Изображение на основе проточной цитометрии Методика оценки изменений в Гранулоцита функции In Vitro

Summary

Этот метод демонстрирует технику оценки функции гранулоцитов путем одновременного измерения фагоцитоза бактерий и окислительного взрыва. Проточная цитометрия на основе изображений позволила идентифицировать три различных подмножества активированных гранулоцитов, которые различались по своей относительной функциональной способности.

Abstract

Гранулоциты играют ключевую роль во врожденном иммунном ответе организма на бактериальные и вирусные инфекции. Несмотря на то, что существуют методы измерения функции гранулоцитов, в целом они ограничены с точки зрения информации, которую они могут предоставить. Например, большинство существующих анализов дают просто процент от того, сколько гранулоцитов активируется после одной инкубации фиксированной длины. Ситуация осложняется тем, что большинство анализов сосредоточены только на одном аспекте функции из-за ограничений в технологии обнаружения. В этом отчете продемонстрирована методика одновременного измерения фагоцитоза гранулоцитов бактерий и окислительного взрыва. При одновременном измерении обеих этих функций были идентифицированы три уникальных фенотипа активированных гранулоцитов: 1) Низкая активация (минимальный фагоцитоз, отсутствие окислительного взрыва), 2) Умеренная активация (умеренный фагоцитоз, некоторый окислительный всплеск, но без совместной локализации двух функциональных событий) и 3) Высокая активация (высокий фагоцитоз, высокий окислительный взрыв, ко-локализация фагоцитоза и окислительный взрыв). Также была идентифицирована четвертая популяция, состоящая из инактивированных гранулоцитов. С помощью инкубации по 10, 20 и 40 мин оценивали влияние длительности инкубации на перераспределение фенотипов активированных гранулоцитов. Четвертая инкубация была завершена на льду в качестве контроля. Используя последовательную временную инкубацию, анализ может быть в состоянии определить, как обработка пространственно влияет на функцию гранулоцитов. Все образцы измеряли с помощью проточного цитометра на основе изображения, оснащенного опцией количественной визуализации (QI), автосамплером и несколькими лазерами (488, 642 и 785 нм).

Introduction

Гранулоциты представляют один компонент иммунной системы организма, которая обеспечивает первую линию обороны против вторжения антигенов. Предыдущие способы оценки функции гранулоцитов сосредоточены на способности фагоцитоза или окислительного всплеска с использованием отдельных методов, что делает его трудно установить вместе, как гранулоциты были изменены ^1-4. Достижения в области проточной цитометрии привели в производстве настольных приборов, способных с высокой разрешающей способностью, многоцветной визуализации клеток в высокой пропускной образом ^5. Умение сочетать изображение с традиционной проточной цитометрии представляет собой продвижение, которое обеспечивает технологическую платформу, необходимую для инноваций в рамках существующих проточной цитометрии методов и получить новую информацию о иммунной системы.

За последние десять лет, наша лаборатория, в частности, была остро сфокусировано на влиянии различных рационов питания и упражнений обработок ПаттиRNS по врожденной иммунной функции ^6-9. Метод продемонстрирован в этой рукописи имеет практические последствия в рамках области клинической иммунологии. Данный способ использует возможности на основе изображений проточной цитометрии для одновременного измерения фагоцитоз бактерий частиц и окислительного. Используя этот подход, человек способен отделить активированные гранулоциты, используя переменные, предоставляемые на основе образа части анализа. Эти подмножества были идентифицированы только после оценки клеточные изображения на отдельных гранулоцитов. Кроме того Время анализа Инкубационный повлияло на переход между тремя подмножеств активации ^10. Таким образом, вполне вероятно, что использование нескольких периодов инкубации может позволить способ, чтобы проверить изменение функции гранулоцитов следующей конкретной экспериментальной обработки. Цель этой рукописи было продемонстрировать способ оценки функции гранулоцитов с помощью изображения на основе проточной цитометрии для одновременного измерения фагоцитоз с oxidatIve лопнуть.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры забора крови, описанные в этом методе были проведены в соответствии с Хельсинкской декларацией и одобрены ЕНТ этическим комитетом (IRB) для человека. Все субъекты дали письменное согласие на сбор крови, который был использован в предлагаемом способе для того, чтобы они были, по-видимому здорового, нормального веса тела и болезни свободной.

1. Реагент Источник и подготовка

1. Использование CD66b-APC (клон # G10F5; DF = 1: 50) и CD45-APCeFluor780 (клон # 2D1; DF = 1: 50) для этого анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед исследования, CD45 и CD66b антитела титровали для определения оптимального разведения, которые четко решить гранулоциты (CD45 + / 66b +) от других лейкоцитов (CD45 + / 66b-) ^11. При добавлении разбавленного антитела для окрашивания конечное разведение в трубке был 875.
2. Покупка и оттепель фондовый S. стафилококк bioparticles помечены pHrodo красного красителя. Приостановка в концентрации 1 мг bioparticles на мл в стерильном PBS. Кратные разбавленные bioparticles и магазин замораживали при -20 ° С до использования в анализе.
3. Растворить dihydroethidium (ДНЕ), который превращают в бромид этидия флуоресцентного в присутствии кислорода свободных радикалов (например, окислительный взрыв), в ДМСО до конечной концентрации 10 мкг / мл.
4. Смешайте N-этилмалеимид (используется для предотвращения дополнительного фагоцитоз следующей указанного периода инкубации анализ) со стерильным PBS в 2 стадии разбавления 200 мг / мл и 17,5 мг / мл соответственно. В анализе, используют конечную концентрацию 15 мМ. Когда тает N-этилмалеимид, используйте 37 ° C тепла блока, как N-этилмалеимид не остаются в растворе.
5. После последнего шага фиксации, используйте 7AAD для окрашивания ядерной ДНК. До того, разбавленные акций 7AAD 1:10 стерильным ЗФР.

2. Кровь для сбора проб

1. Спросите предметы, чтобы прибыть в лаборатории после проведения O / N быстро (> 8 ч) и abstentiПО от физической активности (> 12 ч).
2. После очистки кожи с подготовительной площадки алкоголя, вставьте стерильный забора крови иглу в периферической вены руки.
3. Собирают кровь в вакуумированных трубок, которые коммерчески заполненных гепарина натрия.
4. После сбора применить пластырь на руке субъекта.
5. Обратить пробирок для крови, чтобы смешать 10 раз, а затем поместить на качалку до анализа.

3. Фагоцитоз Пробирной Техника

1. Оттепель S.aureus bioparticles (RT), Дхе (RT) и N-этилмалеимид (37 ° C).
2. Добавить 20 л S.aureus bioparticles 4 отдельных 1,2 мл пробирки во время работы в стерильных капот.
3. Добавить 40 л ДНЕ в каждую пробирку, содержащую bioparticles.
4. Осторожно нажмите трубы на поверхности скамьи, чтобы собрать реагенты в нижней части трубы.
5. Добавить 100 мкл смешанного цельной крови в каждую пробирку, которая была наполненной bioparticles и ДНЕ.
6. Протрите внутренний край трубок с ватной палочки, чтобы удалить загрязняющие кровь.
7. Смешайте кровь и реагенты с электронной пипетки, установленной для смешивания крови и реагенты в течение трех циклов после того крови.
8. Поместите пробирки в ведерке со льдом и накрыть для защиты от света.
9. Инкубируйте пробирки в течение 10, 20 и 40 мин. Начнем с 40-минутной трубки, чтобы гарантировать, что все пробирки закончить в то же время.
10. Оттепель N-этилмалеимид в 37 ° C борта ванны.
11. Внесите 15 л N-этилмалеимида (описано выше в 1,4) в каждой пробирке, инкубировать в течение 30-мин.
12. Пипеткой 10 мкл CD66b-АПК и 10 л CD45-APCeFluor780 разбавленные антитела (описанные выше в 1,1), инкубировали в течение 60 мин.
13. Внесите 750 л WBC исправить / РБК лизирующего раствора в каждой пробирке, инкубировать в течение 60-мин.
14. Центрифуга (10 мин при 400 мкг) пробирках для сбора осадка клеток.
15. Вакуумная аспирация WBC лизируют / РБК решение Fix, оставляя остаточный этUID объем (100 л) выше клеточного осадка.
16. Пипеткой 10 мкл разбавленного раствора 7AAD (описанного выше в 1,5) и 50 мкл PBS в каждую тест-пробирку.
17. Добавьте одну каплю калибровки шариков (~ 25 л) с каждой пробирке, место колпачки на пробирках, оберните трубы в фольгу, и место в холодильнике.
18. Загрузите пробирки с образцом в потоке на основе изображений цитометр и собрать минимум 3000 гранулоцитов событий, используя предопределенные параметры: AutoSampler, синий (488 нм, 60 мВт), красный (640 нм, 100 NW), SSC (785 нм; 8,5 мВт) лазера (рисунок 1).

Рисунок 1. Способ сбора и шаблона. Образцы были получены на поток изображений на основе цитометра (А). Во время приобретения, точечные участки светлого поля Aspect Ratio против CD66b-APC были получены в отдельные гранулоцитов из шипами калибровочных бисером USINг INSPIRE v. 100.2.292.0 программное обеспечение (B). Минимум 5000 гранулоцитов были приобретены для каждого образцов с использованием AutoSampler, синий (488 нм, 60 мВт), красный (640 нм; 100 NW), SSC (785 нм; 8,5 мВт) Лазеры. Пожалуйста, обратите внимание, что количество гистограмм присутствуют при приобретении контроля параметров лазерных и других аспектов данных, сбора. Все эти гистограммы являются обязательными и необходимы только при лабораторные стандартные операционные процедуры требуется их контроля качества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

4. Пример сбора и анализа

1. Используйте автоматической компенсации программное обеспечение мастера программного обеспечения ИДЕИ применять компенсационный матрицу к файлам изображений в формате RAW (РИФ) и создать компенсировать распечатанных файлов (CIF).
2. Загрузите отдельные CIF файлов в идеях программного обеспечения и генерировать следующие участки для выявления Гранулоцита подмножества:
Установите начальные ворота для выявления клеток, которые, как считается, быть в центре внимания с использованием гистограммы для ярких градиента поля RMS (Рисунок 2А). Сделать это определение для каждого образца пациента, используя Нестимулированные контроль в качестве эталонного стандарта.
3. Используйте вторичные участки в отдельных синглетного клеток от мусора и дублетов, используя точечную участок светлом поле соотношением сторон экрана (отношением высоты клеток против ширина) против яркой области поля (рис 2б). Сделать это определение для каждого образца пациента, используя Нестимулированные контроль в качестве эталонного стандарта.
4. После того, как чистый популяция клеток были идентифицированы, создать точечный участок CD45 против CD66b (Рисунок 2C), чтобы точно определить гранулоцитов (CD45 + / 66B +). Создать дочь участок (рисунок 3) ярко интенсивности подробном S. стафилококк (ось х) по сравнению с яркой интенсивности подробном окислительного (DHE Y-оси), чтобы определить подмножества активированных гранулоцитов. Сбор BRИзображения летного поля в канале 1 и 9, bioparticles в канале 2, DHE в канале 4, 7AAD в 5-м канале, CD66b в канале 11, и CD45 в канале 12.

Рисунок 2. Анализ шаблона. Эта цифра серии участков, которые создавались для идентификации клеток, которые были в фокусе (A), отдельные клетки (B), гранулоциты (С). Дополнительные участки были использованы для определения трех подмножеств активированных гранулоцитов против неактивных гранулоцитов. Весь анализ приобретенных графических файлов был завершен Используя идеи v.6 программного обеспечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Results

Использование на основе образа проточной цитометрии позволило отделить однородной популяции активированных гранулоцитов в трех различных подмножеств активации (рисунок 3). В этом методе, наиболее эффективным способом решить три подмножества активации путем построения яркий интенсивность деталь для фагоцитоза (золотистого стафилококка) против окислительного (DHE) (Рисунок 3, рисунок 4). Кроме того, использование мастера совместной локализации в идеях программного обеспечения позволит количественного присутствия одновременного фагоцитоза и окислительного, что отличительной чертой признаком высокой активированных гранулоцитов.

Рисунок 3. Определение активированного гранулоцитов подмножеств. После идентификации гранулоцитов с использованием клеточной поверхности маркеры (CD45 + / 66b +), дочь участок был создан с яркой детали Intenплотность фагоцитоза против яркого интенсивности подробно окислительного всплеска. Используя этот подход, процент неактивных (фиолетовый), низкоактивных (красный, A), умеренно-активный (синий, B) и высокоактивных (желтый, C) гранулоциты была определена. Этот метод стробирования был также использован для оценки влияния времени инкубации анализ на относительное обилие различных активированных гранулоцитов подмножеств. Высокий процент "High-Active" гранулоцитов присутствовал после 40 мин инкубации. Весь анализ приобретенных графических файлов был завершен Используя идеи v.6 программного обеспечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

В дополнение к демонстрации присутствия трех отдельных подмножеств активированных гранулоцитов, было показано, что анализ времени инкубации влияние на относительное содержание каждого активированного гранулоцитов подмножества. В частности, 40 мин вклubation привело к величайшей процент "High-Active" гранулоцитов. В том числе по меньшей мере, три опробования инкубации длительности может быть возможно определить, как дано клиническое лечение изменяет временную состояние активации гранулоцитов. Это впервые опубликован метод с использованием изображения на основе проточной цитометрии для идентификации различных активированных гранулоцитов подмножества в зависимости от одновременных измерений фагоцитоза и окислительного всплеска.

Рисунок 4. Типичные изображения клеточных маркеров. Картинку галерея клеток, классифицируемых как высокой активной (А), умеренные-активные (B), и низкой активной (C) представлена ​​на этой фигуре. S.aureus bioparticles в CH03 , окислительный взрыв в CH04, 7AAD для ядра в CH05, сторона разброс в CH06, CD66b вCH11 и CD45 в CH12. Кроме того, отображается колокализуются фоновое изображение фагоцитоза (CH03) в зависимости от окислительного (CH04). Области желтый в фоновое изображение означать, что фагоцитоз и окислительный взрыв происходят в одной и той же анатомической пространства, в то же время. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Discussion

Данный способ представляет собой уточнение существующих методов оценки функции гранулоцитов с помощью проточной цитометрии ^1,3,4,12-14. Критические шаги этого анализа, как правило, связаны с надлежащего смешивания образца крови с bioparticles и ДНЕ. Неполное перемешивание приведет к неточным результатам. В то время как полное смешивание важно, способ смешивания должно быть нежным в природе. Предполагается, что перемешивание быть достигнуто с использованием электронного пипетки с функцией смешивания, а не вихревом смесителе. Еще одним важным шагом в анализе, чтобы всегда гарантировать, что нет никакого анализа крови загрязняют верхнюю половину пробирке. Этот остаточный крови может быть удалена с использованием стерильного хлопка наконечником аппликатора. Полное удаление важно, потому что неспособность сделать это может привести к загрязнению конечного препарата анализа с ООН-лизируют эритроциты.

До Используя этот метод надлежащего контроля компенсации должны быть добавлены для контроля SPectral перекрытие между реагентов, используемых для идентификации различных аспектов функции гранулоцитов. Для этого метода, управления компенсации включают сбор образцов крови, которые были предложены в 40 мин анализа инкубации, а затем маркировки с помощью одного маркера (т.е., кишечная палочка, DHE, и т.д.). После маркировки, единственным положительным события собраны и компенсации матрица генерируется с использованием автоматизированной мастер в программное обеспечение для анализа идей. Очень важно, чтобы при использовании этого анализа соответствующие средства контроля компенсации будут завершены, чтобы обеспечить надлежащее исполнение анализа.

Анализ осуществляется с помощью функции поисковое устройство и совместной локализации мастера, чтобы определить, что яркая интенсивность деталь лучше переменная отделить населения, а также определить, как существует много совпадений между окислительного и фагоцитоза сигналов. В частности, использование изображений на основе цитометрии при условии, способность отделить активированные гранулоциты на три подмножества. Tего подмножество пробоя определяется с использованием ярких интенсивность подробно фагоцитоза против окислительного. В дополнение к Рассматривая эти особые функции клеток, были выявлены клетки, которые выставлены оба события, в то же время в том же анатомического расположения (совместной локализации). Гранулоциты, которые упали в "высокоактивных" подмножества были только фенотип, что демонстрирует стабильный совместной локализации между фагоцитоза и окислительного всплеска. Это отождествление активированных гранулоцитов подмножеств большая область, где поиск и устранение неисправностей необходимо. Это очень важно для нового пользователя, чтобы занять время, чтобы понять рабочий процесс процесса образец в идеях и понять механику стробирования клеточной популяции с помощью компонента изображения. Другие модификации, которые пользователь может запросить, чтобы включать в себя выбор альтернативных или дополнительных раза анализа инкубации. В настоящее время метод предполагает использование длительности 10-40 мин; Однако, в зависимости от экспериментальной модели, где этот методдля использования, это может быть необходимо, чтобы выбрать больше опробования длительности. Такая модификация должны быть оценены на индивидуальной основе.

Кроме того было установлено, что продолжительность инкубации анализа оказывает существенное влияние на внешний вид трех активированных подмножеств. Подход, описанный в настоящем докладе, представляет собой продолжение того, что информация может быть получена ранее в отношении гранулоцитов функции ^3,4,13,15. Другие лаборатории продемонстрировали важность оценки изменения в функции гранулоцитов в рамках комплексной оценки иммунитета и болезни ^15-17. Несмотря на потенциал этого анализа не без ограничений. Одним из главных ограничений является стоимость и время спроса, связанного с высоким образца обработки пропускной способности. Когда Дизайн исследования требует большого количества образцов в данный день, это может быть трудно обрабатывать. Обработка упорядочить с помощью электронных пипец, и фармацевтов,но они, как правило, дорогие и не всегда доступны в каждой лаборатории.

Наша область исследований фокусируется на исследовании того, как физические упражнения и диетические привычки влияют на здоровье иммунной системы и функции ^{6,8-10,18-20.} Такие цели имеют значительные практические последствия для самых различных областей человеческого здоровья. Помимо изучения упражнений и питания эффектов метод фагоцитоз показано в этой рукописи могут быть полезны и в других областях клинической иммунологии, где мониторинг функции фагоцитоза имеет решающее значение для результатов лечения. Настоящий анализ является первым из многих, что иммунологические анализы с потенциалом, чтобы быть повторно изобретен воспользоваться преимуществами уникальной информации изображающего, что может быть может из потока на основе образа цитометра.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vacutainers	BD Life Sciences		используется для забора крови
WBC Fixative / RBC Lysis solution	eBioscience	00-5333-57
CD66b-APC	eBioscience	клон G10F5
CD45-APCeFluor780	eBioscience	клон 2D1
S. aureus биочастицы	Life Technologies	A10010
дигидроэтидий	Sigma-Aldrich	D7008
N-этилмалемид	Sigma-Aldrich	4259
7AAD	EMD Многопоровый
гематологический анализатор	Mindray	BC-3200
96-канальный пипетка	Integra Biosciences	ViaFlo
Bead Bath Incubator	LabArmour	BeadBath
Imaging Flow Cytometer	EMD Millipore	Amnis FlowSight
INSPIRE Программное обеспечение	EMD Millipore	Amnis INSPIRE
IDEAS Программное обеспечение	EMD Millipore	Amnis IDEAS
X-Pierce Piercable Plate Sealer	Excel Scientific, Inc.	X-Pierce
Прецизионная рабочая станция Dell	Компьютеры Dell Различные		используемые для анализа IDEAS