев позвоночника, насколько это возможно, с тем, чтобы обеспечить чистую поверхность зажимной.
  9. Аккуратно предотвращать позвонки любого оставшегося мягких тканей с помощью скребка кости и / или ватный тампон. Обрежьте любой нелепый ткани в другом месте, используя хирургические ножницы (рис 2F).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это необходимо как для крепления и выполнения спинной ламинектомию, что позвонки чисто подвергаются. Cauterizer может быть полезным в контроле последующее кровотечение.
  10. Сдвиг преднатяжителями, чтобы сдержать ткани, окружающие позвоночник, в дополнение к коже (рис 2F).
  11. Прикрепите имплантатов боковые планки для вилок на столбах доставки и загрузите их в пост-владельцев (как показано на рисунке 1E).
  12. Зажмите 3 позвонков с использованием сторону бара, применяя достаточно просто давление на проведение securelу (рис 2G, H). Используйте пинцет, чтобы помочь обеспечить уровень зажим 3 позвонков. Следует отметить, что несколько попыток может быть необходимым. Убедитесь, что боковые бары и уровень и параллельно до выполнения ламинектомию.
  13. Тщательно очистите и высушите спинной поверхности зажатой позвонков с использованием ватные тампоны.

4. Выполните Спинной Ламинэктомия

  1. Вставьте кончики Vännäs ножницами в эпидуральное пространство медиальной зажатой позвонка и сожмите ручки слегка; Если кость сухой, она должна трещины вдоль спинной пластинки. Повторите эту процедуру на противоположной стороне, чтобы освободить пластинку.
  2. Аккуратно сжимая свободную пластинку с помощью процесса спинной щипцами, осторожно срезать любой соединительной ткани в ростральных и хвостовых концов пластинки и снимите ее.
  3. Использование 0,9% раствора и / или искусственного спинномозговой жидкости (ACSF), тщательно смыть любую overlyi кровинг спинной мозг. Используйте ватные тампоны, чтобы поглотить лишнюю жидкость.
  4. Использование Vännäs ножницы, тщательно обрезать боковые края кости обратно в сторону бара имплантата. Опять же, смыть и контролировать кровотечение с помощью ватных тампонов и физиологический раствор / ACSF.
  5. В том случае, если часть надкостницы отключил и перекрывает спинного мозга, осторожно удалить эту ткань с помощью ватные тампоны и / или 29 - 30 G иглу. Позаботьтесь, чтобы не повредить спинной мозг в этой части процедуры. Не путайте свободный надкостницы с плотно завернутые твердой мозговой оболочки.
  6. Осторожно, печать оставшиеся открытыми краями кости с одной или обеих зубной акриловой и цианоакрилат (рис 2i). Соблюдайте особую осторожность, чтобы не допустить клеи течь на открытую спинного мозга.

5. Печать палата

  1. Установите верхнюю пластину тщательно, чтобы 4 слота линии с 4 отверстиями на боковых полос и открытие перекрывает открытую спинуаль шнур (рис 1B и 2J).
  2. Использование отвертки ювелира, осторожно начинают первый винт, стабилизируя вал отверткой с другой парой щипцов. Не затягивайте винт на этом этапе, но вставьте его так, что первые несколько нитей заняты. Повторите эту процедуру для других 3 винтами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это полезно использовать титан или другие не намагничиваемые щипцы, чтобы помочь положении винты на данном этапе.
  3. Со всеми 4-мя винтами в месте, затяните каждый винт попеременно на ту же сумму с небольшим шагом, пока винт не надежно закреплены (рис 2K). Обратите внимание, что это не является необычным для верхней пластины, чтобы продемонстрировать в ходе этого процесса. Будьте осторожны, не затягивайте винты слишком сильно, так как головка винта может сломаться и чрезмерное понижательное давление будет выбить фиксатор и / или привести к травме спинного мозга.
  4. Использование силиконового эластомера, чтобы заполнить пространство между спинного мозга и оконное стекло. Потому что ланьы не производят уксусную кислоту в процессе отверждения, используйте KwikSil бренда эластомера и канюли для смешивания. Нанесите обильный часть силикона к открытой спинного мозга. Позаботьтесь, чтобы избавиться от любых кремнийорганических, содержащей пузырьки воздуха из кончика смешивания перед нанесением на спинном мозге.
  5. Работа быстро, аккуратно нажмите 5 мм # 0 покровное в вставке в верхней пластине. Применение достаточное давление, чтобы сжать постепенно жидкого эластомера окружать спинной мозг, но не приведет к компрессии спинного мозга (фиг 2L). Установка времени для эластомера составляет около 90 сек, поэтому убедитесь, что покровное быстро применить.
  6. В случае неудачной уплотнения, подождите, пока эластомер не установлен, аккуратно извлеките ее из имплантата с щипцами, и повторите 5,4 - 5,5.
  7. Крышка края отделившегося эластомера с зубной акриловой / цианоакрилат и прилипать к окружающей кости как можно больше, чтобы предотвратить эластомера от сдвига по поверхности спинного мозга.
  8. Удалить преднатяжителями и подтягивает кожу вокруг края имплантата. Использование Цианоакрилат, придерживаться кожу краев имплантата (рис 2М, N).
  9. Вставьте # 0-80 - 1/4 "установочные винты в крыльях верхней пластины (рис 1c и 2 O).
  10. Использование зубной акрил, закрыть все пробелы в винтовых пазах верхней пластины (рис 2P).

6. Послеоперационный период

  1. Удалить животное от анестезии и место в большом чистом клетке. Убедитесь, что клетка является достаточно большой, что камера не будет поймать на чем-нибудь (например, V-образный провал для бутылки с водой и / или пищевых продуктов) в ходе нормального передвижения по всей клетке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: стандарт крыс клетки является идеальным.
  2. Поставьте клетку на нагретой поверхности, а животное выздоравливает. Не вернуть мышь в компании других животных, пока он полностью восстановился.
  3. Проверьте животных БехаВИОР в 1 - 2 ч послеоперационного для признаков боли или страдания и имплантатов целостности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При нормальных условиях, животное должно иметь возможность передвигаться со скромными возмущений к движению.
  4. Продолжайте проверять животному все 8 - 12 ч в течение первого 72 часов, измерения веса и контроль поведения. Убедитесь, что животные активны и подвижны в течение ночи. Влажные корма в виде земли чау смешан с водой или пищевыми гелей, чау гранулы, и питьевая вода должна быть предоставлена ​​на уровне земли. Дополнительные гидратации путем подкожных инъекций или intraperiotoneal должна быть обеспечена в случае необходимости.
  5. Администрирование 5 мг / кг кетопрофен мыши и 0,2 мг / кг подкожно мыши дексаметазона через 24 и 48 ч моменты времени, в послеоперационном периоде. Кроме того, 0.005-0.010 мг / 100 г мыши следует вводить каждые 8 ​​ч в виде подкожных инъекций в течение 72 ч.

7. В естественных изображений

  1. Обезболить мышь под5% ИФ / кислород в индукции камеры до частоту дыхания замедляется до примерно 1 дыхания / сек.
  2. Перевести курсор на таможенную stereotax (рис 1D) с обратной контролируется грелку и вставьте ректального термометра. Сокращение изофлурана до 2%.
  3. Администрирование Glycopyrrolate 0,05 мг / 100 г мыши внутримышечно в задних конечностей с использованием 29 - 30 г иглы и 3/10 куб.см шприц, обеспечивая примерно 50% от объема инъекции в конечность.
  4. Администрирование 1 мл / 100 г мыши 5% глюкозы (для гидратации) подкожно один раз в солевом растворе в ч.
  5. Вставьте резьбовые держатели камеры в пост-владельцев используемых для хирургии (рис 1F). Отрегулируйте высоту и крутить сообщения на установочных винтов в верхней пластине.
  6. В обоих держатели присоединены, поднять держателей в пост-владельцев, пока в груди не может свободно расширяться на вдохе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оба фирма прикрепление владельцев и свободное расширение грудной клетки significanTLY уменьшить артефакты движения, вызванные дыханием.
  7. Выполните визуализацию как хотелось бы.
  8. При визуализации завершена, нижняя сообщений, откручивать держатели камеры, снимите ректального термометра, и переместить мышь на нагретой поверхности, чтобы оправиться. Не вернуть мышь в компании других животных, пока он полностью восстановился.

Результаты

Следуя описанной выше процедуры, каждая стадия операции должны имитировать результаты на каждом этапе операции, описанной на рисунке 2. Особое внимание должно быть принято при применении силиконового эластомера для устранения воздушных пузырей под стеклом или по крайней мере убедиться, что они расположен на периферии области интереса (рис 2L). Для опытного хирурга, хирургические осложнения, требующие эвтаназии либо во время операции или в течение первых 24 ч послеоперационные встречаются приблизительно в 20% операций. Эти осложнения чаще возникают от чрезмерного кровотечения мягких тканей или неудачи, чтобы надежно прикрепить камеру к позвоночному столбу.

Успешно имплантированных камер, окно, как правило, остается оптически прозрачным для нескольких недель (Рисунок 3). Несмотря на все усилия, непрозрачный, волокнистая, новообразований часто образует в течение нескольких дней, в результате чего частичной Obscuriнг окне (рис 3С - F, черный пунктир). Люминесцентные структуры трудно увидеть с помощью 2PEF микроскопии под этим фиброзной ткани. Мы находим двойное распределение результатов, с примерно 50% успешно внедренных окон оставаясь ясно более 5 недель после операции, и примерно 50% становятся затемненный в течение 1 - 3 недель. Для окон, которые остаются четкие, большинство мест в пределах обзорным окном опыта только умеренной степенью неоваскуляризации или выше твердой мозговой оболочки (рис 3D - F, зеленый звездочки), который не мешает изображений 2PEF. Наши предыдущие исследования 30 показали увеличение микроглии, но не плотность астроцитов под окном и смежными позвонками, что указывает на умеренное воспаление, аналогичное тому, которое наблюдалось в черепных окно препаратов 5.

У трансгенных мышей, экспрессирующих желтый флуоресцентный белок (YFP) в подгруппе задних корешков GanglIA (DRG) нейронов (YFPH линии; Jackson Labs), аксоны были четко различимы в течение нескольких недель после операции (фиг.4А и б), и до тех пор, четыре месяца у одного животного (данные не показаны). Кровеносные сосуды (фиг.4А и Б) были сделаны видимыми ретро-орбитально инъекционных флуоресцентного Texas Red декстран помечены в плазме крови. Микроглия также визуализируется в мышей, экспрессирующих GFP в CX3CR1 стучать в мышь (CX3CR1-GFP; Jackson Labs) подошел к YFPH линии (рис 4C). Контраст и разрешение ухудшается с течением времени незначительно (фиг.4С) в связи с формированием волокнистого разрастание ранее описанного 30. Мы регулярно отображаемого в течение 3 ч в течение одной сессии без смертности и так часто, как каждые 12 часа. Продолжительность сеанса и частота ограничена толерантности животного для индукции анестезии, сопутствующих с этическими соображениями, сопровождающих боль и страдания лабораторных животных.

< P CLASS = "jove_content" FO: Keep-together.within-страницу = "всегда"> figure-results-1
Рисунок 1. Пользовательских хирургическое люкс облегчает доставку камеры во время имплантации и стабилизирует камеру во время последующих сеансов изображений. Двух боковых полосы, и верхняя пластина (А) собраны (В) с помощью небольших винтов в спинной камеры (C). Столы с выдвижной должностей (D) позволяет для доставки и зажима побочных баров позвонков через контакты Holding (E). Последующие сеансы визуализации использовать вместо внутренней резьбой сообщения прикрепить к камере с помощью установочных винтов на крыльях имплантата (F). Панель В этой фигуры была изменена с Фаррар и др., Methods природа, 2012 30 с разрешения издательской группы Nature.96 / 52196fig1large.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2. Спинной ламинэктомию выполняется и хронический изображения камеры имплантируется, чтобы обеспечить оптический доступ к спинному мозгу. Эта процедура описана в монтаже. Во-первых, кожи (панели, B; разделах протокола 3,1 - 3,4) и мышц (C; 3,5) убираются выставить три основной позвонков. Ткани, покрывающий эти три позвонка удаляют (D, E, F, 3,6 - 3,10) и боковые процессы соскабливают чистым, прежде чем они зажаты с обеих сторон (G, H, 3,12). Осторожно, спинной пластинки центральной позвонка удаляют, а края кости запечатаны (I (J; 5,1) и болты закреплены в положении (K; 5,3), чтобы закрепить камеру перед закрытием камеру с силиконового эластомера и покровного стекла (L; 5,5). После штифты доставки удаляются (М; 5,8), кожа приклеена к сторонам камеры (M, N; 5,8) и установочные винты вставлены в крылья (O; 5,9). Наконец, винтовых шлицев запечатаны стоматологическим акриловым (Р; 5,10). И мышь помещали в чистую клетку, чтобы восстановить Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3

Рисунок 3. хронический спинного камера остается оптически прозрачного овэ несколько недель. Белые светлые образы спинного мозга, начиная от нескольких минут (А) до трех недель после операции (F). Сосудистые достопримечательности могут быть идентифицированы во всех временных точках (желтые стрелки). Небольшое изменение видно в один день послеоперационные (B). Плотной волокнистой разрастание (С - F, ограниченную пунктирной линией на нижний правый) присутствует уже через три дня и приводит к частичной запутывания области формирования изображения. Мягкий новых сосудов (D, E, F, зеленые звездочки) также присутствует, но не заслонять оригинальный сосудистую в белом свете или изображений 2PEF. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4

Рисунок 4. хронический спинного камера позволяет для повторного изображений многофотонной без необходимости повторных операций. Повторное изображений трансгенных мышей, экспрессирующих YFP в подгруппе DRG аксонов (зеленый) в спинной Funiculi спинного шнур и сосудистой (красный) помечены инъекции внутрисосудистого красителя (A, B). Деятельность микроглии (лиловый), также можно отслеживать с течением времени в Thy1-YFP / CX3CR1-GFP дважды трансгенных мышей (C). В то время как аксоны и микроглии остаются видимыми, контрастность и разрешение снижение скромно с течением времени (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Методика продемонстрирована здесь позволяет повторного замедленной, в естественных изображений в спинной мыши SC из многих недель после операции, без необходимости последующих хирургических процедур. Эта процедура представляет собой существенное улучшение по сравнению с повтор-хирургии визуальных исследований или над portmortem гистологических подходов, когда теряется информация о клеточной динамики. Напомним, ранее 30 продемонстрировали ценность этого метода для изучения SCI патологии в естественных условиях.

Максимальная продольная протяженность визуализации был обусловлен увеличением плотной волокнистой ткани над спинной поверхности КА. Со временем, этот рост привел к потере контраста и разрешающей способности изображения. Этот рост был также замечен в альтернативных хирургических препаратов 31. Занимательно, что мы обнаружили, что этот рост может быть сведено к минимуму путем тщательного промывания дорсальной поверхности SC, чтобы удалить продукты крови, уплотнение поверхностьвырезать кости с цианоакрилату, герметизации краев камеры также с силиконового эластомера, и свести к минимуму промежуточного пространства между спинной СК и покровного стекла.

Недавно другой подход совпадает с нашим использованием поликарбоната камеру была продемонстрирована 32. Использование поликарбоната имеет преимущество, поскольку он совместим с рентгеновским и условий Акустоскопия, что не дело для наших деталей из нержавеющей стали. Тем не менее, с теперь уже повсеместно технологии 3D принтеров, камера части могут быть изготовлены из самых разнообразных материалов, в соответствии с конкретными потребностями. Мы недавно напечатаны все наши детали в ясной фотополимера.

Одним из ключевых недостатков закрытой камере неспособность управлять повторных доз препаратов или экзогенных красителей, пригодных для SC изображений 34. Однако, спекулируя на механической стабильности нашей нынешней системе, мы уже использовали нашу нынешнюю камеру, чтобы успешноLY якорь интратекальный катетер, соединенный с имплантировали подкожно инъекции порт, который позволил доставки наркотиков в различные моменты времени даже в закрытой системе камеры (неопубликованная работа). Кроме того, из-за модульной природы верхней пластины, будущие версии этого препарата будет включать в себя закрывающийся камеру, чтобы позволить для повторного применения обоих терапевтических агентов и флуоресцентных меток. Можно также представить себе верхние пластины с креплениями для записи электроды, оптические вставки, и порты для доставки лекарственных средств. Такие добавки, вероятно, будет более сложным для реализации, используя более минималистский систему Fenrich и др. 31. В заключение, наша камера обеспечивает шлюз платформу, на которой может быть основано различные эксперименты.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать, и нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим доктора Джозефа Р. Фетчо за его вклад в разработку процедуры. Мы хотели бы выразить признательность за финансовую поддержку со стороны Национальных институтов здравоохранения США (R01 EB002019 C.B.S и DP OD006411 Джозефу Р. Фетчо) и Национального совета по науке и исследованиям Канады (M.J.F.) за финансовую поддержку.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ванна ножницыFine Science Tools15000-04
щипцы, ножницы, скальпель и т.д.Инструменты изобразительной наукимножественные 
комплект втягивающего устройства -магнитный фиксаторFine Science Tools18200-02
комплект втягивающего устройства -ретракторFine Science Tools18200-09другие втягивающие устройства также могут быть использованы
комплект втягивающих устройств -эластомерFine Science Tools18200-07
с обратной связью управляемое нагревательное одеялоCWE Inc.Модель: TC-1000 Mouse                          Часть No 08-13000
стереотакссм. Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Дополнение (онлайн)
спинальная камерасм. Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Дополнение (онлайн)
держателисм. Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Дополнение (онлайн)
Цианоакрилатный клейLoctiteLoctite 495множественный
Teets Cold Cure Coral Powder (стоматологический акриловый порошок)TeetsMfg. Часть: 8101несколько поставщиков
Teets Cold Cure Liquid (стоматологическая акриловая жидкость)TeetsMfg. Часть: 8501несколько поставщиков
ГликопирролатMWI Veterinary SupplyMWI Артикул: 29706 (Baxter 1001901602)
D-(+)-ГлюкозаSigma-AldrichG5767
БупивакаинMWI Veterinary SupplyMWI Артикул: 029841 (Hospira 116301)
КетопрофенMWI Veterinary SupplyMWI Артикул: 002800 (Pfizer 2193)
ДексаметазонMWI Veterinary SupplyMWI Артикул: 501012 (VetOne 1DEX032)
KwikSil ElastomerWorld Precision Inc.KWIK-SIL
Советы по смешиванию KwikSilWorld Precision Inc.KWIKMIX
спинальной камеры поставщики

Ссылки

  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  2. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 μm in living brains by use of a Ti: Al 2 O 3 regenerative amplifier. Optics Letters. 28 (12), 1022-1024 (2003).
  3. Kobat, D., Durst, M. E., Nishimura, N., Wong, A. W., Schaffer, C. B., Xu, C. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
  4. Horton, N. G., Kobat, D., Wang, K. In Vivo, Deep Tissue Three-Photon Imaging at the 1700-nm Spectral Window. Biomedical Optics. 7 (3), (2012).
  5. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  6. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
  7. Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature methods. 7 (12), 981-984 (2010).
  8. Misgeld, T., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of the diseased nervous system. Nature Reviews Neuroscience. 7 (6), 449-463 (2006).
  9. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
  10. Kerr, J. N. D., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nature Reviews Neuroscience. 9 (3), 195-205 (2008).
  11. Lichtman, J. W., DENK, W. The Big and the Small: Challenges of Imaging the Brain's Circuits. Science. 334 (6056), 618-623 (2011).
  12. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake, Mobile Mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  13. Wienisch, M., Blauvelt, D. G., Sato, T. F., Murthy, V. N. Two-Photon Imaging of Neural Activity in Awake, Head-Restrained Mice. Neuromethods. 67 (18), 45-60 (2011).
  14. Greenberg, D. S., Houweling, A. R., Kerr, J. N. D. Population imaging of ongoing neuronal activity in the visual cortex of awake rats). Nature Neuroscience. 11 (7), 749-751 (2008).
  15. Thrane, A. S., Thrane, R. V., Zeppenfeld, D., Lou, N., Xu, Q., Nagelhus, E. A., et al. General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (46), 18974-18979 (2012).
  16. Dombeck, D. A., Graziano, M. S., Tank, D. W. Functional Clustering of Neurons in Motor Cortex Determined by Cellular Resolution Imaging in Awake Behaving Mice. Journal Of Neuroscience. 29 (44), 13751-13760 (2009).
  17. Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).
  18. Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nature Medicine. 11 (5), 572-577 (2005).
  19. Ylera, B., Ertürk, A., et al. Chronically CNS-Injured Adult Sensory Neurons Gain Regenerative Competence upon a Lesion of Their Peripheral Axon. Current Biology. 19 (11), 930-936 (2009).
  20. Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F. Quantitative analysis by in vivo imaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (23), 9459(2009).
  21. Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58 (9), 1133-1144 (2010).
  22. Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).
  23. Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. Plos One. 6 (3), 17910(2011).
  24. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nature Communications. 3, 1227(2012).
  25. Dibaj, P., Steffens, H., Zschüntzsch, J., Kirchhoff, F., Schomburg, E. D., Neusch, C. In vivo imaging reveals rapid morphological reactions of astrocytes towards focal lesions in an ALS mouse model. Neuroscience Letters. 497 (2), 148-151 (2011).
  26. Bareyre, F. M., Garzorz, N., Lang, C., Misgeld, T., Buning, H., Kerschensteiner, M. In vivo imaging reveals a phase-specific role of STAT3 during central and peripheral nervous system axon regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (15), 6282-6287 (2011).
  27. Nikic, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nature Medicine. 17 (4), 495-499 (2011).
  28. Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord. Nature Protocols. 2 (2), 263-268 (2007).
  29. Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. 59, 2760(2012).
  30. Farrar, M. J., Bernstein, I. M., Schlafer, D. H., Cleland, T. A., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nature. Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
  31. Fenrich, K. K., Weber, P., Hocine, M., Zalc, M., Rougon, G., Debarbieux, F. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows. The Journal of Physiology. 590 (16), 3665-3675 (2012).
  32. Figley, S. A., et al. A Spinal Cord Window Chamber Model for In Vivo Longitudinal Multimodal Optical and Acoustic Imaging in a Murine Model. Plos One. 8 (3), 58081(2013).
  33. Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G. Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. 82, 50826(2013).
  34. Romanelli, E., Sorbara, C. D., cacute, I. N., Dagkalis, A., Misgeld, T., Kerschensteiner, M. Cellular, subcellular and functional in vivo labeling of the spinal cord using vital dyes. Nature Protocols. 8 (3), 481-490 (2013).

Перепечатки и разрешения

Теги

Имплантация спинальной камерыхирургическая процедурамногофотонная микроскопияфиксация позвонковдорсальная ламинэктомиягерметизация силиконовым эластомеромхронический имиджингпослеоперационный уход
Процедура имплантации спинного палату для продольных В Vivo Визуализация мозга мыши спинного
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.